張里程 綜述，唐佩福 審校

骨折后早期血腫與骨折愈合機制研究進展

張里程 綜述，唐佩福 審校

骨折愈合;血腫;免疫細胞;細胞因子

骨折愈合是一個涉及多種細胞及細胞因子協(xié)同作用的復雜過程［1］，根據(jù)組織學特點分為炎性反應期、軟骨痂形成期、硬骨痂形成期及骨痂重塑期。骨折后早期血腫標志炎性反應期開始，其內(nèi)含多種免疫細胞、骨髓基質(zhì)細胞及相關(guān)細胞因子，對于骨折愈合至關(guān)重要［2－5］。研究表明清除骨折后血腫將導致骨折延遲愈合或不愈合，而皮下輸注骨折后血腫則具有成骨作用［3，4］。盡管血腫對于骨折愈合的重要性不言而喻，但其詳細調(diào)節(jié)機制目前仍不清晰。因此，深入解析血腫及其內(nèi)細胞、細胞因子體液成分在骨折愈合中的作用，對促進骨折愈合、防止延遲愈合或不愈合等并發(fā)癥有重要意義。筆者就骨折后早期血腫內(nèi)各種組分與骨折愈合關(guān)系及相關(guān)機制研究進展進行綜述。

1 骨折后早期血腫的意義

骨折發(fā)生時，不但骨、骨膜及周圍軟組織結(jié)構(gòu)被破壞，同時還損傷骨折處血管造成出血，導致富含外周血細胞、免疫細胞及干細胞的血腫形成。盡管早在20世紀初，組織學研究證明了骨折后血腫對于保障骨折愈合的重要性，然而在臨床工作中常常忽視其存在。在治療開放骨折時，為減少感染風險，通常采取反復灌洗和清創(chuàng);甚至閉合骨折也鮮有考慮血腫有骨折愈合作用，血腫常被清除。動物實驗證實，骨折后第2天及第4天時清除骨折血腫或者骨折后第1天及第2天進行徹底清創(chuàng)將導致骨折延遲愈合或者不愈合，并且研究還發(fā)現(xiàn)，骨折后血腫誘導成骨能力隨著時間延長而增強，骨折后第2天血腫僅能在鄰近骨膜的協(xié)助下產(chǎn)生成骨作用，而骨折后第4天血腫輸注到肌肉組織中具有直接成骨作用［2，3］。上述研究提示骨折后第2天血腫內(nèi)含有的成骨細胞因子，可能是其促進骨膜成骨原因，這一點也通過骨折后血腫上清液的骨誘導實驗得以證實［6，7］;而骨折后第4天血腫內(nèi)不僅含有細胞因子，而且含有成骨潛能干細胞;這一點在Oe等［8，9］研究中得到直接證實，研究者在成熟血腫內(nèi)分離出具有多分化潛能的間充質(zhì)干細胞，并且在特異性細胞分化誘導因子作用下，定向分化為成骨及成軟骨細胞。該研究結(jié)果也提示在較成熟的血腫期，骨折愈合過程已經(jīng)啟動，并且發(fā)揮著重要作用。

2 血腫內(nèi)細胞成分與骨折愈合

2.1 免疫細胞成分與骨折愈合 早在20世紀70年代，研究者就發(fā)現(xiàn)外周血白細胞培養(yǎng)液能調(diào)節(jié)破骨細胞吸收活性，提示骨骼系統(tǒng)與免疫系統(tǒng)存在聯(lián)系。隨后越來越多研究證實，骨細胞與免疫細胞都起源于骨髓，從起始、成熟到活化，存在許多共同調(diào)節(jié)因子、受體及信號轉(zhuǎn)導通路，而且巨噬細胞和破骨細胞來源于同一祖細胞，由此人們更加確信骨細胞與免疫細胞之間聯(lián)系，并提出了骨免疫學概念［10］。研究證明骨細胞與免疫細胞之間存在復雜的調(diào)控關(guān)系網(wǎng):其中T細胞對破骨細胞調(diào)節(jié)呈雙向性，比如激活的T細胞通過表達RANKL促進破骨細胞形成［6］，輔助性T細胞Th17細胞通過表達 IL －17 刺激破骨細胞分化［11］，另外，CD4+、CD25+、Foxp3+T細胞還可以通過分泌 TGF－b、IL－4、IL－10抑制破骨細胞形成［12］。T細胞分泌的細胞因子同樣調(diào)節(jié)成骨細胞分化及功能，比如IL－4對成骨細胞具有趨化作用，而分泌的IFN－γ同樣具有誘導成骨的作用［12，13］。因此，免疫系統(tǒng)及免疫細胞與骨代謝調(diào)節(jié)密不可分。

