曹學(xué)鋒， 楊應(yīng)忠， 馬 蘭， 馬 燕， 格日力

(青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院高原醫(yī)學(xué)研究中心，青海西寧810001)

近年來，在高原適應(yīng)研究領(lǐng)域中作為具有廣泛細胞保護效應(yīng)的血紅素氧合酶(heme oxygenase，HO)日益受到人們的關(guān)注。HO存在于人類和哺乳動物體內(nèi)。目前已發(fā)現(xiàn)3種HO的同工酶，分別為HO－1、HO－2和HO－3。它們是不同基因編碼的產(chǎn)物，廣泛存在于哺乳動物的多數(shù)體細胞中。HO是血紅素降解的起始酶和限速酶，它能催化血紅素在體內(nèi)氧化分解形成膽綠素、一氧化碳(carbon monoxide，CO)和亞鐵離子(Fe2+)。膽綠素在體內(nèi)立即被膽綠素還原酶作用生成膽紅素，目前認為膽紅素具有很強的抗氧化效應(yīng)，而鐵離子誘導(dǎo)鐵蛋白的合成。HO－1即熱休克蛋白32(heat－shock protein 32，HSP32)，又稱誘導(dǎo)型HO－1［1］;HO－1抗氧化效果明確［2］;HO－1具有抗氧化應(yīng)激、抑制炎癥反應(yīng)、抗凋亡等作用，被認為是一種細胞保護因子［3－4］;HO－1基因序列的啟動區(qū)域存在多種調(diào)節(jié)序列如缺氧誘導(dǎo)因子［5］。

藏羚羊(Pantholops hodgsonii)是青藏高原國家一級重點保護動物，主要分布在我國的西藏羌塘、青?？煽晌骼?、新疆阿爾金山保護區(qū)，棲息高度在3 500～5 500 m，尤以4 500～5 500 m的高原無人區(qū)常見［6－7］。藏羚羊生活在高海拔、嚴重缺氧、極度寒冷的環(huán)境中，具有極強的運動能力和低氧高寒耐受能力，提示它作為高原適應(yīng)性土生物種在抗低氧、耐高寒、極強的細胞適應(yīng)性保護機制具有自身獨特的優(yōu)勢。

本中心以往的研究表明，高原土生動物血紅蛋白和肌紅蛋白的核苷酸和氨基酸序列與平原地區(qū)動物相比較，藏羚羊存在基因位點和氨基酸位點的突變，其突變位點與藏羚羊高原適應(yīng)的關(guān)系值得進一步研究［6，8－10］。對藏羚羊心臟生理功能的研究表明，藏羚羊心臟對高海拔低氧環(huán)境的適應(yīng)，可能是通過增加心臟器官的重量及心肌細胞線粒體的含量來實現(xiàn)［11］。因此，本研究以HO－1為出發(fā)點克隆并分析了藏羚羊HO－1基因編碼區(qū)序列。

材料和方法

1 動物

經(jīng)國家林業(yè)局批準 (林護批字［2009］46號)，于2009年4月在青海省可可西里國家級自然保護區(qū)(海拔4 300 m)捕捉藏羚羊雄性9只，捕捉后立即運至格爾木市實驗基地(海拔2 800 m)，進行相關(guān)生理學(xué)指標采集后，所需組織迅速投入液氮中，低溫保存并運回西寧。

2 主要試劑

Trizol總RNA提取試劑購自Invitrogen，pGEM?－T Easy載體、Wizard?PlusSV質(zhì)粒小量純化系統(tǒng)、5 ×M－MLV buffer、M－MLV逆轉(zhuǎn)錄酶、RNasin和Oligo(dT)15，均購自Promega。Ex Taq DNA聚合酶、10 ×PCR buffer、2.5 mmol/L dNTP購自TaKaRa。QIA-quick膠回收試劑盒購自Qiagen，大腸桿菌TOP10菌株為本實驗室保存。其它試劑均為國產(chǎn)或進口產(chǎn)品。

3 主要方法

3.1 引物設(shè)計與合成 HO－1在許多脊椎動物間具有相對保守序列，故根據(jù)NCBI中核酸數(shù)據(jù)庫已公布的牛(Bos Taurus NM_001037444)、人(Homo sapiens NM_004964)等哺乳動物物種HO－1的cDNA序列，根據(jù)其同源性，利用DNAMAN 6.0軟件找到HO－1在以上各物種間的保守區(qū)，再結(jié)合Primer 5.0軟件進行引物設(shè)計，引物名稱及序列見表1。引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。

