余 勤， 林 潔， 劉麗珍， 王 艷， 宣曉波， 王 標， 單 威， 周麗萍， 劉 偉

(浙江中醫(yī)藥大學1生物工程學院，3第一臨床醫(yī)學院，浙江杭州310053; 2浙江大學醫(yī)學院附屬第一醫(yī)院骨髓移植中心，浙江杭州310003)

缺氧缺血性腦損傷(hypoxia－ischemia brain damage，HIBD)是嚴重威脅現(xiàn)代人健康的一大類疾病，死亡率和致殘率高。間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cells，MSCs)移植是修復缺氧缺血性腦損傷頗具前景的治療方法。MSCs可在特定條件下誘導分化為神經(jīng)元樣細胞和神經(jīng)膠質(zhì)細胞［1］。我們前期研究結(jié)果中也顯示，大鼠間充質(zhì)干細胞移植到缺氧缺血性腦損傷大鼠腦內(nèi)可存活、遷移，并可明顯改善大鼠的學習、記憶能力［2］。但是目前對外源性間充質(zhì)干細胞移植治療腦損傷的確切機制尚不明確，治療效率問題有待解決。

對于MSCs移植后修復腦損傷的研究，目前認為與基質(zhì)細胞衍生因子－1(stromal cell－derived factor－1，SDF－1)/CXC趨化因子受體4(CXC chemokine receptor 4，CXCR4)軸有關。SDF－1和CXCR4廣泛地表達于多種組織和細胞中，體內(nèi)SDF－1和CXCR4基因敲除將導致小鼠小腦、胃腸道和造血系統(tǒng)發(fā)育異常而至胚胎早期死亡［3］。在MSCs誘導向成骨細胞分化過程中，阻斷SDF－1/CXCR4信號可抑制骨形態(tài)發(fā)生蛋白2(bone morphogenetic protein 2，BMP2)誘導的成骨分化［3］。由此我們推測，SDF－1/CXCR4不僅參與干細胞的遷移，其在干細胞分化、組織器官發(fā)生及再生中也可能發(fā)揮著重要作用。

本研究旨在探討SDF－1/CXCR4軸在MSCs定向分化中的作用，明確MSCs體內(nèi)輸注后修復腦損傷的確切機制，以提高MSCs治療的靶向性和高效性。

材料和方法

1 動物

大鼠間充質(zhì)干細胞(rat mesenchymal stem cells，rMSCs)培養(yǎng)的骨髓供體為健康SD大鼠，體重(100 ±10)g，雄性，清潔級;用于HIBD模型的動物為健康幼年SD大鼠(4周齡左右)，體重(80±10)g，雄性，清潔級;均購于浙江中醫(yī)藥大學實驗動物中心。

2 主要試劑與儀器

DMEM/F12 1∶1培養(yǎng)基(Invitrogen)，胎牛血清(FBS，Gibco)，1%O2、5%CO2和94%N2混合氣及8%O2和92%N2混合氣(杭州特種氣公司)，β－巰基乙醇(Sigma)，小鼠抗神經(jīng)元特異性烯醇化酶(neuron－specific enolase，NSE;Enzo Life Sciences)，兔抗SDF－1α(BioVision)，兔抗CXCR4(BioVision)，兔抗膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP;博士德產(chǎn)品)，鼠源SDF－1α(Peprotech)，Mozobil(AMD3100，Sigma)，細胞計數(shù)試劑盒－8(Cell Counting Kit－8，凱基生物產(chǎn)品)。FACSCalibur型流式細胞儀(BD)，Transwell小室(Greiner Bio－One)，低氧培養(yǎng)盒(長沙長錦科技有限公司)。

