譚美華， 陳建蘇， 招志毅， 丁 勇， 鐘敬祥， 戴 應(yīng)， 李善義， 楊皓莊

(暨南大學(xué)1第一臨床醫(yī)學(xué)院眼科，2醫(yī)學(xué)院眼科研究所，3再生醫(yī)學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，4醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)系，廣東廣州510632)

人體內(nèi)角膜內(nèi)皮細(xì)胞(corneal endothelial cells，CECs)形成成熟單細(xì)胞層后一般失去增殖能力，在受到損傷和丟失后主要靠周邊內(nèi)皮細(xì)胞的擴(kuò)大和移行修復(fù)，而供體材料匱乏和免疫排斥反應(yīng)使角膜移植治療角膜內(nèi)皮疾病受到限制［1］。2006年，Takahashi等［2］首次將小鼠成纖維細(xì)胞體外重編程為類似胚胎干細(xì)胞的誘導(dǎo)多能性干細(xì)胞(induced pluripotent stem cells，iPSCs)，這種體細(xì)胞來源的干細(xì)胞避免了道德倫理問題和免疫排斥的缺點(diǎn)，迅速成為干細(xì)胞領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)［3－4］。利用iPSCs作為種子細(xì)胞來源，構(gòu)建組織工程角膜內(nèi)皮為臨床治療角膜內(nèi)皮疾病提供了新的思路。本實(shí)驗(yàn)通過建立 iPSCs與兔CECs的混合共培養(yǎng)模式，用原子力顯微鏡(atomic force microscopy，AFM)結(jié)合倒置顯微鏡觀察共培養(yǎng)前后iPSCs的形貌和超微結(jié)構(gòu)變化，初步探討混合共培養(yǎng)誘導(dǎo)iPSCs分化的表征變化;在此基礎(chǔ)上，用量子點(diǎn)對iPSCs進(jìn)行標(biāo)記示蹤，對共培養(yǎng)一定時(shí)間后iPSCs膜蛋白的表達(dá)變化進(jìn)行檢測，研究此共培養(yǎng)體系促進(jìn)iPSCs向角膜內(nèi)皮樣細(xì)胞分化的潛能，為進(jìn)一步研究iPSCs向CECs的分化提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

材料和方法

1 材料與試劑

人臍帶源iPSCs(中國科學(xué)院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院惠贈);mTeSR1培養(yǎng)基(WiCellTM研究所); Y27632(Sigma－Aldrich);高糖DMEM培養(yǎng)基(Gibco);兔抗人Oct4、Nanog和Sox2抗體 (Cell Signaling);兔抗人水通道蛋白1(aquaporin 1，AQP1)抗體、鼠抗人 CD34抗體和羊抗鼠 IgG抗體(Santa Cruz);鼠抗人CD133抗體(Miltenyi Biotec);兔抗人CD31抗體(博奧森);鼠抗兔IgG抗體(Chemicon);量子點(diǎn)活細(xì)胞示蹤試劑盒(武漢珈源);熒光顯微鏡(Leica);原子力顯微鏡(BioScope Catalyst);三維去卷積實(shí)時(shí)活細(xì)胞成像系統(tǒng)(熒光)(API－DVCore);倒置顯微鏡(Olympus)。

2 方法

2.1 兔CECs的分離與培養(yǎng) 取新西蘭大白兔空氣栓塞致死，無菌條件下摘取眼球，PBS沖洗3次，放入含1×106U/L慶大霉素的PBS中，4℃冰箱浸泡30 min。環(huán)形剪下整片角膜組織，置于含5×105U/L青霉素、100 mg/L鏈霉素的雙抗PBS中，內(nèi)皮面朝上，解剖顯微鏡下小心剝離后彈力膜和內(nèi)皮層，移入無菌培養(yǎng)皿中，將卷曲大片的透明后彈力膜撕成小塊，雙抗PBS沖洗，加入0.25%胰蛋白酶常溫消化10 s，吸棄胰酶，加入內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基即含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的高糖DMEM，反復(fù)吹打組織片50～60次，將懸液和后彈力膜一起移入6孔板，放入37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育。48 h后換液，以后每3 d更換1次培養(yǎng)基。細(xì)胞融合至80%時(shí)吸棄培養(yǎng)基，0.25%胰酶37℃消化10 min，內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基終止消化，反復(fù)吹打使細(xì)胞脫落，1 200 r/min、離心5 min，加入內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基重懸，1∶2傳代培養(yǎng)，做成爬片。