表1 HO－1引物序列及PCR反應(yīng)條件Table 1 .The primers of HO－1 and the conditions for PCR

3.2 總RNA的提取及鑒定 采用Trizol試劑一步抽提法提取藏羚羊肝組織中的總RNA，用組織勻漿器制成勻漿后，于4℃以12 000×g離心10 min。取上清，加入0.2 mL氯仿、劇烈振蕩15 s，再靜置2～3 min后，4℃以12 000×g離心15 min，取上清，加入0.5 mL異丙醇，混勻，放置冰上15 min，于4℃以10 000×g離心20 min。棄上清，沉淀用1 mL 75%乙醇洗滌1次，溶于30 μL經(jīng)DEPC水中，并用Eppendorf BioPhotometer核酸蛋白測定儀檢測總RNA的濃度及測定A260和A280值，并進行1%甲醛變性凝膠電泳檢測其質(zhì)量，置－80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

3.3 RT－PCR擴增及序列測定 根據(jù)DNA第1鏈合成試劑盒，取總RNA 1 μg和Oligo(dT)150.5 μg，加DEPC水補足至20 μL，于70℃放置10 min再迅速放于4℃。分別加入5×M－MLV buffer 10 μL、M－MLV逆轉(zhuǎn)錄酶200U、2.5 mmol/L dNTP 10 μL及RNasin 2.5 U，加 DEPC雙蒸水補足至50 μL，于42℃ 45 min，95℃2 min，置－20℃保存?zhèn)溆?。PCR的反應(yīng)體系:10×PCR buffer 5 μL，2.5 mmol/L dNTP 4 μL，Ex Taq DNA聚合酶2.5 U，上、下游引物各1 μL(10 μmol/L)及cDNA模板2 μL，加雙蒸水補足到50 μL。PCR循環(huán)參數(shù)為:95℃預(yù)變性2 min，94℃ 30 s，Tm30 s，72℃ 30 s，共30個循環(huán)后(各引物退火溫度、循環(huán)次數(shù)見表1)，再于72℃延伸10 min。4℃保存。取10 μL反應(yīng)液進行1.5%凝膠電泳檢驗擴增結(jié)果。擴增產(chǎn)物分別按預(yù)測片段大小的不同，采用1.2%和1.4%的瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。根據(jù)QIAquick膠回收試劑盒說明回收純化特異性擴增片段，將回收純化的片段連接到pGEM－T Easy載體上，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化TOP10感受態(tài)細胞，用含氨芐青霉素、X－Gal和IPTG的LB培養(yǎng)基37℃過夜培養(yǎng)。從轉(zhuǎn)化平板上挑選單克隆白斑，37℃搖菌過夜，提取質(zhì)粒。用EcoRⅠ進行酶切鑒定，選出含有目的片段的克隆，送上海英濰捷基貿(mào)易有限公司測序。

3.4 數(shù)據(jù)處理與分析 將獲得的序列拼接后利用NCBI數(shù)據(jù)庫的BLAST工具對測序結(jié)果進行對比分析;NCBI數(shù)據(jù)庫ORF finder工具及www.espasy.org網(wǎng)站相關(guān)生物信息學(xué)軟件用于預(yù)測開放閱讀框;用DNAMAN 6.0軟件用于將核苷酸序列翻譯成相對應(yīng)的氨基酸序列;NCBI的BLAST工具及DNAMAN 6.0軟件用于序列相似性分析;用DNAMAN 6.0生成系統(tǒng)進化樹。

結(jié)果

1 總RNA的提取

提取的藏羚羊肝臟組織總RNA A260/A280＞1.8，電泳后可見完整的18S和28S條帶，說明所得RNA分子質(zhì)量較高，可以作為逆轉(zhuǎn)錄模板用于RT－PCR。

2 PCR擴增結(jié)果

藏羚羊HO－1基因的PCR擴增產(chǎn)物片段經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后在紫外燈下觀察，得到與預(yù)期片段大小一致的特異性條帶，見圖1?；厥占兓腜CR產(chǎn)物經(jīng)連接、轉(zhuǎn)化、篩選、培養(yǎng)并鑒定后測定。

Figure 1.Agarose gel electrophoresis of RT－PCR showed amplified HO－1 gene fragment.1:primer forward 1－reverse 1－amplified gene fragment;2:primer forward 2－reverse 2－amplified gene fragment;3:primer forward 3－reverse 3－amplified gene fragment;4:primer forward 4－reverse 4－amplified gene fragment;M:DNA marker.圖1 藏羚羊HO－1基因RT－PCR擴增產(chǎn)物片段凝膠電泳

3 測序結(jié)果及序列分析

測序后對序列進行拼接，得到長度為1 353 bp的藏羚羊HO－1基因部分cDNA序列(GenBank登錄號為JQ809687)。根據(jù)預(yù)測結(jié)果推測出藏羚羊HO－1基因編碼區(qū)的核苷酸長度為897 bp，可編碼298個氨基酸，見圖2。將所得藏羚羊HO－1基因cDNA序列及氨基酸序列與其它物種進行序列相似性比較，結(jié)果表明不同物種間該基因具有高度保守性，這也說明了HO－1基因在物種進化過程中有著重要的生物學(xué)意義，見表2、表3。

