戴淑真， 張 黎， 王麗婭， 曾駿文

(1河南省眼科研究所，河南鄭州450003;2中山大學中山眼科中心，廣東廣州510060)

最近研究發(fā)現(xiàn)選擇性M1受體阻斷劑哌侖西平能有效抑制近視的發(fā)生發(fā)展［1］，與傳統(tǒng)的近視防治藥物阿托品相比，哌侖西平無瞳孔擴大、調(diào)節(jié)麻痹以及抑制唾液分泌和胃腸蠕動等副作用，因此將哌侖西平作為防治近視的新藥研究更具有臨床意義。但目前哌侖西平抑制近視的作用機制仍不明確。本研究擬采用玻璃體內(nèi)注射哌侖西平的方法觀察哌侖西平對雞眼形覺剝奪性近視的療效及對近視雞眼鞏膜纖維層基質(zhì)金屬蛋白酶2(matrix metalloproteinase 2，MMP－2)及其抑制劑金屬蛋白酶組織抑制劑2(tissue inhibitor of metalloproteinase 2，TIMP－2)表達的影響。

材料和方法

1 主要試劑與儀器

哌侖西平(Sigma)，考馬斯亮蘭蛋白測定試劑盒(南京建成生物工程研究所)，明膠(Sigma)，PCR擴增儀 PE9700(ABI)，凝膠掃描儀系統(tǒng) GDS7600 (ABI)，Phototope－HRP Western blotting檢測試劑盒(Cell Signaling)，分光光度計(Shimadzu UV3000)，游標卡尺(上海量具刃具廠)，冷凍離心機(Heraeus Biofuge 22R型)，Mini－Protein垂直平板電泳儀(Bio－Rad)，直流穩(wěn)壓電泳儀(Bio－Rad)，垂直平板微電泳槽(Bio－Rad)。

2 動物分組、近視模型建立及用藥方案

將1日齡純種M99穗麻雄雞40只隨機分為正常對照組、單純遮蓋組、藥物對照組和哌侖西平組，每組10只。所有動物均以右眼為實驗眼，左眼不作任何處理，其中后3組小雞的右眼用直徑為15 mm的半透明試管底遮蓋。藥物對照組和哌侖西平組的遮蓋眼分別每天玻璃體內(nèi)注射0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液和1%哌侖西平磷酸鹽緩沖液，玻璃體內(nèi)給藥使用100 μL微量進樣器將上述液體50 μL注入玻璃體內(nèi)。每天下午6時給藥。這2組動物的眼罩用直徑為7 mm的環(huán)鉆開窗，以便用藥。在雞眼平面的光照度保持在40 Lux，光照周期12 h∶12 h。1% 哌侖西平溶液為鹽酸哌侖西平粉劑1 g加0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液至100 mL制成，pH值為4.0。注射前用0.5%丁卡因局部麻醉，注射后結(jié)膜囊內(nèi)滴0.3%妥布霉素眼液。

3 檢測指標

3.1 驗光與眼外徑的測量 形覺剝奪5 d后進行驗光、測量眼軸長度和赤道部直徑。驗光由2位有經(jīng)驗的專業(yè)驗光師完成，驗光值取兩者的平均值。預(yù)實驗表明，雙盲下2位驗光師關(guān)于小雞眼的驗光值相關(guān)性為0.928(n=24)。驗光結(jié)果一律采取雞眼水平軸的屈光度，檢影鏡光束與小雞頭部矢狀面夾角在60°左右。驗光后斷頭法處死小雞取得眼球，用游標卡尺測量眼球外徑，包括眼球軸長和赤道徑，測量2次后取平均值，精確度0.02 mm。測量完成后用7 mm的環(huán)鉆鉆取后極部鞏膜，在解剖顯微鏡下小心剝離鞏膜纖維層，進行下列檢測。

3.2 RT－PCR反應(yīng)檢測MMP－2和TIMP－2 mRNA 采用Trizol一步法抽提雞眼鞏膜纖維層的總RNA，甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳鑒別RNA的抽提情況，根據(jù)引物設(shè)計的原則，設(shè)計合成MMP－2、TIMP－2和內(nèi)參照β－actin的引物(見表1)，進行RTPCR反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后行瓊脂糖凝膠電泳，并在紫外光下立體成像。