從免疫學觀點來看，骨折后血腫形成預示著炎性反應的開始，而適當?shù)难仔苑磻獙钦塾现陵P(guān)重要［14，15］。研究發(fā)現(xiàn)，創(chuàng)傷過程會給免疫系統(tǒng)帶來影響，骨折后早期(1～4 h)血腫內(nèi)細胞成分就會發(fā)生改變，尤其是免疫細胞成分開始增加［7］。在骨折后血腫起始階段(24 h)，大量中性粒細胞趨化至損傷區(qū)域，以其強大的噬菌能力，成為預防感染的保障!實驗表明這一時期血腫內(nèi)粒細胞/單核細胞對淋巴細胞的比值能達到外周血中兩倍［7］。在血腫形成的48～96 h，迎來巨噬細胞遷徙的高峰，這一細胞組分對骨折愈合非常重要，除了能吞噬消化組織細胞碎片外，同時還能分泌多種細胞因子，包括 TNF －a、IL－1、IL－6、IL －8、IL －12、TGF －b、血小板源性生長因子、胰島素樣生長因子－1等，刺激成纖維細胞增殖分化、膠原蛋白及血管生成［16］。而且研究證實，巨噬細胞剔除將導致組織愈合延遲，而補充巨噬細胞則能促進膠原合成及組織修復［17］。

與巨噬細胞類似，剔除全部T淋巴細胞也會抑制組織愈合［18］。此外研究發(fā)現(xiàn)，細胞毒性T淋巴細胞對骨折愈合具有負性調(diào)節(jié)作用，在骨折正常愈合時，血腫內(nèi)細胞毒性T淋巴細胞成分持續(xù)下降，60 h達到最低值;而在骨折延遲愈合的血腫內(nèi)，細胞毒性T淋巴細胞比例增高明顯［19］。而輔助性T淋巴細胞對骨折愈合具有促進作用，在骨折初期(24～60 h)的血腫內(nèi)比例增高明顯［20］。因此，對T淋巴細胞選擇性剔除也會得到不同的結(jié)果:比如選擇性剔除CD8+T淋巴細胞(其主要功能亞群是細胞毒性T細胞)能促進組織愈合，但單獨剔除活化的CD4+T淋巴細胞(輔助性T淋巴細胞)則導致愈合的延遲［16，21］。

2.2 干細胞成分與骨折愈合 間充質(zhì)干細胞是一類具有多向分化潛能細胞，在骨折愈合過程具有重要作用。而且研究人員發(fā)現(xiàn)，在骨折6～72 h血腫內(nèi)，具有調(diào)節(jié)間充質(zhì)干細胞定向分化為成骨細胞能力的轉(zhuǎn)錄因子RUNX2，以及成骨細胞分化晚期標記基因SPP1表達明顯增加［1］。另外，研究者還在相對成熟血腫內(nèi)分離出具有多分化潛能的間充質(zhì)干細胞［8］，均提示血腫內(nèi)間充質(zhì)干細胞成分對于骨折愈合的重要意義。

血腫內(nèi)間充質(zhì)干細胞來源于兩個部分:一是骨折過程中損傷破壞的骨髓及骨膜;二是炎性反應期釋放的促炎性細胞因子或生長因子對循環(huán)血中干細胞的趨化作用［4］。最新研究發(fā)現(xiàn)，在趨化間充質(zhì)干細胞至骨折損傷區(qū)域過程中，基質(zhì)細胞衍生因子SDF－1及其G蛋白偶聯(lián)受體CXCR－4形成的 SDF－1/CXCR －4調(diào)節(jié)軸具有核心調(diào)控作用［22，23］。在損傷區(qū)域血腫內(nèi)發(fā)現(xiàn)SDF－1表達增加，尤其是在血腫臨近骨膜部位。研究還證實在軟骨內(nèi)成骨過程中，SDF－1能特異性趨化CXCR－4表達陽性間充質(zhì)干細胞進入損失區(qū)域。另外，通過給予抗SDF－1抗體，或者外源性SDF－1、CXCR－4蛋白，能夠抑制間充質(zhì)干細胞的趨化，進而影響骨折愈合，該研究不僅進一步驗證了SDF－1/CXCR－4調(diào)節(jié)軸的重要性，而且也間接證明了間充質(zhì)干細胞對于骨折愈合的意義。

此外研究發(fā)現(xiàn)，低氧誘導因子HIF－1能通過調(diào)節(jié)SDF－1表達促進間充質(zhì)干細胞的趨化作用［24］。另外，在間充質(zhì)干細胞定向分化為成骨細胞過程中，sFRP1(secreted frizzled related protein1)發(fā)揮重要負性調(diào)節(jié)作用［25］，主要通過canonical－Wnt信號通路促進間充質(zhì)干細胞向成骨細胞分化，促進骨折愈合。目前sFRP1已成為促進骨折愈合新的治療靶點。

3 血腫內(nèi)細胞因子成分與骨折愈合

近10年來，越來越多研究開始關(guān)注細胞因子及生長因子在骨折愈合中發(fā)揮的作用，多達50種細胞因子、血管生長因子、蛋白酶及形態(tài)發(fā)生蛋白被證實與骨折愈合過程有關(guān)，然而，關(guān)于骨折局部血腫內(nèi)細胞因子、生長因子表達及調(diào)節(jié)骨折愈合的詳細機制仍不清楚。

