趙小凱，竹俊蘭，嚴(yán)浩，王慧利

（溫州醫(yī)學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院，浙江 溫州 325035)

·綜 述·

細(xì)菌sRNA功能、預(yù)測及鑒定方法的研究進(jìn)展

趙小凱，竹俊蘭，嚴(yán)浩，王慧利

（溫州醫(yī)學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院，浙江 溫州 325035)

細(xì)菌；sRNA；轉(zhuǎn)錄調(diào)控；生物信息學(xué)；綜述文獻(xiàn)

生物體中除了mRNA、tRNA、rRNA三種我們熟知的RNA外，還存在大量的非編碼RNA（non-coding RNA）。它們隱藏于基因組內(nèi)的信息層，有學(xué)者稱之為基因組內(nèi)“暗物質(zhì)”，不可見卻執(zhí)行著新層次調(diào)控基因表達(dá)的功能[1]。研究者在對非編碼RNA的研究中發(fā)現(xiàn)了大量具有轉(zhuǎn)錄后調(diào)控功能的非編碼小RNA，如MicroRNAs（miRNAs）、Small interfering RNAs（siRNAs）、Piwi-interacting RNAs（piRNAs）、ScanRNAs（scnRNAs）等。其中，長度40至500個核苷酸的非編碼RNA通常定義為small RNA（sRNA)。sRNA廣泛存在于細(xì)菌、古生菌和真核生物體內(nèi)。起初，sRNA的研究主要集中在真核生物中，近些年才漸漸把注意力集中到原核生物，尤其是病原細(xì)菌。事實上，早在1967年，就有研究者通過對大腸桿菌體內(nèi)所有的RNA進(jìn)行標(biāo)記，在聚丙烯酰胺凝膠上探測到細(xì)菌的第一個sRNA——6SRNA[2]。

sRNA大部分位于兩編碼基因的間隔區(qū)域（IGR），小部分位于3’UTR或5’UTR。通過運用多種實驗方法和生物信息學(xué)方法發(fā)現(xiàn)，sRNA除了分布于核心基因組，有些sRNA甚至分布于插入序列、質(zhì)粒、噬菌體和致病島上。日前，在大腸桿菌基因組就已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了約80個sRNA，且大部分在相近的致病菌中是保守的。sRNA半衰期短，通常一種sRNA有多個靶基因或靶位點，可更精確、迅速地調(diào)控多種基因的表達(dá)，具有比蛋白質(zhì)調(diào)控更多的優(yōu)勢。所以，生物體內(nèi)的sRNA的鑒定及其調(diào)控機制的研究成為當(dāng)今生物領(lǐng)域新的研究熱點?，F(xiàn)就細(xì)菌sRNA的功能，與其伴侶分子Hfq的關(guān)系，預(yù)測和實驗驗證方法的進(jìn)展作一綜述。

1 細(xì)菌sRNA的功能

細(xì)菌sRNA能與靶基因互補配對，并主要通過與mRNA翻譯區(qū)結(jié)合影響mRNA的穩(wěn)定性或者與mRNA的3’UTR結(jié)合調(diào)控mRNA的翻譯來調(diào)控靶基因的表達(dá)和蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性。研究表明，sRNA能通過上述轉(zhuǎn)錄后調(diào)控方式參與多種生物學(xué)過程，如對環(huán)境的應(yīng)答、物質(zhì)代謝、蛋白質(zhì)的合成、致病性等。

1.1 調(diào)控RpoS蛋白（RNA聚合酶的σ亞基）的sRNA細(xì)菌轉(zhuǎn)錄因子σ（RNA聚合酶的σ亞基）的編碼基因rpoS，當(dāng)遇到生存壓力如溫度、饑餓、滲透壓及pH的變化時，可轉(zhuǎn)錄大量應(yīng)答基因，作出應(yīng)激反應(yīng)，適應(yīng)環(huán)境變化。研究發(fā)現(xiàn)一些sRNA能與靶mRNA rpoS堿基配對，在翻譯水平上調(diào)節(jié)其表達(dá)，從而在對環(huán)境的應(yīng)答反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用。目前研究發(fā)現(xiàn)有4種sRNA：OxyS、DsrA、RprA、ArcZ參與rpoS的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控過程。DsrA、RprA和ArcZ能夠激活RpoS蛋白的翻譯，而OxyS則抑制其表達(dá)。