3 主要方法

3.1 rMSCs的體外培養(yǎng)及低氧培養(yǎng) 取健康SD青年雄性大鼠，脫頸椎處死，無菌條件下取出股骨和脛骨，清除附著的肌肉組織，暴露骨骺端，用5 mL含10%胎牛血清的DMEM/F12 1∶1培養(yǎng)基沖出骨髓，離心后制成單細胞懸液，接種于一次性塑料培養(yǎng)瓶中，置CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。低氧培養(yǎng)時，將70%～80%融合的細胞置于密封的低氧培養(yǎng)盒中，用低氧混合氣(1%O2、5%CO2和94%N2)平衡10 min (1 L/min)，然后轉(zhuǎn)移到37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)。3.2 AMD3100和SDF－1α對rMSCs生長抑制的影響檢測 取對數(shù)生長期的rMSCs，經(jīng)0.25%胰酶－1mmol/L EDTA消化，計數(shù)，用含10 μg/L、100 μg/L SDF－1α和5 mg/L AMD3100的DMEM/F－12培養(yǎng)液分別制備細胞懸液，96孔培養(yǎng)板中每孔接種200 μL濃度為2.5×107/L的細胞懸液，加入20 μL Cell Counting Kit－8中的溶液，37℃、5%CO2、飽和濕度下培養(yǎng)2 h。570 nm和630 nm雙波長檢測各組吸光度(A570和A630);終吸光度(A)=A570－A630。計算細胞生長抑制率(cell growth inhibitory rate，IR)，IR (%)=A對照組－A處理組/A對照組×100%。

3.3 HIBD動物模型的建立 4周齡雄性SD大鼠麻醉后，頸部備皮、消毒，剪開頸正中皮膚2～3 cm，分離皮下脂肪，于胸鎖乳突肌深部分離左頸總動脈，用5/0絲線結(jié)扎血管兩端(相互間隔一定距離)，縫合切口。術(shù)后將麻醉未醒的大鼠放回原籠中休息2～3 h，蘇醒后置于通以8%O2和92%N2混合氣體的密閉容器中，以1.5～2 L/min的流量持續(xù)通氣2.5 h制成HIBD動物模型。

3.4 RT－PCR檢測 細胞樣本用Trizol提取法抽提總RNA，海馬組織樣本則在生物安全柜內(nèi)根據(jù)大鼠腦部結(jié)構(gòu)將海馬部剝離，液氮凍存海馬組織約25 mg，用時在液氮下用研缽、研杵(泡酸后清洗干凈，180℃烘烤2 h以上以去除RNA酶，備用)搗碎研磨，待液氮揮發(fā)后，加1 mL Trizol試劑，充分研磨直至試劑由結(jié)冰狀態(tài)變?yōu)槌吻逡后w，液體澄清后立即移至1.5 mL離心管中，進行RNA定量，每個樣品各取RNA 1.0 μg，進行逆轉(zhuǎn)錄(根據(jù)TaKaRa公司PrimeScriptTMRT－PCR Kit試劑盒說明書進行操作)，反應條件為37℃20 min，85℃5 s;PCR聚合酶鏈式反應根據(jù)Promega公司PCR Master Mix試劑盒說明書進行操作，反應條件為95℃ 2 min，58℃ 30 s，72℃ 5 min，30個循環(huán)。SDF－1α上游引物 5’－TCTTTGGCCTCCTGTAGAATGG－3’，下游引物5’－TCACGGCAAGATTCTGGCTTA－3’，產(chǎn)物240 bp; CXCR4上游引物 5’－AGCAGGTAGCAGTGACCCTCTGA－3’，下游引物5’－GAAGCAGGGTTCCTTGTTGGAGT－3’，產(chǎn)物149 bp;β－actin上游引物5’－GAACCCTAAGGCCAACC－3’，下游引物5’－TGTCACGCACGATTTCC－3’，產(chǎn)物371 bp。

3.5 Western blotting檢測 細胞樣本于冰上融化，加入細胞裂解液振蕩均勻，海馬組織制備操作步驟同RT－PCR檢測準備步驟，組織冰上研磨后加裂解液，4℃、14 000×g，離心20 min，取上清，BCA法蛋白定量。取100 μg蛋白樣品進行SDS聚丙烯酰胺凝膠(SDS－PAGE)電泳，再用電轉(zhuǎn)移到PVDF膜上; 5%脫脂奶封閉2 h后，加入Ⅰ抗(CXCR4 1∶1 000、SDF－1α 1∶200、NSE 1∶100和GFAP 1∶100)，4℃孵育過夜;TBST液洗滌3次，加入辣根過氧化物酶標記的Ⅱ抗室溫孵育1 h;TBST液洗滌3次;在暗室將ECL發(fā)光劑加在膜上，X線膠片曝光，常規(guī)方法定影。

