柯 洋，范天黎，高 峰，程道博，趙立群

(1.鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院消化內(nèi)科 河南 鄭州 450052;2.鄭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)教研室 河南鄭州 450001;3.鄭州大學(xué)醫(yī)藥科學(xué)研究院 河南鄭州 450052;4.鄭州市中心醫(yī)院消化內(nèi)科 河南鄭州 450007)

食管癌是人類常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，食管癌的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移是一個(gè)多因素、多步驟的過(guò)程，與細(xì)胞凋亡—抗凋亡機(jī)制調(diào)控失衡密切相關(guān)。BIT1(Bcl-2 inhibitor of transcription1)是2004年由Jan等［1］報(bào)道并發(fā)現(xiàn)的一個(gè)蛋白質(zhì)，該研究認(rèn)為生理狀態(tài)下BIT1蛋白定位于線粒體，當(dāng)其釋放到胞漿中，則和AES(amino-terminal enhancer of split，AES)［2］結(jié)合并誘導(dǎo)了由細(xì)胞脫粘附誘發(fā)的離巢凋亡，其正常的生理功能尚不清楚。但最新研究表明BIT1蛋白定位于高爾基體［3］，具有抗凋亡功能［4］。目前僅有少量文獻(xiàn)報(bào)道BIT1與腫瘤的關(guān)系，且結(jié)果不盡相同，而B(niǎo)IT1與食管鱗癌的關(guān)系，國(guó)內(nèi)外未見(jiàn)報(bào)道。

為探討B(tài)IT1與食管鱗癌的關(guān)系，尤其是與其轉(zhuǎn)移的關(guān)系，本研究采用逆轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈反應(yīng)技術(shù)(reverse trancriptase polymerase chain reaction，RT-PCR)對(duì)30個(gè)病例90個(gè)組織標(biāo)本(每個(gè)食管鱗癌組織中都有相應(yīng)的癌旁不典型增生組織及正常食管粘膜組織)中BIT1的基因表達(dá)進(jìn)行PCR擴(kuò)增及半定量分析，揭示BIT1基因的表達(dá)與食管鱗癌轉(zhuǎn)移的關(guān)系，以期為食管鱗癌的治療提供一個(gè)新的思路和靶點(diǎn)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 研究對(duì)象:30例標(biāo)本均取自安陽(yáng)市腫瘤醫(yī)院胸外科2010年10月～11月行手術(shù)切除的食管癌住院患者?；颊咝g(shù)前均未接受化、放療，腫瘤組織經(jīng)病理學(xué)檢查均確診為鱗狀細(xì)胞癌。患者中男18例，女12例。年齡45～76歲，平均年齡62.27歲。伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移10例，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移20例。6例(淺層組)腫瘤浸潤(rùn)粘膜層、粘膜下層或淺肌層;24例(深層組)腫瘤浸潤(rùn)深肌層或外膜層。

1.1.2 組織標(biāo)本采集:每例標(biāo)本于離體30 min內(nèi)分別在無(wú)壞死區(qū)癌灶、癌旁3 cm以內(nèi)及遠(yuǎn)端正常食管粘膜取材。取材后迅速凍于液氮中，－80℃超低溫冰箱中貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.3 引物設(shè)計(jì):BIT1引物和內(nèi)參β-actin引物序列均由北京賽百盛基因技術(shù)有限公司合成。BIT1上游引物序列為:5’-ATGCCCTCCAAATCCTT-3’，下游引物序列為5’-ATTAAACTTACAGTCAGTCCC-3’，預(yù)期擴(kuò)增片段大小為428 bp。內(nèi)參β-actin上游引物為5’-TCCTGTGGCATCCACGAAACT-3’，下游序列為 5’-GAAGCATTTGCGGTGGACGAT-3’，預(yù)期擴(kuò)增片段大小為315 bp。

1.2 方法

1.2.1 總RNA的提取:采用TRIZOL試劑，按照說(shuō)明提取總RNA，RNA沉淀用20 μl DEPC水溶解。總RNA經(jīng)紫外分光光度儀檢測(cè)260 nm和280 nm的吸光度(A)值，取A260/A280為1.8～2.0者用于RT反應(yīng)。

1.2.2 半定量RT-PCR反應(yīng):以提取的總RNA為模板，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)將其逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，以β-actin為內(nèi)參照行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，反應(yīng)條件為:94℃預(yù)變性2 min;95℃變性1 min，46℃退火1 min，72℃延伸1 min;經(jīng)30個(gè)循環(huán)周期后，72℃5 min，取出，4℃貯存?zhèn)溆?。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.8%瓊脂糖凝膠電泳(溴化乙錠染色)，用凝膠成像系統(tǒng)分析結(jié)果，計(jì)算BIT1擴(kuò)增條帶與β-actin擴(kuò)增條帶吸光度比值，以其作為BIT1基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS13.0分析軟件處理，根據(jù)資料類型采用ANOVA、LSD檢驗(yàn)和t檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 RT-PCR檢測(cè)BIT1基因在食管組織中的表達(dá)