在環(huán)境壓力下，如在低溫時，DsrA通過干擾5’UTR的抑制子二級結(jié)構(gòu)來激活RpoS蛋白的翻譯，以適應(yīng)環(huán)境，DEAD-box作為輔助因子[3]。DsrA還能保護rpoS，防止其被RNase E降解[4]。在病原菌沙雷菌屬中，RprA通過正向調(diào)節(jié)rpoS翻譯的方式來調(diào)節(jié)抗生素——碳青霉烯的產(chǎn)生[5]。研究還發(fā)現(xiàn)在缺乏DsrA、RprA時，rpoS很不穩(wěn)定，DsrA、RprA的高表達(dá)能增加RpoS蛋白的積累和半衰期。ArcZ是利用特異的sRNA文庫檢測rpoS翻譯調(diào)節(jié)時發(fā)現(xiàn)的第四種sRNA[6]。和DsrA和RprA一樣，ArcZ能與rpoS堿基配對，解開其5’UTR的莖環(huán)結(jié)構(gòu)，激活RpoS蛋白的翻譯，從而對惡劣的環(huán)境作出應(yīng)答反應(yīng)。相反，OxyS則作為負(fù)調(diào)控子，有文獻(xiàn)[7]報道其能抑制RpoS蛋白的合成，應(yīng)答環(huán)境低氧信號。

1.2 調(diào)控需鐵蛋白的sRNA鐵是細(xì)菌代謝的最重要金屬之一，在胞內(nèi)的許多酶促反應(yīng)里起著輔助因子的作用。鐵饑餓是影響細(xì)菌感染能力的主要因素之一。許多細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)，轉(zhuǎn)錄抑制子鐵吸收調(diào)節(jié)子（ferric uptake regulator，簡稱Fur)，能正向調(diào)節(jié)一些參與儲存鐵的基因，控制胞內(nèi)鐵穩(wěn)態(tài)?，F(xiàn)今已有很多文獻(xiàn)報道稱，sRNA能調(diào)節(jié)Fur，在減緩細(xì)菌的鐵饑餓中起著重要作用。如最近在淋球菌中發(fā)現(xiàn)的sRNA——nrrF，對其轉(zhuǎn)錄本分析發(fā)現(xiàn)，它能轉(zhuǎn)錄后抑制編碼含鐵-硫中心的黃素蛋白-琥珀酸脫氫酶的sdhA和sdhC基因的表達(dá)[8]。與大腸桿菌的RyhB通過與RNase E形成降解復(fù)合體對sodB、sdhC等mRNA降解機制相似，通過減少需鐵蛋白，使細(xì)胞內(nèi)的鐵離子重新分配，從而保持細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)部的鐵穩(wěn)態(tài)。

接著，研究者又在枯草芽孢桿菌中發(fā)現(xiàn)了相似功能的sRNA——FsrA，F(xiàn)srA能與三種蛋白FbpA、FbpB和FbpC共同作用，抑制包括三羧酸循環(huán)在內(nèi)的烏頭酸酶和琥珀酸脫氫酶以及含鐵硫簇的谷氨酸合酶等含鐵蛋白的合成[9]。此外，近期通過生物信息學(xué)手段，從假單胞菌中發(fā)現(xiàn)了RyhB的同源基因PrrF[10]，同樣具有調(diào)控鐵代謝的功能。

1.3 調(diào)控OMPs等外膜蛋白的sRNA革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞壁的外膜攜帶有多種高免疫原性的外膜蛋白（OMPs）。研究發(fā)現(xiàn)，sRNA還可抑制革蘭氏陰性菌細(xì)胞表面蛋白OMPs的合成。在腸道菌中已發(fā)現(xiàn)InvR、MicA、MicC、MicF、RybB等十余種sRNA可調(diào)節(jié)mRNA omp的表達(dá)。

