盧彥珍， 張翠英， 張麗麗， 宋 娟， 賈建桃

(長治醫(yī)學(xué)院1病理生理學(xué)教研室，2生理學(xué)教研室，山西長治046000)

載脂蛋白E(apolipoprotein E，ApoE)是低密度脂蛋白受體(low－density lipoprotein receptor，LDLr)與肝細胞乳糜微粒殘粒受體的配體，主要介導(dǎo)血漿脂蛋白特別是乳糜微粒和低密度脂蛋白的代謝與清除，ApoE缺乏則會導(dǎo)致血液循環(huán)中富含膽固醇的物質(zhì)增加。在ApoE基因敲除(ApoE－/－)的小鼠模型中，由于血漿中脂質(zhì)代謝障礙，聚集的脂質(zhì)被巨噬細胞吞噬后能夠誘導(dǎo)巨噬細胞轉(zhuǎn)化為泡沫樣細胞，出現(xiàn)早期動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)斑塊的特征性改變［1］。

脂質(zhì)攝入和流出的不平衡是脂質(zhì)在巨噬細胞內(nèi)聚集的一個重要原因［2］。ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運蛋白A1 (ATP－binding cassette transporter A1，ABCA1)和G1 (ATP－binding cassette transporter G1，ABCG1)分別負責(zé)把細胞內(nèi)的脂質(zhì)轉(zhuǎn)運至細胞外的載脂蛋白A－I (apolipoprotein A－I，ApoA－I)和高密度脂蛋白(high－density lipoprotein，HDL)，在維持細胞內(nèi)膽固醇的動態(tài)平衡，進而阻止脂質(zhì)在巨噬細胞內(nèi)的聚集中發(fā)揮著重要作用［3－4］。因此，促進膽固醇流出已成為防治AS的靶點之一。本研究旨在通過觀察ApoE在巨噬細胞膽固醇流出中的作用，及其對膽固醇流出過程中ABCA1和ABCG1表達水平的調(diào)節(jié)，探討ApoE調(diào)節(jié)膽固醇流出的機制。

材料和方法

1 材料與試劑

RAW 264.7細胞系購自ATCC細胞庫，DMEM粉末培養(yǎng)基、新生牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)和雙抗均購自Gibco。［1，2－3H(N)］－膽固醇購自PerkinElmer，人ApoA－I、HDL、牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)及 RIPA細胞裂解液均購自Sigma。ABCA1、ABCG1和β－actinⅠ抗及辣根過氧化物酶結(jié)合的Ⅱ抗購自Santa Cruz。高脂飼料購自北京科澳協(xié)力有限公司，含脂肪15%，膽固醇1.25%。游離膽固醇(free chol esterol，F(xiàn)C)和總膽固醇(total cholesterol，TC)檢測試劑盒購自普利萊基因技術(shù)有限公司。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自TaKaRa，實時熒光定量PCR試劑購自ABI，BCA蛋白定量試劑購自Pierce。

2 方法

2.1 動物及脂蛋白分離 10只12周齡雄性ApoE－/－小鼠購自北京大學(xué)實驗動物中心，10只12周齡雄性LDLr基因敲除(LDLr－/－)小鼠購自南京大學(xué)模型動物研究所。所有實驗動物高脂飲食喂養(yǎng)4 d，禁食12 h后收集血漿，然后用兩步密度梯度離心法分離血漿低密度脂蛋白(low－density lipoprotein，LDL)［5］。分離得到的LDL經(jīng)透析、過濾除菌和濃縮后，用聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒定其純度，并用BCA法檢測蛋白濃度。

2.2 透射電鏡技術(shù)檢測脂蛋白在巨噬細胞內(nèi)的聚集 分別用20 mg/L LDLr－/－小鼠脂蛋白、ApoE－/－小鼠脂蛋白和單純培養(yǎng)基處理生長在6孔板中的細胞，48 h后更換為不含任何脂蛋白的培養(yǎng)基平衡12 h。用二甲胂酸緩沖液洗滌細胞，將細胞收集至離心管中離心，吸棄上清后，沿管壁緩慢加入2.5%戊二醛固定液，使細胞團塊懸浮在固定液中，固定30 min，用二甲胂酸緩沖液充分洗滌后，加入1%四氧化鋨進行2次固定，對2次固定后的細胞團塊脫水，用環(huán)氧樹脂包埋后切60 nm薄片，用醋酸鈾和檸檬酸鉛雙染色后鏡下掃描。