BIT1及內(nèi)參β-actin的PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳大小與預(yù)先設(shè)計(jì)引物大小一致，其片段大小分別為428 bp、315 bp。凝膠灰度掃描擴(kuò)增的結(jié)果，對(duì)BIT1基因的陽(yáng)性表達(dá)進(jìn)行相對(duì)定量，BIT1基因在癌組織、癌旁不典型增生組織及正常食管粘膜組織中的含量依次為1.747±0.243、0.941±0.178、1.242±0.261，經(jīng)ANOVA檢驗(yàn)，組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=3.526，P＜0.044)，經(jīng)LSD檢驗(yàn)兩兩比較，BIT1基因的表達(dá)在癌組織中不典型增生及正常食管粘膜高(均P＜0.05)，BIT1基因的表達(dá)在不典型增生及正常食管粘膜中著差無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。見(jiàn)圖1，表1。

圖1 RT-PCR檢測(cè)BIT1的表達(dá)

表1 BIT1在各種食管組織中的表達(dá)(±s)

表1 BIT1在各種食管組織中的表達(dá)(±s)

注:A與B相比P=0.020，A與C相比P=0.047，B與C相比P=0.699。

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2.2 食管鱗癌組織中BIT1基因表達(dá)與臨床病理學(xué)參數(shù)的關(guān)系 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析表明，在食管鱗癌組織中，BIT1基因的表達(dá)水平與患者的性別無(wú)明顯相關(guān)(P＞0.05)，與腫瘤浸潤(rùn)深度無(wú)明顯相關(guān)(P＞0.05)，但BIT1基因的表達(dá)水平在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組明顯高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.001);且在TNM分期中差異有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，在TNMⅢ/Ⅳ期組中的表達(dá)高于Ⅰ/Ⅱ期組(P＜0.05)，見(jiàn)表2。

3 討論

BIT1是2004年Jan等［1］在研究細(xì)胞凋亡機(jī)制時(shí)發(fā)現(xiàn)的一種新基因，定位于人17q23.2，其mRNA長(zhǎng)度約為1 kb，編碼179aa，BIT1蛋白分子量約為27 kDa。其研究表明，生理狀態(tài)下，BIT1蛋白定位于線粒體膜間隙，當(dāng)BIT1從線粒體釋放到胞漿，或者在胞漿中表達(dá)BIT1蛋白時(shí)，BIT1與AES結(jié)合，共同介導(dǎo)整合素依賴的失巢凋亡。但也有研究表明，BIT1蛋白定位于高爾基體［3］，在粘附細(xì)胞中BIT1可通過(guò)激活FAK-P13KAFK-NFkB信號(hào)通路，上調(diào)Bcl-2的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞生存，下調(diào)內(nèi)源性的BIT1，則會(huì)增強(qiáng)粘附細(xì)胞的凋亡［4］。從目前的研究推測(cè)，BIT1可能是轉(zhuǎn)換細(xì)胞存活和死亡紐帶的關(guān)鍵分子。

表2 食管鱗癌組織中BIT1表達(dá)與臨床病理學(xué)參數(shù)的關(guān)系

本研究結(jié)果顯示:BIT1基因在癌組織中的表達(dá)水平比在癌旁組織、正常食管組織均高，而癌旁組織、正常食管組織相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。BIT1基因表達(dá)水平和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期有關(guān)，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組表達(dá)水平高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組，Ⅲ/Ⅳ期組表達(dá)水平高于Ⅰ/Ⅱ期組，而與患者的性別、年齡、浸潤(rùn)深度無(wú)明顯相關(guān)。提示BIT1在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組中的過(guò)表達(dá)與食管鱗癌的發(fā)展及轉(zhuǎn)移有關(guān)。這一結(jié)果可能與BIT1增強(qiáng)整合素α5β1 FAK的活化，通過(guò)激活FAK-P13K-AFK-NFkB信號(hào)通路上調(diào)NFkB的活性，隨之上調(diào)Bcl-2的表達(dá)有關(guān)［4］，從而促進(jìn)轉(zhuǎn)移的癌細(xì)胞克服離巢凋亡而存活。已有研究表明，Bcl-2和FAK的過(guò)表達(dá)會(huì)增加腫瘤的轉(zhuǎn)移效率［5］;BIT1在卵巢癌組織中的表達(dá)明顯高于正常卵巢組織，卵巢癌組織中BIT1的表達(dá)與病理分級(jí)密切相關(guān)［6］。但也有研究與之相反，例如Karmal等［7］認(rèn)為在晚期乳腺癌組織中BIT1表達(dá)下調(diào)，下調(diào)BIT1可降低細(xì)胞失巢凋亡的敏感性，增強(qiáng)細(xì)胞粘附，增強(qiáng)轉(zhuǎn)移和高水平的ErK活化，促進(jìn)細(xì)胞抗凋亡及轉(zhuǎn)移能力;滑瑋［8］等認(rèn)為BIT1在宮頸癌組織中的表達(dá)明顯低于正常宮頸組織，宮頸癌組織中BIT1的表達(dá)與分化程度密切相關(guān)。這些研究與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果存在差異，其原因可能與取材和檢測(cè)水平有關(guān)。

綜上所述，BIT1在伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移食管鱗癌組織中的高表達(dá)提示BIT1在食管鱗癌的轉(zhuǎn)移中可能起一定作用。而二者之間的確切關(guān)系有待于進(jìn)一步研究。

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