我們已經(jīng)知道在大腸桿菌和沙門氏菌中存在著受外膜壓力因子σE誘導(dǎo)的sRNA——RybB。 RybB可與靶標(biāo)mRNA omp的5’UTR或編碼區(qū)發(fā)生不完全堿基配對，抑制多種OMPs的合成[11]。此外，沙門菌中依賴Hfq的sRNA MicC可調(diào)節(jié)主要外膜蛋白OmpD的合成[12]。最近在沙門菌中又發(fā)現(xiàn)一種新sRNA SdsR，先前在大腸桿菌中稱作RyeB，是最豐富的靜止期特異性sRNA。研究發(fā)現(xiàn)SdsR是繼InvR、MicC和RybB 后第四個能下調(diào)沙門菌的外膜孔蛋白OmpD合成的sRNA。通過3’RACE發(fā)現(xiàn)SdsR很有可能識別OmpD起始密碼子的下游，從而配對發(fā)揮轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)作用[13]。同樣在腸道菌，有研究者通過點突變發(fā)現(xiàn)，sRNA MicM能通過反義機制，隔絕ybfM的核糖體結(jié)合位點，從而沉默細(xì)胞表面蛋白YbfM[14]。此外，在其他腸道細(xì)菌也存在可以調(diào)控外膜蛋白合成的sRNA，如霍亂弧菌中的VrrA、志賀氏菌中的RnaG等。

1.4 調(diào)控生物膜形成的sRNA轉(zhuǎn)錄因子CsgD 通過掌控curli菌毛和纖維素的產(chǎn)生而決定大腸桿菌是否能形成生物膜。最近報道發(fā)現(xiàn)CsgD的mRNA是sRNA介導(dǎo)的信號整合的中樞[15]。

研究發(fā)現(xiàn)McaS、RprA和GcvB三種sRNA能調(diào)節(jié)csgD基因翻譯。McaS是一個95 nt的sRNA，它通過三個不相連的單鏈區(qū)域來調(diào)節(jié)與生物膜形成相關(guān)的靶mRNA。例如，McaS能激活最主要的鞭毛合成轉(zhuǎn)錄因子flhD蛋白。同時，McaS還能調(diào)節(jié)一種與多聚糖β-1，6-N-乙?；?D-葡糖胺的出膜相關(guān)的膜孔蛋白pgaA。研究還發(fā)現(xiàn)高濃度的McaS能促進(jìn)生物膜的形成，而缺乏McaS的菌株出現(xiàn)不完整的生物膜[16]。通過廣泛的突變分析發(fā)現(xiàn)，RprA能直接結(jié)合csgD的5’ UTR和翻譯起始位點，和McaS一樣抑制csgD的翻譯[17]，GcvD也一樣。

此外，在其他細(xì)菌中也發(fā)現(xiàn)sRNA如銅綠假單胞菌中的SagS[18]，腸炎沙門菌的MicA[19]等多種sRNA通過調(diào)控相關(guān)蛋白而影響生物膜的形成。

1.5 調(diào)控毒力蛋白的sRNA毒力的產(chǎn)生由一系列毒力基因介導(dǎo)，這些基因除少數(shù)存在于質(zhì)粒外，大多數(shù)存在于染色體上。以往的研究表明，sRNA能通過調(diào)節(jié)毒力相關(guān)的靶標(biāo)基因的表達(dá)，從而調(diào)控病原菌對宿主的侵襲力、在巨噬細(xì)胞中的存活力、對宿主細(xì)胞的黏附力以及毒力蛋白的分泌。

沙門菌編碼SPI-1效應(yīng)器的SopA蛋白和SPI-1蛋白的主要調(diào)節(jié)蛋白HilE，兩者都是沙門菌的侵染所需的主要毒力因子。研究發(fā)現(xiàn)沙門菌致病島基因編碼的sRNA——IsrM， 能與這兩個蛋白的mRNA相互作用，從而在沙門氏菌侵入上皮細(xì)胞、在巨噬細(xì)胞內(nèi)復(fù)制及在小鼠體內(nèi)的毒力與復(fù)制中發(fā)揮著關(guān)鍵作用[20]。