3.1 血管生長因子與骨折愈合 對血腫上清液進行分析發(fā)現(xiàn)pH值減低、磷酸鹽、堿性磷酸酶以及乳酸鹽水平增高，證實骨折后早期血腫內(nèi)存在缺氧表現(xiàn)［1，26］。而缺氧能誘導一系列血管生長因子表達，其中HIF－1是低氧狀態(tài)下血管發(fā)生的核心調(diào)控因子，在血腫形成24～36 h后表達增加，并通過調(diào)節(jié)其他生長因子表達，促進血管形成。研究發(fā)現(xiàn):低氧狀態(tài)下，VEGF mRNA及VEGF受體mRNA表達水平隨著HIF－1a表達增高而增高，呈明顯的相關(guān)性［27，28］。而 VEGF是最直接的血管內(nèi)皮細胞促分裂素，以旁分泌或自分泌形式產(chǎn)生后，與其受體結(jié)合，通過促進骨源性內(nèi)皮前體細胞募集、遷徙、活化與增殖，促進血管形成［28，29］。因此，學者們認為HIF－1a主要通過促進VEGF表達刺激血管發(fā)生、形成。此外，HIF－1能在轉(zhuǎn)錄水平上影響HMOX1(血紅蛋白加氧酶1)，GLUT1(葡萄糖載體蛋白1)表達，而這也是HIF－1a調(diào)節(jié)血管生成的另一條通路［20］。

另外，研究發(fā)現(xiàn)，骨折24～36 h后，血腫內(nèi)內(nèi)皮細胞標記物vWF表達開始增加，也提示血腫內(nèi)新生血管形成啟動［20］。而且骨折愈合延遲時，vWF、Ang1、Ang2、VEGF、CYR61、FGF2、MMP2、TIMP1 等血管生長因子表達均會降低［29］。

3.2 炎性因子與骨折愈合 血腫的形成預示著炎性反應開始，也標志著骨折愈合啟動。炎性細胞首當其沖，進入骨折血腫內(nèi)，并通過分泌細胞因子和其他炎性介質(zhì)，介導炎性反應作用。根據(jù)細胞因子的特性可分為:促炎細胞因子和抗炎細胞因子;其中IL－1，IL－6，MCSF及TNFa是炎性反應初期表達增加的促炎細胞因子，并且在趨化內(nèi)源性基質(zhì)干細胞、內(nèi)皮前體細胞及血管再生過程中發(fā)揮重要作用［20］。

通過檢測不同時期血腫內(nèi)細胞因子組分，發(fā)現(xiàn)IL－1，IL－6，IL－8，MCSF及TNFa均隨著時間延長而在骨折血腫內(nèi)含量上升:IL－1b在4 h內(nèi)即達到峰值，IL－6在12 h內(nèi)達到最高，MCSF及TNFa均在4～24 h左右達到峰值，而IL－8則在48 h后達最高，其中IL－1b與MCSF在損傷后1～4 h增加最為迅速［20］。然而在炎性反應開始的同時，具有抑制炎性反應作用的細胞因子也開始表達。在血腫形成最初4 h內(nèi)，抗炎細胞因子TGF－β表達開始增加，直到2～8周時達到峰值，其表達一直貫穿于骨折愈合的早期階段［13，20］。在血腫形成24～36 h內(nèi)，抗炎性細胞因子IL－10表達水平明顯增高，并且與HIF－1a表達呈明顯的相關(guān)性［20］。并最終在血腫形成36 h后，IL－10、TGF－β等抗炎性細胞因子起主導作用，控制和消除組織炎性反應，并促進炎性反應期向細胞增殖期轉(zhuǎn)變。急性炎性反應期一般在24 h左右達到高峰，并且在7 d內(nèi)結(jié)束。如果促炎性細胞因子過表達(TNFα、IL－1β等)或者促炎性細胞因子/抗炎性細胞因子表達失衡，將導致炎性反應期延長及血管化進程的抑制，最終會影響骨折愈合過程［19］。

盡管骨折后早期血腫對于骨折愈合的重要意義已經(jīng)證實，但是血腫內(nèi)炎性反應、免疫細胞及其相關(guān)細胞因子對于骨折愈合的詳細機制仍未得到充分解析。炎性反應或炎性因子對于骨折愈合不僅僅是正性調(diào)節(jié)關(guān)系，延長的炎性反應或炎性因子過表達將給骨折愈合及血管化帶來負面影響。因此繼續(xù)深入解析骨折后早期血腫特性，并對各種免疫細胞及炎性因子的正性、負性調(diào)節(jié)骨折愈合作用進行區(qū)分與解讀，將有助于研究及制定新的骨折治療策略，并指導臨床工作中對骨折后早期血腫處理，最終對促進骨折愈合、防止延遲愈合或不愈合等并發(fā)癥有重要意義。

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R274.1

張里程，男，1982年出生。博士研究生，醫(yī)師。主要從事創(chuàng)傷骨科基礎與臨床工作。

100853 北京，解放軍總醫(yī)院骨科

唐佩福，E －mail:pftang301@126.com

(2012－03－01收稿 2012－08－11修回)

(責任編輯 武建虎)

臨床經(jīng)驗總結(jié)