張 霞， 錢 濤， 高維娟， 劉莎莎

(1承德醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室，河北承德067000;2河北化工醫(yī)藥職業(yè)技術(shù)學(xué)院，河北石家莊050026)

腦血管病是神經(jīng)系統(tǒng)常見病、多發(fā)病，其致死率、致殘率均較高，缺血造成了腦組織的損傷，再灌注使可逆性缺血損傷加重，并通過各種反應(yīng)將可逆損傷轉(zhuǎn)化為不可逆損傷。有研究表明，在缺血再灌注損傷時存在一種細胞死亡形式即細胞凋亡，并在缺血/再灌注損傷的病理過程中起著重要作用。同時大量研究表明腦缺血再灌注可以激活c－Jun N端激酶(c－Jun N－terminal kinase，JNK)，而且JNK激活在腦缺血介導(dǎo)的神經(jīng)元凋亡過程中發(fā)揮重要作用［1－2］。因此本研究選擇特異性 JNK抑制劑SP600125和激動劑茴香霉素(anisomycin)，觀察其對腦缺血再灌注后海馬神經(jīng)元caspase－3表達的影響，探討JNK通路在腦缺血再灌注誘導(dǎo)的海馬神經(jīng)元凋亡中的作用。

材料和方法

1 主要試劑

SP600125和anisomycin均購自Enzo;二甲基亞砜(DMSO)購自Sigma。SP600125及anisomycin用10%DMSO溶解配置成20 nmol/L及300 ng/L的貯存液避光于4℃冰箱保存。Caspase－3抗體(用于免疫組化)購自Santa Cruz，DAB顯色劑購自北京中杉試劑公司。抗caspase－3多克隆抗體(用于Western blotting)購自Bioworld;BCA蛋白定量試劑盒購自Solarbio;Trizol reagent購自Invitrogen;隨機上、下游引物和TaqMan熒光探針由大連寶生物公司提供，Premix Ex TaqTM實時熒光定量PCR試劑盒購自大連寶生物公司;原位末端細胞凋亡POD檢測試劑盒購自自Roche。其它試劑為國產(chǎn)分析純。

2 動物及分組

成年SD雄性大鼠90只，清潔級，體重240～280 g，由天津山川紅實實驗動物科技有限公司提供，許可證號為SCXK(津)2009－001。實驗前動物處在同一環(huán)境(室溫22～25℃，避免強光及噪音刺激，足夠的食物和飲水)適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。隨機分為5組:假手術(shù)組、全腦缺血再灌注組、JNK抑制劑組+全腦缺血再灌注組、JNK激動劑組+全腦缺血再灌注組、全腦缺血再灌注組+溶劑對照組。每組12只動物。

3 模型制備

采用改良的四血管閉塞法制作大鼠全腦缺血模型。4%水合氯醛10 mL/kg腹腔麻醉，頸背側(cè)縱切口約1.5 cm，分離頸旁肌暴露第一頸椎橫突，尋找翼狀孔，用直徑0.5 mm的電凝針燒灼其中的椎動脈，造成永久性閉塞，縫合切口，然后分離雙側(cè)頸總動脈并埋線備用，縫合切口。術(shù)后恢復(fù)24 h，選用恢復(fù)良好的動物，用微動脈夾夾閉雙側(cè)頸總動脈造成全腦缺血30 min，然后去除雙側(cè)微動脈夾恢復(fù)血液灌流，以大鼠翻正反射消失、瞳孔散大作為全腦缺血成功的標(biāo)準(zhǔn)，且剔除癲癇發(fā)作大鼠。假手術(shù)組僅暴露雙側(cè)椎動脈及頸總動脈，不凝閉椎動脈，也不予微動脈夾夾閉雙側(cè)頸總動脈。其它組手術(shù)進程同模型組，JNK抑制組、JNK激動劑組以及溶劑對照組的動物在夾閉雙側(cè)頸總動脈前30 min利用大鼠立體定位儀分別側(cè)腦室注射SP600125(SP600125溶于10%DMSO，最終濃度為 20 mmol/L)、anisomycin(anisomycin溶于10%DMSO，最終濃度為300 μg/L)或10%DMSO，各10 μL。藥物在5 min內(nèi)注完，留針2 min。