2.2 人iPSCs的擴(kuò)增培養(yǎng) 37℃水浴箱解凍第31代人臍帶源iPSCs系［5］，轉(zhuǎn)移至15 mL離心管中，逐滴加入9 mL含體積分?jǐn)?shù)0.1%Y27632的mTeSR1培養(yǎng)基，15～25℃、1 450 r/min離心5 min，棄上清，加入2 mL上述培養(yǎng)基，輕輕吹打重懸細(xì)胞，轉(zhuǎn)移至6孔板，放入37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育，24 h后改用mTeSR1培養(yǎng)基換液。每天倒置顯微鏡觀察，辨認(rèn)克隆周邊分化的細(xì)胞并及時(shí)刮棄，保持高純度的未分化狀態(tài)iPSCs，每天更換培養(yǎng)基，5～7 d傳代。

2.3 人iPSCs的鑒定 收集1×106iPSCs裂解后的上清液，進(jìn)行SDS－PAGE電泳。電轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，洗滌液漂洗2 min，再將PVDF膜浸入5%封閉液中，4℃振蕩1 h，將PVDF膜分別與兔抗人Oct4、Nanog、Sox2抗體(1∶1 000)和兔單克隆β－actin抗體(1∶3 000)4℃孵育過夜，洗滌液洗滌3次，每次5 min，加入羊抗兔IgG抗體(1∶3 000)室溫孵育1 h，ECL法顯色，顯影劑孵育1 min，定影劑孵育0.5 min。2.4 人iPSCs的標(biāo)記 未分化iPSCs擴(kuò)增培養(yǎng)7 d后1∶4傳代，傳代后第4 d取3孔進(jìn)行標(biāo)記。根據(jù)量子點(diǎn)活細(xì)胞示蹤試劑盒說明書的步驟并調(diào)整濃度操作如下:分別取3 μL、4.5 μL和6 μL組分A，另取等體積組分B與組分A混勻，室溫孵育5 min，分別用594 μL、591 μL和588 μL mTeSR1培養(yǎng)基將A與B的混合液稀釋成應(yīng)用液，量子點(diǎn)的濃度分別為5 nmol/L、7.5 nmol/L和10 nmol/L。取3孔iPSCs，吸棄培養(yǎng)基，PBS洗滌2次，分別加入配好的3種不同濃度應(yīng)用液，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育1 h，吸棄標(biāo)記液，PBS洗滌2次，加入mTeSR1培養(yǎng)基，置于孵箱繼續(xù)培養(yǎng)，每天換液，3 d后，用熒光三維去卷積實(shí)時(shí)活細(xì)胞成像系統(tǒng)觀察標(biāo)記效果并拍照。

2.5 人iPSCs與兔CECs混合共培養(yǎng) 取3孔已用最佳濃度量子點(diǎn)標(biāo)記的iPSCs，培養(yǎng)3 d后吸棄培養(yǎng)基，加入0.05%胰酶37℃消化3 min，吸走胰酶，mTeSR1培養(yǎng)基清洗2遍，加入mTeSR1培養(yǎng)基，用機(jī)械法輕輕刮起iPSCs，同時(shí)吹打幫助細(xì)胞脫落，分別取懸液的1/4、1/3和1/2加入到已經(jīng)融合60%的兔CECs爬片中，均加入內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基，37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育培養(yǎng)，24 h后第1次換液，之后每2 d用內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基換液1次。