表1 MMP－2、TIMP－2和β－actin引物設(shè)計Table 1 .Primers of MMP－2，TIMP－2 and β－actin

3.3 Western blotting檢測MMP－2和TIMP－2蛋白

采用抽提緩沖液勻漿提取雞眼鞏膜纖維層的蛋白質(zhì)，考馬斯亮藍法進行蛋白定量，SDS－PAGE，全濕電轉(zhuǎn)移，免疫印跡反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后的PVDF膜瀝干后保鮮膜包裹，暗室內(nèi)X光膠片放在PVDF膜上，曝光15 s～20 min，取出X光膠片，進行顯影、定影處理，沖洗，晾干，底片照相。以甘油醛－3－磷酸脫氫酶(glyceraldehyde－3－phosphate dehydrogenase GAPDH)作為內(nèi)參照。

3.4 明膠酶譜法檢測MMP－2的活性 電泳前的處理步驟同3.3。電泳結(jié)束后將凝膠轉(zhuǎn)移入0.3% SDS溶液中低速搖動漂洗 15 min，再轉(zhuǎn)入2.5% Triton X－100中搖動45 min，取出凝膠浸入明膠酶反應(yīng)液中，37℃、18 h，然后轉(zhuǎn)入5%考馬斯亮藍R250染色液中染色1 h，脫色液脫色至看到明顯的負染帶，蒸餾水漂洗，照相。

4 統(tǒng)計學處理

所有圖像均經(jīng)KONTRON IBAS 2.0全自動分析系統(tǒng)對條帶掃描半定量分析。數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差(±s)表示，多組間比較采用單因素方差分析，SPSS 17.0統(tǒng)計軟件包進行處理，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié)果

1 屈光狀態(tài)與眼軸長度

各組動物實驗結(jié)束時眼球屈光度、眼軸長度和赤道徑的測量結(jié)果見表2。哌侖西平治療組較單純遮蓋組和藥物對照組雞眼屈光度分別減少了5.71 D和5.88 D，眼軸長度縮短了3.25 mm和2.24 mm，赤道徑減少了1.51 mm和1.47 mm，均有顯著差異(P＜0.05)。單純遮蓋組與藥物對照組比較各項指標無顯著性差異(P＞0.05)，單純遮蓋組和藥物對照組與正常組相比，各項指標差異顯著(P＜0.05)。哌侖西平治療組與正常組相比，雞眼呈相對近視，屈光度增加了8.85 D，眼軸長度和赤道徑分別增加了2.71 mm和0.59 mm，差異顯著(P＜0.05)。

表2 實驗結(jié)束時各組眼球屈光度、軸長和赤道徑的比較Table 2.Comparation of refraction，axial length，equatorial diameter of the eyes(±s.n=10)

表2 實驗結(jié)束時各組眼球屈光度、軸長和赤道徑的比較Table 2.Comparation of refraction，axial length，equatorial diameter of the eyes(±s.n=10)

*P＜0.05 vs normal control;#P＜0.05 vs form deprivation or vehicle control.

Group Refraction(D) Axial length(mm) Equatorial diameter(mm) Normal control 3.05±0.63 6.45±0.41 9.32±0.44 Form deprivation －11.52±1.27* 11.99±0.56* 11.42±0.49* Vehicle control －11.69±1.53 10.98±0.80 11.38±0.71 Pirenzepine injection －5.81±0.78*# 8.74±0.61*# 9.91±1.08*#

2RT－PCR檢測MMP－2和TIMP－2 mRNA

鞏膜纖維層所提取的總RNA進行甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳均可見18S和28S的電泳帶。RTPCR結(jié)果顯示，正常組雞眼鞏膜纖維層MMP－2和TIMP－2有一定程度的表達。半定量分析結(jié)果表明:MMP－2 mRNA的表達水平在單純遮蓋組較正常組升高155.24%(P＜0.01)，藥物對照組與遮蓋組相比無顯著差異 (P＞0.05)，哌侖西平組較遮蓋組和藥物對照組分別降低50.96%和52.65%(P＜0.01)，見圖1;TIMP－2 mRNA的表達水平在單純遮蓋組較正常組降低52.01%(P＜0.01)，藥物對照組與遮蓋組相比無顯著差異 (P＞0.05)，哌侖西平組較遮蓋組和藥物對照組分別升高62.03%和58.31% (P＜0.01)，見圖2。

Figure 1.The expression of MMP－2 mRNA.±s.n=10.＊＊P＜0.01 vs normal control;##P＜0.01 vs form deprivation and vehicle control.圖1MMP－2 mRNA的表達

Figure 2.The expression of TIMP－2 mRNA.±s.n=10.＊＊P＜0.01 vs normal control;##P＜0.01 vs form deprivation and vehicle control.圖2TIMP－2 mRNA的表達