內(nèi)膜蛋白MgtC，存在于多種致病菌中，是病原菌對小鼠的毒力及其在巨噬細(xì)胞中存活所必需的。研究發(fā)現(xiàn)沙門菌中順式編碼的反義sRNA AmgR可與mgtC部分序列堿基互補從而抑制其表達(dá)[21]。此外，在蘇云金芽胞桿菌中發(fā)現(xiàn)一些對芽孢形成、殺蟲晶體蛋白表達(dá)起分子調(diào)控的sRNA。還有很多文獻(xiàn)報道sRNA能調(diào)控毒力蛋白mRNA的翻譯。如金黃色葡萄球菌中RNAIII，鼠傷寒沙門氏菌IsrJ，嗜肺軍團桿菌RsmY和RsmZd等。

1.6 調(diào)控其他功能的sRNA大腸桿菌的碳儲存調(diào)節(jié)者（carbon storage regulation，簡稱Csr），是主要包含CsrB、CsrC兩種sRNA、RNA結(jié)合蛋白CsrA和蛋白CsrD的調(diào)節(jié)系統(tǒng)。研究發(fā)現(xiàn)，CsrA能通過結(jié)合多種靶mRNA抑制糖異生和糖原代謝等過程，而CsrB、CsrC能阻止CsrA與其靶mRNA的相互結(jié)合[22]。借助生物信息學(xué)對假單胞菌基因間區(qū)域O1分析發(fā)現(xiàn)了一個sRNA——NalA，且PAO1區(qū)硝酸鹽同化作用操縱子的表達(dá)需要這個sRNA[23]。在過氧化物壓力下，大腸桿菌的sRNA RybA能調(diào)節(jié)芳香族氨基酸的生物合成的主要基因TyrR，參與芳香族化合物包括芳香族氨基酸的代謝的上調(diào)[24]。變異鏈球菌存在一種sRNA L10-Leader，通過生物信息學(xué)預(yù)測它的靶mRNA，發(fā)現(xiàn)有5種mRNA，這5種mRNA都參與鏈球菌的生長和應(yīng)激反應(yīng)。定量反轉(zhuǎn)錄發(fā)現(xiàn)，在不同生長環(huán)境中mRNA的表達(dá)水平與L10-Leader的濃度水平密切相關(guān)[25]。

此外，sRNA還有如DicF參與染色體復(fù)制和細(xì)胞分化[26]、RNAI質(zhì)粒拷貝數(shù)控制[27]以及ncrMT1302參與cAMP代謝[28]等多種功能。這里不再一一介紹。

2 sRNA與其伴侶分子Hfq

Hfq（host factor for Qβ replicase）是細(xì)菌轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)子，是一類豐富的高度保守的Lsm/Sm家族剪接蛋白，具有RNA分子伴侶活性。Hfq最初是作為大腸桿菌RNA噬菌體QB復(fù)制所需要的宿主因子被發(fā)現(xiàn)的。細(xì)胞電鏡影像顯示Hfq蛋白定位細(xì)菌的細(xì)胞膜附近。至今為止發(fā)現(xiàn)Hfq參與許多由sRNA介導(dǎo)的功能調(diào)控，在體內(nèi)能結(jié)合并穩(wěn)定sRNA，能促進(jìn)sRNA與靶mRNA的堿基配對，從而調(diào)節(jié)mRNA的轉(zhuǎn)錄。上面介紹的sRNA功能幾乎都有Hfq的參與。而且Hfq的缺失將引起相關(guān)表型的改變。如生長速度減慢，細(xì)胞增大，對紫外光敏感度增加等。

最近的研究集中在Hfq結(jié)合RNA的機制方面。我們已經(jīng)知道Hfq是通過形成六聚體環(huán)形式結(jié)合RNA的，且Hfq既能結(jié)合sRNA，又能結(jié)合mRNA。sRNA的PolyU尾巴對于Hfq的功能發(fā)揮是必需的[29]，此外最近研究還發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過突變和生化分析，大腸桿菌SgrS的內(nèi)部發(fā)夾結(jié)構(gòu)和上游的U富集序列對于Hfq的有效結(jié)合也是必需的[30]。Hfq的結(jié)合還與細(xì)菌基因組的CG含量和經(jīng)實驗驗證sRNA與mRNA配對的自由能也存在顯著的關(guān)系。