2.6 AFM觀察 共培養(yǎng)過程中，每天倒置顯微鏡觀察，記錄3種細(xì)胞的形態(tài)變化。7 d后，取最佳比例共培養(yǎng)的細(xì)胞，吸棄培養(yǎng)基，PBS洗滌，4%多聚甲醛固定15 min，PBS洗滌3次，取出爬片自然風(fēng)干，固定于AFM載物臺上，普通光選取要采集圖像的細(xì)胞，轉(zhuǎn)換為RTESP探針，以輕敲模式掃描。所用懸臂的彈性系數(shù)k為20～80 N/m，共振頻率為278～317 kHz，掃描速度0.5 Hz，圖像像素256×256 pixel，經(jīng)自帶分析軟件進(jìn)行3種細(xì)胞的全貌、細(xì)胞直徑、核直徑以及近核處5 μm小區(qū)域細(xì)胞膜的均方根粗糙度和平均粗糙度等參數(shù)的測量和分析。

2.7 免疫熒光檢測 以最佳比例混合共培養(yǎng)2周后，取4孔細(xì)胞吸棄培養(yǎng)基，PBS清洗，4%多聚甲醛固定30 min，配置的BSA－TBST室溫透膜30 min，10%胎牛血清封閉1 h，分別加入兔抗人CD31抗體、兔抗人AQP1抗體、鼠抗人CD133抗體和鼠抗人CD34抗體，4℃冰箱孵育過夜。PBS洗滌后，前兩者加入鼠抗兔IgG抗體，后兩者加入山羊抗鼠IgG抗體，均常溫孵育1 h，DAPI染色液室溫作用15 min，PBS清洗，激光共聚焦顯微鏡觀察并拍照，取4孔正常培養(yǎng)7 d的iPSCs按相同的步驟染色作為對照。

結(jié)果

1 兔角膜內(nèi)皮細(xì)胞生長形態(tài)

原代兔角膜內(nèi)皮細(xì)胞分離培養(yǎng)48 h后大部分已貼壁，未被吹散的成團(tuán)細(xì)胞貼壁后開始向周圍移行增殖，2周后細(xì)胞達(dá)80%融合，細(xì)胞呈多邊形，緊密排列呈鋪路石樣。傳代24 h后，角膜內(nèi)皮細(xì)胞大部分貼壁，第3～5 d生長活躍(圖1)，1周達(dá)生長密集狀態(tài)，形態(tài)呈六邊形或橢圓形。

Figure 1.The morphology of primary rabbit corneal endothelial cells(CECs)cultured for 5 d(×100).圖1 兔角膜內(nèi)皮細(xì)胞原代培養(yǎng)5 d的形態(tài)

2 人iPSCs的生長形態(tài)及鑒定

人iPSCs呈克隆生長，增殖較快，5～7 d可達(dá)90%融合。單個(gè)iPSC細(xì)胞核約占整個(gè)細(xì)胞的2/3，核漿比較大，可見2～3個(gè)核仁。Western blotting檢測顯示iPSCs的Oct4、Nanog和Sox2蛋白均表達(dá)陽性，見圖2。

Figure 2.The expression of Nanog，Oct4 and Sox2 detected by Western blotting.M:protein marker.圖2 Western blotting檢測Nanog、Oct4和Sox2蛋白的表達(dá)

3 人iPSCs的標(biāo)記

量子點(diǎn)可標(biāo)記共培養(yǎng)的人iPSCs，量子點(diǎn)熒光標(biāo)記呈濃度正相關(guān)依賴，濃度為10 nmol/L的量子點(diǎn)應(yīng)用液對iPSCs標(biāo)記效果最佳，見圖3。