3.6 流式細胞術(shù)檢測rMSCs CXCR4的表達 細胞樣本用0.25%胰酶+1 mmol/L EDTA消化，細胞計數(shù)，使每例樣本的細胞數(shù)為1×106個;細胞重懸于5 mL PBS中洗滌，1 500 r/min離心8 min;棄去上清，加100 μL PBS重懸，與CXCR4Ⅰ抗孵育液(Ⅰ抗稀釋度為1∶1 000)常溫下孵育30 min;PBS洗滌2次(1 500 r/min離心8 min)，加100 μL PBS重懸，與PE－Ⅱ抗(稀釋度為1∶1 000)4℃避光孵育30 min; PBS洗滌2次后(1 500 r/min離心8 min)，棄去PBS，再加入400 μL 1%多聚甲醛重懸細胞，用流式細胞儀分析。

3.7 rMSCs誘導向神經(jīng)細胞分化 當rMSCs爬片接近70% 融合狀態(tài)時，用含1 mmol/L β－巰基乙醇的DMEM/F12(20%FBS)預誘導24 h，更換培養(yǎng)液，PBS洗滌3次，再加入含5 mmol/L β－巰基乙醇的無血清DMEM/F12誘導3～6 h，光鏡下觀察細胞形態(tài)變化。

3.8 免疫細胞化學鑒定細胞分化 分化后的細胞爬片用4%多聚甲醛固定15 min，Ⅰ抗(NSE 1∶500，GFAP 1∶100)4℃孵育過夜，PBS(含0.05%Tween 20)沖洗，Ⅱ抗?jié)窈兄蟹跤?0 min，PBS沖洗，5 min× 3次，DAB顯色，蒸餾水沖洗以終止反應。隨機計數(shù)相應時點20個視野中陽性細胞，計算平均值。

4 統(tǒng)計學處理

結(jié)果

1 AMD3100和SDF－1α對rMSCs生長抑制的影響

5 mg/L AMD3100、10 μg/L和100 μg/L SDF－1α作用于rMSCs的IR均小于5%，見表1，表明它們對rMSCs的生長均無顯著抑制作用。

表1 各處理組的細胞生長抑制率Table 1 .The inhibitory rates(IR)of cell growth in different groups(%.±s.n=3)

表1 各處理組的細胞生長抑制率Table 1 .The inhibitory rates(IR)of cell growth in different groups(%.±s.n=3)

?

2 低氧對rMSCs中CXCR4表達的影響

rMSCs低氧6 h與12 h CXCR4 mRNA表達水平均較0 h組明顯增加(P＜0.01)，在24 h顯著減小(P＜0.05)，48 h和72 h時CXCR4 mRNA的轉(zhuǎn)錄水平降低，見圖1A;rMSCs低氧各時點CXCR4蛋白表達水平均較0 h組增加，其中低氧6 h CXCR4蛋白表達增加最為顯著(P＜0.01)，12 h和24 h組與0 h組比較CXCR4蛋白表達增加有顯著差異(P＜0.05)，見圖1B;rMSCs低氧培養(yǎng)6 h、12 h、24 h、48 h、72 h，流式細胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，低氧培養(yǎng)各時點rMSCs表面受體CXCR4表達均較對照組增加(P＜0.05)，見圖1C。

Figure 1.Hypoxia elevated the CXCR4 expression in rMSCs.A:mRNA expression detected by RT－PCR;B:protein expression detected by Western blotting;C:protein expression detected by flow cytometry.±s.n=3.#P＜0.05，##P＜0.01 vs control (0 h).圖1 缺氧促進rMSCs CXCR4的表達

3 SDF－1α及AMD3100對rMSCs中CXCR4表達的影響

10 μg/L SDF－1α處理rMSCs 2 d和5 mg/L AMD3100處理rMSCs 3 d后，RT－PCR、Western blotting及流式細胞術(shù)檢測CXCR4表達水平的結(jié)果顯示，SDF－1α處理后CXCR4 mRNA表達明顯增加(P＜0.05)，AMD3100處理后CXCR4 mRNA表達較對照組顯著下降(P＜0.05)，見圖2A;Western blotting及流式細胞術(shù)檢測結(jié)果與CXCR4 mRNA表達的趨勢一致，見圖2B、2C。