在正常的條件下，Hfq會限制sRNA的功能，大量sRNA競爭Hfq的結(jié)合位點，一些相對較少的sRNA會缺失與Hfq的結(jié)合，導(dǎo)致其轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)基因表達(dá)功能活性的降低[31]。同時，sRNA也能影響Hfq。通過體外重組實驗，在野生型細(xì)胞中體外提取得到Hfq多聚體與RyhB的融合體，但在RelA突變的細(xì)胞內(nèi)沒有。結(jié)果顯示RelA能促進(jìn)Hfq單體形成多聚體，進(jìn)而促進(jìn)其結(jié)合RyhB及其他sRNA[32]。

并不是所有細(xì)菌都含有Hfq蛋白，研究發(fā)現(xiàn)在螺旋菌中缺少RNA伴侶蛋白Hfq的同源蛋白。通過與sRNA的親和層析和免疫共沉淀發(fā)現(xiàn)，核糖體蛋白S1和一種未知功能的蛋白HP1334與sRNA有相互作用[33]。

3 sRNA的預(yù)測方法

目前，基因組學(xué)研究正從結(jié)構(gòu)基因組（structural genomics）向功能基因組（functional genomics）邁進(jìn)，高通量深度測序（Deep parallel sequencing）技術(shù)（如454、Solexa和Solid等）也日臻完善，這為挖掘更多的sRNA提供了可能。如通過454焦磷酸測序發(fā)現(xiàn)紅桿菌存在大量的sRNA[34]； 對灰色鏈球菌的Solid全基因組測序，也發(fā)現(xiàn)了大量的干擾RNA[35]。而Solexa主要用于病毒sRNA的預(yù)測。 sRNA的預(yù)測方法也隨著生物信息學(xué)的發(fā)展，從原先的克隆測序、標(biāo)記染色進(jìn)化到如今的生物信息學(xué)預(yù)測、生物芯片（Microarray）等方法。利用生物信息學(xué)方法，包括同源搜索、比較基因組預(yù)測、利用序列和結(jié)構(gòu)特征分析（如RNA的二級結(jié)構(gòu)）預(yù)測不同物種基因組或EST序列庫中存在的sRNA成為現(xiàn)今廣泛應(yīng)用的方法。而生物信息學(xué)的方法不考慮sRNA的表達(dá)情況，基于IGR的保守性、RNA結(jié)構(gòu)保守性和機器學(xué)習(xí)算法（machine-learning approach）預(yù)測sRNA，然后用Northern blots、RT-PCR、RNomics和RACE驗證。但是生物信息學(xué)方法卻會漏掉物種特有（不保守的）、較長轉(zhuǎn)錄以及位于ORF反鏈的sRNA。因此，理想的方法是運用生物信息學(xué)方法和高通量的測序方法相結(jié)合來發(fā)現(xiàn)新的sRNA，并根據(jù)新sRNA的特征，發(fā)展新算法，提高sRNA的預(yù)測效率。

計算機預(yù)測一直獲得人們的親睞，2011年劉倩等[36]報道了一種基于轉(zhuǎn)錄終點序列特征預(yù)測大腸桿菌sRNA的方法。該方法介紹了一個基于已知細(xì)菌sRNA轉(zhuǎn)錄終點的堿基頻率矩陣來識別sRNA的預(yù)測策略，并在大腸桿菌K.12 MG1655中進(jìn)行了sRNA的預(yù)測確證，并表明該模型在獨立測試中具有較高的特異性和陽性檢出率。國外Sridhar等[37]利用計算機軟件sRNA scanner對已全基因組測序的S.Typhimurium LT2的基因間sRNA檢測，發(fā)現(xiàn)118個潛在的sRNA，最后通過Northern印跡和5’RACE分析，確定了6種sRNA。

此外，sRNA常常以一種與Hfq結(jié)合為復(fù)合物的方式存在。可能這些sRNA只有與Hfq結(jié)合才具有活性，或是只有結(jié)合在一起才能修飾和調(diào)節(jié)目標(biāo)蛋白。因此，可以利用Hfq的抗體免疫共沉淀方法或sRNA與Hfq結(jié)合原理的基因組SELEX方法，來尋找細(xì)菌中新的結(jié)合Hfq的sRNA。