4 免疫組織化學(xué)法檢測海馬組織caspase－3的表達

取海馬冠狀石蠟切片，采用SP法行免疫組組化學(xué)染色。切片依次脫蠟至水，PBS浸泡5 mim，電磁爐水浴抗原修復(fù)，修復(fù)完后，自然冷卻至室溫;3% H2O2孵育30 min，PBS沖洗5 min，3次，滴加正常山羊封閉血清，室溫孵育30 min，傾去勿洗;滴加1∶100的caspase－3多抗，4℃冰箱過夜;次日37℃溫箱孵育30 min，PBS沖洗5 min，3次，擦干切片周圍水分后，滴加生物素標(biāo)記的Ⅱ抗，37℃溫箱孵育30 min; PBS沖洗5 min，3次，擦干切片周圍水分后，滴加SP復(fù)合物即鏈酶親和素－生物素－過氧化物酶復(fù)合物，37℃溫箱孵育30 min;三蒸水洗5 min，3次，DAB顯色，脫水、透明、封片。每張切片在大腦海馬CA1區(qū)隨機選擇5個400倍視野，通過MiVnt圖像分析系統(tǒng)進行定量分析。

5 Western blotting檢測海馬組織caspase－3蛋白水平

稱取海馬組織，提取總蛋白，BCA法進行蛋白濃度定量，應(yīng)用Western blotting方法對各組大鼠海馬組織的caspase－3蛋白水平進行了檢測。取25 μg樣品，以12%SDS－PAGE電泳分離，分離的蛋白用半干電轉(zhuǎn)移法轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，0.5%脫脂奶粉封閉過夜，抗體孵育(caspase－3Ⅰ抗?jié)舛?∶500孵育2 h)，TBST洗膜3次，然后用兔抗大鼠的Ⅱ抗(濃度1∶5 000)室溫孵育1 h，TBST洗膜后采用ECL發(fā)光液顯色，X射線底片曝光。以β－actin為內(nèi)參照，實驗重復(fù)5次，用Quantity One軟件對蛋白條帶灰度值進行分析。

6 實時熒光定量PCR法檢測海馬組織caspase－3 mRNA表達

?。?0℃保存的海馬組織，Trizol法抽提總RNA，RNA定量后逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。以合成的cDNA為模板，構(gòu)建質(zhì)粒，制備合適的標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒，對其進行10倍倍比稀釋，以103、104、105、106和107拷貝作陽性模板，每個標(biāo)準(zhǔn)品設(shè)2個重復(fù)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。同時應(yīng)用ABI的Primer Express 3.0設(shè)計的引物及帶有5'FAM熒光基團和3'Eclipse淬滅基團的TaqMan水解探針，采用Premix Ex TaqTM實時熒光定量PCR試劑盒一步法檢測各組海馬組織中caspase－3 mRNA表達。25 μL反應(yīng)體系，反應(yīng)條件如下:先95℃60 s，再95℃10 s，60℃30 s，40個循環(huán)，熒光信號監(jiān)測點選在60℃反應(yīng)后單點接收熒光信號。反應(yīng)結(jié)束后獲取循環(huán)閾值(Ct值)，對拷貝數(shù)以10為底取對數(shù)，作為橫坐標(biāo)，Ct值為縱坐標(biāo)，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進行定量，然后進行實驗數(shù)據(jù)分析。

7 TUNEL染色法檢測海馬神經(jīng)細胞凋亡水平

取相應(yīng)的組織玻片常規(guī)脫蠟脫水，經(jīng)蒸餾水浸泡及PBS洗滌后滴加H2O2，37℃烤箱放置40 min后PBS洗滌，滴加蛋白酶K后37℃孵育10 min，PBS洗滌。將凋亡檢測試劑盒中試劑1與試劑2配成TUNEL反應(yīng)混合物，混勻后加在經(jīng)上述處理的切片上，37℃烤箱放置60 min后PBS洗滌，滴加轉(zhuǎn)化劑POD，37℃烤箱放置30 min后洗滌，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，脫水，透明，封片。400倍顯微鏡下觀察，每張切片隨機選取不重疊的5個CA1區(qū)視野，計數(shù)TUNEL陽性細胞數(shù)，取均值為該例計數(shù)結(jié)果。定量分析方法為光鏡下計算凋亡指數(shù)(apoptotic index，AI)。AI=凋亡細胞數(shù)/總細胞數(shù)×100%。

8 統(tǒng)計學(xué)處理

結(jié)果

1 JNK抑制劑與激動劑對海馬組織caspase－3蛋白表達的影響

免疫組織化學(xué)染色顯示，caspase－3陽性表達在細胞質(zhì)內(nèi)。模型組caspase－3表達量最高，與假手術(shù)組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。與模型組相比，JNK抑制劑組caspase－3表達明顯降低(P＜0.05)，而JNK激動劑組caspase－3表達明顯增加(P＜0.05)，溶劑對照組則無明顯差異(P＞0.05)，見圖1。