4 系統(tǒng)進化分析

通過建立的系統(tǒng)進化樹可以看出，藏羚羊與山羊的遺傳距離最近，見圖3。

討論

HO－1是近年倍受重視的細胞內(nèi)源性抗氧化酶，本質(zhì)上屬于應(yīng)激蛋白，能在各種氧化應(yīng)激狀態(tài)下出現(xiàn)適應(yīng)性表達，發(fā)揮抗自由基等多種細胞保護作用。HO－1的抗氧化性源于其對促氧化的游離血紅素的降解及生成具有強大抗氧化能力的產(chǎn)物膽紅素，后者能非特異性清除多種自由基［12］。除此之外，HO－1的細胞保護效應(yīng)有:抗細胞凋亡、抗炎癥、調(diào)節(jié)細胞周期、維持正常的微循環(huán)血流、血管重構(gòu)等［13］。

Figure 2.Nucleotide and deduced amino acid sequences of encoding region of Tibetan antelope HO－1 gene.圖2 藏羚羊HO－1基因編碼區(qū)的核苷酸序列及推導(dǎo)的氨基酸序列

高原適應(yīng)是高原土生動物在低氧高寒環(huán)境中生存、進化的結(jié)果，是機體克服低氧高寒等環(huán)境得以生存的有效途徑，其本質(zhì)就是在低氧高寒等條件下機體能夠最大限度地從器官、組織直至分子、細胞、基因各個層面上發(fā)揮細胞保護功能，為完成機體正常的生理功能和代謝保駕護航。近年來，對于HO－1應(yīng)激性細胞保護效應(yīng)研究成為熱點，因此，其結(jié)構(gòu)和功能已成為高原低氧高寒等適應(yīng)研究的重要內(nèi)容。

本實驗首次成功地克隆出藏羚羊HO－1基因編碼區(qū)的全長cDNA，并經(jīng)基因序列分析證實，克隆的HO－1基因的開放讀碼框由897 bp堿基組成，可編碼由298個氨基酸組成的多肽。將該序列登錄于GenBank，登錄號為JQ809687。藏羚羊HO－1基因的編碼區(qū)序列與哺乳動物山羊和牛的相似性分別達到98%和96%，氨基酸序列相似性分別達到92%和97%，與其它脊椎動物HO－1基因的核苷酸及氨基酸序列相似性分別達到86%和87%以上，顯示出高度保守性。在系統(tǒng)進化方面，藏羚羊與山羊的HO－1起源相同，親緣關(guān)系最近。與山羊HO－1編碼區(qū)的序列相比較發(fā)現(xiàn)，藏羚羊HO－1基因中第31位密碼子突變?yōu)?GCC→ACT)，第123位密碼子突變?yōu)?TGG→TGC)，第284位密碼子突變?yōu)?GCC→GGC)，第287位密碼子突變?yōu)?AAT→CAT);推導(dǎo)的氨基酸的序列也發(fā)生突變，即第123位的丙氨酸(Ala)突變?yōu)樘K氨酸(Thr)，第230位的絲氨酸(Ser)突變?yōu)榱涟彼?Leu)。關(guān)于突變位點與高原適應(yīng)的關(guān)系尚有待進一步研究。進化樹分析表明，藏羚羊HO－1與其它動物的HO－1集成一束，它們與高等動物的HO－1源于共同的祖先，但分別處于不同的進化分支上。藏羚羊HO－1與山羊的HO－1源于同一支，親緣關(guān)系最近，其次是牛。

表2 藏羚羊與其它物種HO－1基因編碼區(qū)及氨基酸序列相似性比較Table 2 .Similarity comparison of HO－1 gene nucleotide and amino acid sequences between Tibetan antelope and other species

表3 藏羚羊與其它物種間HO－1氨基酸差異性分析Table 3 .Difference analysis of the amino acid sites of HO－1 between Tibetan antelope and other species

Figure 3.Phylongenetic tree based on amino sequences of HO－1 from Tibetan antelope and other species.圖3 以氨基酸序列為基礎(chǔ)的藏羚羊及其它物種系統(tǒng)進化樹

由于HO－1具有廣泛的細胞保護效應(yīng)，研究者期望在此次研究的基礎(chǔ)上，通過進一步對藏羚羊適應(yīng)高原低氧高寒相關(guān)基因的研究，能夠更好地理解高原土生動物和世居高原人群在細胞保護性適應(yīng)方面的機制，為在高海拔環(huán)境下生存的人類低氧等損傷性疾病的預(yù)防和治療提供理論依據(jù)。

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