4 倒置顯微鏡觀察

共培養(yǎng)24 h后倒置顯微鏡觀察，iPSCs開始在CECs間隙貼壁克隆樣生長。1/3懸液的iPSCs貼壁克隆較多，細(xì)胞生長較快，小克隆逐漸融合，抑制CECs的生長;1/2懸液的iPSCs貼壁較多，融合形成的iPSCs大克隆顯著抑制內(nèi)皮細(xì)胞的生長;1/4懸液的iPSCs生長良好，貼壁后的小克隆與角膜內(nèi)皮細(xì)胞均繼續(xù)擴(kuò)增，且新擴(kuò)增的iPSCs體積逐漸變大，胞漿增多，兔CECs逐漸由六邊形變成橢圓甚至長梭形，見圖4。

5AFM觀察

用AFM對第1代兔CECs和共培養(yǎng)前后iPSCs作全貌及細(xì)胞膜小區(qū)域超微結(jié)構(gòu)掃描，結(jié)果見圖5。圖5A是3種細(xì)胞的二維、三維和峰值誤差圖，可觀察到單層培養(yǎng)的第1代兔CECs表面粗糙，膜上分布著密集的大小不等顆粒狀突起物;共培養(yǎng)前iPSCs表面較光滑，未見明顯的顆粒;共培養(yǎng)7 d后iPSCs膜表面不再平滑，可見顆粒狀突起分布，粗糙度較前明顯增加。測量每個(gè)細(xì)胞及其細(xì)胞核的直徑，計(jì)算細(xì)胞核與細(xì)胞直徑之比，統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果顯示3種細(xì)胞兩兩之間均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見圖5B，即iPSCs經(jīng)共培養(yǎng)誘導(dǎo)后核漿比逐漸變小，說明iPSCs從形態(tài)上開始向內(nèi)皮樣細(xì)胞轉(zhuǎn)化。取近核處細(xì)胞膜進(jìn)行5 μm小區(qū)域超微結(jié)構(gòu)掃描，發(fā)現(xiàn)共培養(yǎng)前后iPSCs均方根粗糙度Rq和平均粗糙度Ra比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見圖5C、D。共培養(yǎng)后iPSCs粗糙度較前明顯增加，與形貌圖的觀察結(jié)果一致。

Figure 5.The morphology of rabbit CECs and human iPSCs before and after mixed culture observed by atomic force microscopy.A:two－dimensional(2D)，three－dimensional(3D)and peak force error images;B:statistical chart of the ratio of diameter of diameter of nucleus to cell;C:statistical chart of the mean square root roughness(Rq);D:statistical chart of the average roughness(Ra).±s.n=20.*P＜0.05 vs CECs;△P＜0.05 vs iPSCs.圖5 原子力顯微鏡觀察兔CECs和共培養(yǎng)前后人iPSCs的形貌

6 免疫熒光檢測

混合共培養(yǎng)前iPSCs中CD31、AQP1、CD133和CD34蛋白均未見表達(dá);共培養(yǎng)2周后，iPSCs表達(dá)AQP1呈陽性，見圖6，其它3種蛋白表達(dá)陰性。

Figure 6.Aquaporin 1 was expressed positively in human iPSCs after mixed－cultured with rabbit CECs for 2 weeks(under confocal microscope).圖6 分化后人iPSCs表達(dá)AQP1呈陽性

討論

目前，在特定條件下 iPSCs可被誘導(dǎo)分化為心肌細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、神經(jīng)元等［6－8］。將自體iPSCs作為組織工程角膜的種子細(xì)胞，利用其多向分化潛能，在特定條件下誘導(dǎo)分化為角膜內(nèi)皮細(xì)胞，這一思路的可行性將為眼科臨床治療角膜內(nèi)皮疾病提供新的途徑。