4 細(xì)菌sRNA的實驗驗證

目前對預(yù)測得到的sRNA進(jìn)行實驗驗證主要有兩種方法，Northern印跡和熒光定量PCR（fluorescent quantitative PCR， FQ-PCR）。Northern印跡/PAGE是獲得小RNA表達(dá)證據(jù)的通用關(guān)鍵技術(shù)，也是在無擴增時定量測量sRNA的標(biāo)準(zhǔn)方法。目前大多數(shù)研究者將Northern印跡作為鑒定sRNA的金標(biāo)準(zhǔn)。最近報道根癌土壤桿菌中就是通過Northern印記從228個sRNA中驗證到了22個sRNA分子[38]。然而，Northern印跡的最大缺點是對樣品的需求量較高，需要微克級樣品才能避免假陰性。而sRNA樣品往往難以獲得，其原因主要是sRNA在細(xì)菌中含量少、容易降解、制備sRNA樣品價格也非常昂貴。

FQ-PCR也可用于鑒定sRNA分子。與Northern印跡方法相比，F(xiàn)Q-PCR方法雖然可以高度靈敏地檢測出低豐度表達(dá)的sRNA分子，但同樣容易受到污染而出現(xiàn)假陽性。目前有多種FQ-PCR方法來鑒定sRNA，包括莖環(huán)引物熒光定量逆轉(zhuǎn)錄PCR；快速擴增cDNA 3’-末端的熒光定量逆轉(zhuǎn)錄PCR等。

此外，通過RNomics方法（即鳥槍克隆法），建立小轉(zhuǎn)錄本（40～500 nt）cDNA文庫，通過雜交去除rRNA和tRNA，然后測序；用高密度寡核苷酸探針對sRNA進(jìn)行探測，并且已成功運用于E.coli、P.Aeruginosa等基因組sRNA的確認(rèn)鑒定。

5’-RACE和3’-RACE常和Northern印跡一起用于sRNA的驗證。如Chen等[39]驗證大腸桿菌內(nèi)存在一種新的sRNA——Esre。

隨著新一代測序技術(shù)的發(fā)展，不僅可為我們提供全局的sRNA表達(dá)譜，而且能夠發(fā)現(xiàn)sRNA的長度變化以及酶修飾（如RNA編輯）。但是在生物體內(nèi)低豐度表達(dá)、特定條件表達(dá)的sRNA仍然很難通過實驗的方法檢測到。

5 研究展望

隨著基因組學(xué)和生物信息學(xué)的迅速發(fā)展以及對RNA分子特性研究的深入，將會發(fā)現(xiàn)越來越多的細(xì)菌sRNA分子。迄今發(fā)現(xiàn)的細(xì)菌sRNA數(shù)目雖然已經(jīng)很多，但目前只有很少部分sRNA功能已通過實驗確定，新非編碼RNA的發(fā)現(xiàn)還有很大的發(fā)掘空間，并且已發(fā)現(xiàn)的大部分非編碼RNA的生理功能尚不清楚。因此，對非編碼RNA的功能研究方法需要越來越完善。而且sRNA生物功能的多樣性，在病原菌的毒力、代謝等環(huán)節(jié)都起著至關(guān)重要的作用，也許將來能成為疾病控制的新靶點。另外，在最古老的原核生物藍(lán)細(xì)菌中sRNA的調(diào)控機制研究的還比較少，至于sRNA的遺傳進(jìn)化機制與生物的演化關(guān)系如何，sRNA的功能與環(huán)境脅迫是否存在因果關(guān)系，也有待于進(jìn)一步探討。

再者，盡管sRNA篩選和鑒定的方法（如遺傳學(xué)方法、免疫共沉淀法、基因芯片、基因和質(zhì)粒翻譯融合及生物信息學(xué)等）已比較成熟，但是這些方法也有各自的特點和局限性。所以我們應(yīng)根據(jù)所研究的sRNA的特點采取合適的方法，或聯(lián)合應(yīng)用多種方法來避免各種方法的弊端，同時我們期待建立更好的篩選和鑒定sRNA的方法。

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（本文編輯：吳健敏）

Q3

C

1000-2138（2012）05-0503-05

2012-06-15

國家自然科學(xué)基金資助項目（31071115，31270548）；浙江省科技廳公益項目（2011C23114）。

趙小凱（1990-），男，浙江嘉興人，碩士生。

王慧利，博士，副教授，Email：whuili@163.com。