4 海馬組織中SDF－1α的表達

大鼠造模后1 d、3 d、5 d、7 d、14 d、21 d，各實驗組海馬組織SDF－1α mRNA和蛋白表達均較正常組有明顯增加，7 d時增加最為顯著(P＜0.01)，之后表達回落，持續(xù)到21 d仍有穩(wěn)定表達，見圖3。

Figure 2.SDF－1α augmented the expression of CXCR4 in rMSCs.A:mRNA expression detected by RT－PCR;B:protein expression detected by Western blotting;C:protein expression detected by flow cytometry.±s.n=3.*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs control.圖2 SDF－1α促進rMSCs CXCR4的表達

Figure 3.SDF－1α mRNA(A)and protein(B)expression changed in hippocampus tissues of HIBD rats.±s.n=3.#P＜0.05，##P＜0.01 vs control(0 d)group.圖3 缺血缺氧大鼠海馬組織SDF－1α表達的變化

5 免疫細胞化學鑒定細胞分化

正常rMSCs、AMD3100拮抗后的rMSCs經(jīng)誘導向神經(jīng)細胞分化，再用免疫細胞化學鑒定細胞分化，結(jié)果顯示，AMD3100拮抗后的分化細胞 NSE和GFAP陽性表達的細胞數(shù)明顯較正常分化的細胞少，見圖4。隨機計數(shù)相應時點20個視野中陽性細胞，計算平均值，見表2。

Figure 4.The expression of neural－specific markers in different groups(immunocytochemical staining，×200).圖4 不同處理組神經(jīng)特異性標志物的表達

表2 rMSCs神經(jīng)分化中NSE和GFAP陽性細胞數(shù)比較Table 2 .Comparison of NSE and GFAP positive cell numbers of rMSCs in neural differentiation(±s.n=3)

表2 rMSCs神經(jīng)分化中NSE和GFAP陽性細胞數(shù)比較Table 2 .Comparison of NSE and GFAP positive cell numbers of rMSCs in neural differentiation(±s.n=3)

*P＜0.05 vs AMD3100(－).

?

討論

腦缺氧缺血是造成神經(jīng)功能缺損的常見原因，其誘導的腦損傷是一種彌漫性、進行性的神經(jīng)元壞死和神經(jīng)元程序性死亡。腦缺氧缺血損傷治療的關鍵在于挽救缺血半暗帶區(qū)瀕臨死亡的神經(jīng)元和促進損傷后神經(jīng)功能的恢復。目前治療主要是應用多種腦細胞活性藥物抑制腦細胞凋亡，但對已壞死的腦細胞則無作用。因此通過細胞移植使得損傷的腦組織及腦神經(jīng)得到重建，改善腦功能，已成為該病治療一個新的研究熱點。間充質(zhì)干細胞是具有多向分化潛能的成體干細胞［5］，在一定條件下能夠分化為多種中胚層和神經(jīng)外胚層發(fā)育來源的細胞［6］。Kopen等［7］將MSCs注入新生小鼠的側(cè)腦室，發(fā)現(xiàn)MSCs遷移遍及整個前腦和小腦，在紋狀體和海馬中MSCs表達GFAP，提示其已經(jīng)分化為星形膠質(zhì)細胞;在嗅覺小島、嗅球、小腦的內(nèi)顆粒層發(fā)現(xiàn)大量的MSCs，其不但表達巢蛋白(nestein)，還表達神經(jīng)元的特異性表面標記NSE、神經(jīng)元特異性核蛋白和神經(jīng)元中絲蛋白，提示已經(jīng)分化為神經(jīng)元。另有研究顯示rMSCs移植可改善缺氧缺血性腦損傷大鼠腦部功能損傷［2］。由此，利用MSCs替代原來受損或功能缺陷的神經(jīng)組織治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病是一種頗具前景的治療方法［8－9］。但是，在外源性MSCs移植治療中，由于修復的確切機制尚未明確，使得治療效率問題尚未真正得到解決。本課題旨在研究移植MSCs向神經(jīng)細胞分化的確切機理，以提高MSCs治療的靶向性和高效性。