Figure 1.Effects of JNK inhibitor(SP600125)and agonist(anisomycin)on expression of caspase－3 protein in rat hippocampal tissues after cerebral ischemia－reperfusion(IR)(immunohistochemical staining，×400).±s.n=6.#P＜0.05 vs sham; *P＜0.05 vs cerebral IR.圖1 免疫組織化學(xué)染色檢測JNK抑制劑和激動劑對腦缺血再灌注大鼠海馬組織caspase－3蛋白表達的影響

Western blotting結(jié)果顯示，海馬組織caspase－3蛋白同免疫組化表達變化一致，見圖2。

2 JNK抑制劑與激動劑對海馬組織caspase－3 mRNA的影響

對本實驗中所提取的RNA進行紫外分光光度計檢測，結(jié)果為1.8 ＜A260/A280＜2.0。實時熒光定量PCR結(jié)果顯示，拷貝的范圍在103～107內(nèi)，Ct值和cDNA拷貝數(shù)呈線性關(guān)系，線性關(guān)系較好，說明定量準(zhǔn)確、可靠，見圖3。Caspase－3 mRNA同caspase－3蛋白表達變化一致，見圖4。

3 JNK抑制劑與激動劑對海馬神經(jīng)元凋亡的影響

TUNEL染色結(jié)果顯示，各組海馬神經(jīng)元凋亡情況同免疫組化表達變化一致，見圖5。

討論

Figure 2.Effects of JNK inhibitor(SP600125)and agonist(anisomycin)on expression of caspase－3 protein in rat hippocampal tissues after cerebral ischemia－reperfusion(IR)detected by Western blotting.±s.n=6.#P＜0.05 vs sham;*P＜0.05 vs cerebral IR.圖2 Western blotting檢測JNK抑制劑和激動劑對腦缺血再灌注大鼠海馬組織caspase－3蛋白表達的影響

Figure 3.PCR standard curve for caspase－3 quantification圖3 Caspase－3的標(biāo)準(zhǔn)曲線

Figure 4.Effects of JNK inhibitor(SP600125)and agonist (anisomycin)on expression of caspase－3 mRNA in rat hippocampal tissues after cerebral ischemiareperfusion(IR)detected by real－time PCR.±s.n=6.#P＜0.05 vs sham;*P＜0.05 vs cerebral IR.圖4 JNK抑制劑和激動劑對腦缺血再灌注大鼠海馬組織caspase－3 mRNA表達的影響

Figure 5.Effects of JNK inhibitor(SP600125)and agonist(anisomycin)on apoptosis of rat hippocampal neurons after cerebral ischemia－reperfusion(IR)(TUNEL staining，×400).±s.n=6.#P＜0.05 vs sham;*P＜0.05 vs cerebral IR.圖5 JNK抑制劑和激動劑對腦缺血再灌注大鼠海馬神經(jīng)元凋亡的影響

缺血再灌注損傷最早是于1960年由Jenings首先提出，目前學(xué)者一致認為:缺血再灌注損傷是由多種因素、多種機制交互式作用、相互影響而導(dǎo)致的極其復(fù)雜的病理生理過程。近年來研究發(fā)現(xiàn)缺血再灌注損傷與絲裂原活化蛋白激酶信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路密切相關(guān)［3－4］。絲裂原活化蛋白激酶是細胞內(nèi)的一種絲/蘇氨酸蛋白激酶，它受到刺激后磷酸化而活化。而JNK/SAPK是哺乳類細胞中絲裂原活化蛋白激酶中極為重要一個亞類，逐漸引起普遍的關(guān)注。JNK細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑與腦組織缺血再灌注損傷有密切聯(lián)系［5］。已有研究表明JNK信號通路可被缺血再灌注的應(yīng)激刺激激活［6－7］，而且JNK激活與神經(jīng)元凋亡有關(guān)。國內(nèi)外大量研究表明，JNK在局灶和全腦缺血神經(jīng)元凋亡過程中發(fā)揮了重要作用［8］，腦缺血再灌注的刺激首先激活JNK信號通路模塊中的MAPKKK;繼而激活MAPKK，包括MKK4和MKK7，最后激活JNKs［9］。激活的JNK又可進一步磷酸化其核底物及胞漿底物，促進神經(jīng)元的凋亡。JNK激活后可通過2條途徑發(fā)揮作用:一是上調(diào)促凋亡相關(guān)蛋白的表達從而激活死亡受體凋亡通路，另一條途徑是通過調(diào)節(jié)Bcl－2家族成員的活性參與線粒體介導(dǎo)的細胞凋亡通路，2條途徑最終都可激活caspase－3。通過這2條途徑激活的caspase－3可激活CAD (caspase－activated DNase)，并可切割核DNA修復(fù)酶PARP［poly(ADP－ribose)polymerase］，從而導(dǎo)致核DNA不可復(fù)性的損傷，最終導(dǎo)致細胞凋亡。Caspase－3是半胱氨酸蛋白酶家族中的重要成員，并且在細胞凋亡過程中處于核心地位，凋亡的最后實施是通過它的激活而實現(xiàn)。