3 Western blotting分析MMP－2和TIMP－2蛋白在各組雞眼鞏膜纖維層的表達

Western blotting半定量分析結(jié)果表明:MMP－2的表達水平在遮蓋組較正常組升高149.21%(P＜0.01)，藥物對照組與單純遮蓋組相比無顯著差異(P＞0.05)，而哌侖西平組較單純遮蓋組和藥物對照組分別下降45.07%和46.17%(P＜0.01)，見圖3; TIMP－2的表達水平在單純遮蓋組較正常組降低53.75%(P＜0.01);藥物對照組與單純遮蓋組相比無顯著差異(P＞0.05);而哌侖西平組較單純遮蓋組和藥物對照組分別上升52.53%和42.52%(P＜0.01)，見圖4。

4 明膠酶譜法檢測MMP－2的活性

正常組雞眼鞏膜纖維層既有MMP－2的潛在形式(72 kD MMP－2)又有其活性形式(66 kD MMP－2)的表達。半定量分析結(jié)果表明:單純遮蓋組較正常組72 kD和66 kD MMP－2的活性分別升高58.72%和66.40%(P＜0.01);而哌侖西平組72 kD和66 kD MMP－2的活性較藥物對照組分別降低16.76%和23.46%(P＜0.01);較單純遮蓋組分別降低21.67%和26.85%(P＜0.01);藥物對照組與單純遮蓋組相比，兩者的活性無顯著差異(P＞0.05)，見圖5。

Figure 3.The expression of MMP－2 protein.±s.n=10.＊＊P＜0.01 vs normal control;##P＜0.01 vs form deprivation and vehicle control.圖3MMP－2蛋白的表達

Figure 4.The expression of TIMP－2 protein.±s.n=10.＊＊P＜0.01 vs normal control;##P＜0.01 vs form deprivation and vehicle control.圖4 TIMP－2蛋白的表達

Figure 5.The changes of MMP－2 activity.±s.n=10.＊＊P＜0.01 vs normal control;##P＜0.01 vs form deprivation and vehicle control.圖5MMP－2活性的變化

討論

本研究在成功建立雞眼形覺剝奪性近視模型的基礎(chǔ)上，采用玻璃體內(nèi)注射哌侖西平的方法部分抑制了近視的發(fā)生發(fā)展。關(guān)于用藥劑量和時間的選擇，參考有關(guān)文獻及預(yù)實驗結(jié)果，每天用50 μL 1%哌侖西平連續(xù)5 d，既保證了確切的療效，又避免了藥物過量引起的毒副作用［2］。我們的實驗結(jié)果表明哌侖西平治療組較藥物對照組雞眼屈光度減少了5.88 D，眼軸長度縮短了2.44 mm，赤道徑減少了1.47 mm，統(tǒng)計學分析均有顯著差異(P＜0.05)，這說明玻璃體內(nèi)注射哌侖西平能有效抑制實驗性近視的發(fā)生發(fā)展。本研究結(jié)果與Truong等［2］研究發(fā)現(xiàn)的哌侖西平能部分抑制近視基本一致，而與Tigges等［3］得出的哌侖西平能完全抑制實驗性近視的結(jié)論有所不同。這可能與不同的實驗動物、實驗條件及用藥時間有關(guān)。有趣的是，玻璃體內(nèi)注射哌侖西平亦對眼球赤道徑有一定的影響，這與阿托品只對眼球前后徑有抑制作用不同［4］，我們認為這可能是由于兩者在眼內(nèi)的分布、作用位點或作用方式不同所致。

目前近視的發(fā)生機制尚不明確，長期以來人們認為過度調(diào)節(jié)是近視發(fā)生的關(guān)鍵因素;流行病學研究表明近距離工作與近視的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切［5］，并認為近距離工作引起的調(diào)節(jié)和輻輳作用使眼外肌對眼球產(chǎn)生張力，造成睫狀肌痙攣，而睫狀肌的收縮可以影響脈絡(luò)膜，從而繼發(fā)性造成鞏膜緊張，二者均能使鞏膜擴張，眼軸變長［5］。因此認為眼軸的伸長是一種被動的過程，即調(diào)節(jié)過度→機械壓迫或牽引→近視發(fā)展。通過減弱調(diào)節(jié)，去除這種作用，可以阻止近視的發(fā)展。正視眼的動物佩戴凹透鏡后能誘發(fā)眼球過度增長和近視的研究結(jié)果支持這種觀點［6］。但近年來，尤其是實驗性近視模型的建立以及生物分子水平等微觀研究的深入，越來越多的研究對過度調(diào)節(jié)引起眼球被動伸長這一理論提出異議。用形覺剝奪或透鏡去焦造成的實驗性近視研究表明:在實驗性近視中調(diào)節(jié)并不起主導作用，阿托品等調(diào)節(jié)麻痹藥物是通過非調(diào)節(jié)機制阻止近視發(fā)展的［6］。臨床上用閱讀眼鏡、接觸鏡和雙焦眼鏡不能成功減輕近視進展的事實支持這一觀點［7］。越來越多的證據(jù)表明近視眼的調(diào)節(jié)并不像以往想像的那樣過度甚至痙攣，而是相對低下和遲滯［7］。本研究結(jié)果顯示選擇性M1受體拮抗劑哌侖西平能有效抑制近視。由于眼虹膜和睫狀體上主要是M3受體，故哌侖西平對調(diào)節(jié)幅度及瞳孔散大的影響極小，這進一步佐證了近視發(fā)生的非調(diào)節(jié)機制。