細(xì)胞共培養(yǎng)體系在維持細(xì)胞基本結(jié)構(gòu)和性狀的基礎(chǔ)上，使體內(nèi)外環(huán)境盡可能相吻合，有利于構(gòu)建更加接近生理狀態(tài)的重建體外細(xì)胞組織?；旌霞?xì)胞共培養(yǎng)既有細(xì)胞因子的流通，又有細(xì)胞之間的接觸作用，是研究直接接觸共培養(yǎng)促進(jìn)干細(xì)胞分化的一種有效方式［9－10］。原子力顯微鏡利用探針在樣品表面進(jìn)行逐級光柵掃描得到樣品表面的形貌，它可在空氣或各種近生理?xiàng)l件的溶劑體系中直接觀測樣品表面形貌和結(jié)構(gòu)特征，進(jìn)行高精度的微觀測量，分辨率高，制樣簡單，操作性好，成像時(shí)間短，在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域廣泛應(yīng)用于細(xì)胞形態(tài)分析［11－12］。干細(xì)胞的標(biāo)記對干細(xì)胞移植效果的評估和治療方案的優(yōu)化極為重要，而功能化納米材料的標(biāo)記技術(shù)是干細(xì)胞示蹤的新途徑。量子點(diǎn)作為一種新型熒光染料，它激發(fā)波長寬，發(fā)射波長窄，發(fā)光性能強(qiáng)，抗光漂白能力強(qiáng)，熒光壽命長，這些優(yōu)良的光學(xué)和化學(xué)特性使得量子點(diǎn)成為生物醫(yī)學(xué)標(biāo)記應(yīng)用的一項(xiàng)重要技術(shù)［13］。在三維去卷積實(shí)時(shí)活細(xì)胞成像系統(tǒng)可以較好地顯示出量子點(diǎn)與膜表面蛋白雙標(biāo)記效果。

本實(shí)驗(yàn)用一種新的胰酶快速消化法分離培養(yǎng)出具有典型多邊形結(jié)構(gòu)和鋪路石樣外觀的兔CECs，并用無飼養(yǎng)層細(xì)胞培養(yǎng)法擴(kuò)增培養(yǎng)人iPSCs，避免了飼養(yǎng)層培養(yǎng)體系中可能出現(xiàn)的細(xì)胞混雜問題;倒置顯微鏡下及時(shí)挑走分化細(xì)胞以獲得保持未分化狀態(tài)的人iPSCs;對人iPSCs進(jìn)行量子點(diǎn)標(biāo)記示蹤，可以區(qū)別分化后的人iPSCs和兔CECs，且利于長期共培養(yǎng)后目的細(xì)胞的檢測和分選。設(shè)計(jì)了不同的細(xì)胞比例進(jìn)行混合共培養(yǎng)，在最適宜條件下觀察兩者的相互影響和誘導(dǎo)效果。在倒置顯微鏡和AFM觀察到分化后的人iPSCs形態(tài)和膜粗糙度均發(fā)生變化，體積增大，胞漿增多，核漿比減小，細(xì)胞均方根粗糙度和平均粗糙度均增加。另外，本實(shí)驗(yàn)選用CD34和CD133膜表面蛋白檢測是內(nèi)皮干細(xì)胞的標(biāo)志物，CD31也在內(nèi)皮細(xì)胞連接處高表達(dá)，而AQP1是角膜內(nèi)皮最主要的一個(gè)水通道蛋白［14］，結(jié)果顯示本實(shí)驗(yàn)條件下iPSCs具有向角膜內(nèi)皮樣細(xì)胞轉(zhuǎn)化的特征。

綜合這些結(jié)果，量子點(diǎn)標(biāo)記共培養(yǎng)的人iPSCs呈濃度正相關(guān)依賴，10 nmol/L量子點(diǎn)標(biāo)記的iPSCs以1/4懸液與融合60%的兔CECs共培養(yǎng)可獲得最佳混合共培養(yǎng)和標(biāo)記效果。本實(shí)驗(yàn)所用混合共培養(yǎng)方法可誘導(dǎo)人iPSCs從形態(tài)學(xué)變化上和AQP1表達(dá)上向角膜內(nèi)皮樣細(xì)胞方向分化。產(chǎn)生這些變化的機(jī)制是兔CECs分泌細(xì)胞因子的誘導(dǎo)作用，還是2種細(xì)胞直接接觸作用，或是這兩者的雙重作用，還有待進(jìn)一步觀察和研究。

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