本實驗通過應(yīng)用 JNK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路抑制劑SP600125和激動劑anisomycin對全腦缺血再灌注后海馬神經(jīng)元損傷進行干預(yù)，并觀察其對caspase－3蛋白和mRNA的影響，以及海馬神經(jīng)元凋亡的情況，來探究JNK細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在腦缺血再灌注損傷中的機制，從而為臨床上出現(xiàn)的腦缺血再灌注損傷提供新的治療措施。SP600125是一種非常有效的選擇性抑制JNK－1、2、3的抑制劑，通過可逆性競爭ATP抑制JNK的磷酸化，達到抑制JNK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的作用，而anisomycin能通過活化JNK，進一步通過死亡受體通路和線粒體通路，起到促進腦缺血再灌注誘導(dǎo)神經(jīng)元凋亡的作用。經(jīng)本實驗證實，應(yīng)用SP600125對腦缺血再灌注干預(yù)后，由于此細胞轉(zhuǎn)導(dǎo)通路被阻斷，海馬組織的caspase－3蛋白和mRNA較缺血再灌注組明顯下降，凋亡細胞也明顯下降;而應(yīng)用anisomycin對腦缺血再灌注干預(yù)后，由于此細胞轉(zhuǎn)導(dǎo)通路被激活，海馬組織的caspase－3蛋白和mRNA較缺血再灌注組明顯增加，同時凋亡細胞也明顯增加;同時溶劑對照組與缺血再灌注組相比則無明顯變化。由此推測缺血再灌注損傷與JNK激活密切相關(guān)。

總之，JNK通路參與了腦缺血再灌注后的海馬神經(jīng)元凋亡，最終通過促進caspase－3的表達來發(fā)揮促凋亡作用。

［1］ Chang L，Karin M.Manmalian MAP kinase signalling cascades［J］.Nature，2001，10(6824):37－40.

［2］ 王耀岐，李 軍，曹 紅，等.ERK和JNK通路在沙土鼠腦缺血預(yù)處理中的表達及作用［J］.中國藥理學(xué)通報，2006，22(3):337－340.

［3］ King LA，Toledo AH，Rivera－Chavez FA，et al.Role of p38 and JNK in liver ischemia and reperfusion［J］.Hepatobiliary Pancreat Surg，2009，16(6):763－770.

［4］ Li L，Zhang YM，Qiao WL，et al.Role of mitogen－activated protein kinases in the regulation of paraventricular nucleus to gastric ischemia－reperfusion injuries［J］.Chin Med J(Engl)，2007，120(12):1082－1087.

［5］ 王 寧，薛榮亮，姚鳳珍，等.SP600125－JNK抑制劑對大鼠腦缺血再灌注神經(jīng)元的保護作用［J］.第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報，2007，28(20):1838－1841.

［6］ Gu Z，Jiang Q，Zhang G.c－Jun N－terminal kinase activation in hippocampal CA1 region was involved in ischemic injury［J］.Neuroreport，2001，12(5):897－900.

［7］ Tian H，Zhang G，Li H，et al.Antioxidant NAC and AMPA/KA receptor antagonist DNQX inhibited JNK3 activation following global ischemia in rat hippocampus［J］.Neurosci Res，2003，46(2):191－197.

［8］ Irving EA，Bamford M.Role of mitogen－and stress－activated kinases in ischemic injury［J］.J Cereb Blood Flow Metab，2002，22(6):631－647.

［9］ Brunet A，Pouysségur J.Mammalian MAP kinase modules: how to transduce specific signals［J］.Essays Biochem，1997，32:1－16.