鞏膜是一種致密的黏彈性結(jié)締組織，無論是在出生后眼球的正常發(fā)育還是在近視眼的發(fā)展過程中，鞏膜在決定眼球的形狀和大小并進而影響眼球的屈光狀態(tài)中均起著重要作用［4］。動物實驗性近視眼和人類近視眼的鞏膜均有膠原纖維的合成代謝減少而分解代謝增加，鞏膜蛋白多糖的糖胺多糖合成和硫化減少［8］。鞏膜組織的這種重新塑形需要其基質(zhì)合成和降解之間的精細平衡，其中細胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)中的基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)和其組織型抑制劑TIMPs起著重要作用［9］。MMPs是一類高度保守的鋅或鈣依賴的肽鏈內(nèi)切酶，依照酶解底物的不同分為4個亞族:基質(zhì)膠原酶、明膠酶、基質(zhì)降解酶、跨膜或膜型金屬蛋白酶，它們均參予了鞏膜ECM的重塑［10］，其中MMP－2是正常動物鞏膜中的主要明膠酶，可以降解雞眼鞏膜纖維層及哺乳動物纖維鞏膜的I型膠原，與近視的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切［9］。TIMPs是體內(nèi)存在的MMPs的生物抑制劑，其中TIMP－2是MMP－2的特異抑制劑，它對MMP－2酶原及活性MMP－2均有抑制作用［9］。MMP－2/TIMP－2的平衡對鞏膜ECM代謝起著重要調(diào)節(jié)作用。我們的研究結(jié)果顯示形覺剝奪性近視雞眼鞏膜纖維層MMP－2 mRNA、蛋白及其酶活性升高，而TIMP－2 mRNA和蛋白水平下降，這導致了MMP－2/TIMP－2失衡，鞏膜纖維層MMP－2的裂解活動增加，ECM分解代謝加強而合成代謝減弱［9］，鞏膜變薄，眼軸增長而導致近視發(fā)生。有研究發(fā)現(xiàn)哌侖西平抑制近視的作用位點并不在視網(wǎng)膜，可能是通過直接作用于鞏膜上的M1受體進而干預(yù)鞏膜ECM的代謝而抑制近視的［2］。我們在以前的研究中發(fā)現(xiàn)哌侖西平治療組較單純遮蓋組形成相對遠視，后極部鞏膜纖維層增厚，膠原纖維直徑增粗，病理改變程度較單純遮蓋組明顯減輕［11］。本研究結(jié)果顯示哌侖西平組較單純遮蓋組鞏膜纖維層MMP－2 mRNA和蛋白質(zhì)表達及其活性均顯著降低，而較正常組明顯升高;TIMP－2的各項表達均較單純遮蓋組明顯增高，而較正常組明顯降低?？梢娺邅鑫髌娇赡芡ㄟ^抑制雞眼鞏膜纖維層MMP－2的表達及激活同時增強TIMP－2的表達。從而調(diào)節(jié)近視雞眼后極部鞏膜ECM的代謝，增加鞏膜對眼內(nèi)壓的機械抵抗力，減慢眼球的擴張而部分抑制近視的。哌侖西平調(diào)節(jié)MMP－2和TIMP－2的具體途徑尚不明確，可能與M受體結(jié)合后經(jīng)直接或間接途徑影響一系列生長因子如轉(zhuǎn)化生長因子β (transforming growth factor β，TGF－β)［12］、視黃酸、堿性成纖維細胞生長因子(base fibroblast growth factor，bFGF)和生物活性物質(zhì)的代謝過程有關(guān)，這還需要進一步的研究。

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