SDF－1是為數(shù)不多的表達于腦組織中的趨化因子之一，在正常神經(jīng)系統(tǒng)中SDF－1量維持在較低水平，不發(fā)揮遷移趨化作用，主要由星形膠質(zhì)細胞和神經(jīng)元表達［10］。當中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)生炎癥、缺血和低氧等病變后，可引起SDF－1水平的上調(diào)，趨化血液系統(tǒng)中的單核/巨噬細胞向損傷區(qū)遷移并發(fā)揮相應生物學效應。本研究對HIBD大鼠海馬組織中的SDF－1α的表達變化進行了檢測，結(jié)果顯示SDF－1α mRNA及蛋白的表達均隨低氧時間逐漸增加，7 d時達到頂峰持續(xù)到21 d仍有穩(wěn)定表達，且較對照組表達明顯，提示HIBD大鼠腦中的SDF－1表達增加。

由于體外擴增的MSCs表面CXCR4的表達率要顯著低于骨髓中MSCs表達的CXCR4［11］。我們的實驗中用10 μg/L SDF－1α與rMSCs共孵育2 d，RT－PCR及Western免疫印跡結(jié)果顯示，SDF－1α處理組中CXCR4 mRNA及蛋白的表達均顯著增加，流式細胞術(shù)檢測也顯示rMSCs表面受體CXCR4表達率上升明顯。細胞表面CXCR4表達增加驗證了微小劑量的SDF－1α可誘導胞內(nèi)CXCR4向細胞表面轉(zhuǎn)移的假設，使SDF－1/CXCR4軸介導的細胞生物學效應增強。

由于體內(nèi)環(huán)境的氧濃度明顯低于體外，外源輸入的MSCs處于低氧狀態(tài)，實驗研究表面持續(xù)性低氧對MSCs增殖沒有抑制作用且具有促進作用［12－13］。同時本實驗同時發(fā)現(xiàn)，rMSCs缺氧6 h與12 h CXCR4 mRNA轉(zhuǎn)錄水平均較常氧組明顯增加(P＜ 0.01)，24 h顯著減小。rMSCs低氧各時點CXCR4蛋白表達水平均較常氧組增加，其中低氧6 h CXCR4蛋白表達上調(diào)最為顯著，其它組與常氧組有顯著差異。另外，流式細胞術(shù)檢測進一步證實了rMSCs低氧培養(yǎng)時CXCR4表達增加這一結(jié)論，提示低氧環(huán)境不僅有助于細胞生長，且能提高SDF－1α的特異性受體CXCR4的表達。

以上結(jié)果提示在MSCs修復缺氧缺血性腦損傷中，低氧能形成適合干細胞生長的環(huán)境且使MSCs表面的CXCR4表達增加，同時促進腦內(nèi)微環(huán)境中SDF－1表達增加，進而加強了SDF－1/CXCR4軸的生物學關聯(lián)。

而SDF－1/CXCR4軸在干細胞分化、組織器官發(fā)生及再生中也有重要作用。在MSCs誘導向成骨細胞分化過程中，SDF－1通過細胞內(nèi)蛋白Smad和MAPK信號通路促進BMP2表達并誘導MSCs向成骨分化［4］。在神經(jīng)發(fā)育的過程中，SDF－1是參與神經(jīng)發(fā)育的重要蛋白，SDF－1/CXCR4信號通路在神經(jīng)細胞生長、增殖、遷移、軸突形成等過程中均有重要作用。由此我們假設SDF－1/CXCR4軸可能在調(diào)控MSCs分裂增殖、啟動向神經(jīng)細胞分化以及軸突的形成過程有關，但是目前對SDF－1/CXCR4軸對MSCs增殖和分化的影響及其機制尚不明確。本實驗用 SDF－1α特異性受體 CXCR4的拮抗劑AMD3100處理MSCs后進行體外神經(jīng)分化誘導，比較其與正常rMSCs神經(jīng)分化率的變化。實驗結(jié)果表明，在免疫細胞化學鑒定中，AMD3100拮抗后的rMSCs分化后NSE和GFAP陽性表達的細胞數(shù)較正常rMSCs明顯較少。

綜上所述，MSCs修復缺氧缺血性腦損傷中，腦部的低氧狀態(tài)能為MSCs提供適合存活的環(huán)境，并且使MSCs表面的CXCR4表達增加，同時缺血缺氧環(huán)境能促進腦內(nèi)微環(huán)境中SDF－1表達的增加，進而加強SDF－1/CXCR4軸的生物學效應，而MSCs在表面受體CXCR4被拮抗的情況下向神經(jīng)分化的能力下降，表明SDF－1/CXCR4軸具有調(diào)控rMSCs神經(jīng)分化的作用，在rMSCs移植治療缺氧缺血性腦損傷中具有重要意義。

［1］ Qi X，Shao M，Peng H，et al.In vitro differentiation of bone marrow stromal cells into neurons and glial cells and differential protein expression in a two－compartment bone marrow stromal cell/neuron co－culture system［J］.J Clin Neurosci，2010，17(7):908－913.

［2］ 余 勤，王 艷，連俊蘭，等.大鼠骨髓間質(zhì)干細胞修復缺氧/缺血性腦損傷的研究［J］.中國中西醫(yī)結(jié)合急救雜志，2009，16(1):34－37.

［3］ Zou YR，Kottmann AH，Kuroda M，et al.Function of the chemokine receptor CXCR4 in hematopoiesis and in cerebellar development［J］.Nature，1998，393(6685):595－599.

［4］ Hosogane N，Huang Z，Rawlins BA，et al.Stromal derived factor－1 regulates bone morphogenetic protein 2－induced osteogenic differentiation of primary mesenchymal stem cells［J］.Int J Biochem Cell Biol，2010，42(7): 1132－1141.

［5］ Penny J，Harris P，Shakesheff KM，et al.The biology of equine mesenchymal stem cells:phenotypic characterization，cell surface markers and multilineage differentiation［J］.Front Biosci，2012，17:892－908.

［6］ Aldahmash A，Zaher W，Al－Nbaheen M，et al.Human stromal(mesenchymal)stem cells:basic biology and current clinical use for tissue regeneration［J］.Ann Saudi Med，2012，32(1):68－77.

［7］ Kopen GC，Prockop DJ，Phinney DG.Marrow stromal cells migrate throughout forebrain and cerebellum，and they differentiate into astrocytes after injection into neonatal mouse brains［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，1999，96(19):10711－10716.

［8］ Siniscalco D，Giordano C，Galderisi U，et al.Long－lasting effects of human mesenchymal stem cell systemic administration on pain－like behaviors，cellular，and biomolecular modifications in neuropathic mice［J］.Front Integr Neurosci，2011，5:79.

［9］ Chang YK，Chen MH，Chiang YH，et al.Mesenchymal stem cell transplantation ameliorates motor function deterioration of spinocerebellar ataxia by rescuing cerebellar Purkinje cells［J］.J Biomed Sci，2011，18:54.

［10］ Merino JJ，Gutiérrez－Fernández M，Rodríguez－Frutos B，et al.CXCR4/SDF－1α－chemokine regulates neurogenesis and/or angiogenesis within the vascular niche of ischemic rats;however，does SDF－1α play a role in repair?［J］.Int J Stroke，2011，6(5):466－467.

［11］ Honczarenko M，Le Y，Swierkowski M，et al.Human bone marrow stromal cells express a distinct set of biologically functional chemokine receptors［J］.Stem Cells，2006，24(4):1030－1041.

［12］ Peterson KM，Aly A，Lerman A，et al.Improved survival of mesenchymal stromal cell after hypoxia preconditioning: role of oxidative stress［J］.Life Sci，2011，88(1－2): 65－73.

［13］ Chacko SM，Ahmed S，Selvendiran K，et al.Hypoxic preconditioning induces the expression of prosurvival and proangiogenic markers in mesenchymal stem cells［J］.Am J Physiol Cell Physiol，2010，299(6):C1562－C1570.