2.3 細胞內(nèi)脂質(zhì)含量的檢測 細胞處理方法同上，用不含任何脂蛋白的培養(yǎng)基平衡12 h后，用PBS洗滌細胞2次，每孔細胞中加入1 mL蒸餾水，將細胞收集至離心管中。超聲破碎細胞，取10 μL用于蛋白濃度檢測，取500 μL樣品至15 mL離心管中，加入2 mL氯仿和甲醇混合物(2∶1)，充分振蕩混勻后，離心分層溶液，轉(zhuǎn)移1 mL下層溶液至另一離心管中進行真空干燥，用100 μL含10%Triton X－100的異丙醇溶解脂質(zhì)沉淀。然后根據(jù)FC和TC的檢測試劑盒的操作流程，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算細胞FC和TC的含量，膽固醇酯(cholesterol ester，CE)的含量為TC與FC之差，即CE=TC－FC。

2.4 液閃儀技術(shù)檢測膽固醇流出變化 膽固醇流出實驗操作過程參考其它實驗室已經(jīng)建立的方法，并進行了如下調(diào)整［6］:以4×104cells/well的密度將Raw 264.7接種至24孔板，每組設(shè)3個復(fù)孔，接種后第2 d，用濃度為18.5×107Bq/L的［1，2－3H(N)］－cholesterol標(biāo)記細胞。［1，2－3H(N)］－cholesterol用含0.5%FBS的DMEM稀釋，每孔加300 μL，然后再加入終濃度為20 mg/L LDLr－/－小鼠或ApoE－/－小鼠脂蛋白;標(biāo)記24 h后，用含有0.2%BSA的DMEM洗滌細胞2次，不含BSA的DMEM洗滌1次，然后用不含BSA的DMEM，或者含終濃度為20 mg/L ApoA－I或者HDL的DMEM繼續(xù)孵育細胞;孵育2 h后收集培養(yǎng)上清至離心管中，離心除去細胞碎片;細胞則用預(yù)冷的PBS洗滌2次，然后用0.5 mol/ L NaOH裂解;將細胞上清液和裂解液轉(zhuǎn)移至閃爍瓶中，加入適當(dāng)比例的閃爍液(比例至少為1∶10)，充分混勻后用液體閃爍儀計數(shù);膽固醇流出用細胞上清液中的計數(shù)除以總計數(shù)(上清液和細胞裂解液計數(shù)的總和)表示。ApoA－I或者HDL介導(dǎo)的膽固醇流出以含有ApoA－I或HDL的膽固醇流出值減去不含ApoA－I或HDL的膽固醇流出值表示。

2.5 Western blotting檢測ABCA1和ABCG1在3組中的表達變化 脂蛋白處理細胞6 h后吸棄培養(yǎng)基，用PBS洗滌細胞1次，每孔細胞加入預(yù)冷的RIPA裂解液［含50 mmol/L Tris－HCl(pH 7.4)，150 mmol/L NaCl，0.25% 脫氧膽酸鈉(Na－deoxycholate)，1% NP40，1 mmol/L苯甲基磺酰氟(PMSF)，1×蛋白酶抑制劑混合物(protease inhibitor cocktail)］，冰上裂解5 min后收集細胞至離心管中，全速離心10 min后轉(zhuǎn)移上清至另一離心管，并采用BCA法測定蛋白濃度。用蛋白上樣緩沖液處理樣品后取等量蛋白上樣，待蛋白充分分離后，將SDS－PAGE膠中的蛋白電轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯(polyvinylidene fluoride，PVDF)膜上。然后將PVDF膜順次置于含5%脫脂奶粉的TBST(20 mmol/L Tris－HCl，150 mmol/L NaCl，0.1%Tween 20)中室溫封閉1h，封閉液稀釋的ABCA1和ABCG1Ⅰ抗(1∶1 000)中4℃過夜，之后用TBST清洗10 min×3次，在封閉液稀釋的Ⅱ抗(1∶5 000)中室溫孵育1 h，TBST清洗15 min×3次后與ECL反應(yīng)1 min，置于X線膠片暗盒中顯影，根據(jù)蛋白表達的情況決定曝光時間。然后用洗脫液洗脫上述PVDF膜上的蛋白顯影信號，重新封閉后，用含βactin的Ⅰ抗(1∶5 000)4℃孵育過夜，并按照上述過程進行顯影，作為上樣參照。顯影結(jié)果用Bio－Rad公司提供的Quantity One軟件測定蛋白條帶的光密度進行定量分析。

2.6 實時定量RT－PCR技術(shù)檢測ABCA1和ABCG1在3組中的表達變化 脂蛋白處理細胞6 h后吸棄培養(yǎng)基，每孔細胞加入1 mL Trizol試劑，按照操作說明提取細胞總RNA，經(jīng)NanoDrop檢測RNA濃度和純度。取400 ng總RNA用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，按照操作說明，將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。目的基因ABCA1和ABCG1擴增時，分別稀釋cDNA至10 mg/L和1 mg/L作為擴增ABCA1、ABCG1和內(nèi)參照GAPDH的模板，按照實時熒光定量PCR試劑和ABIPRISM?7900HT的操作說明進行實時定量PCR反應(yīng)?？偡磻?yīng)體系為10 μL，包括2×SYBR? Premix Ex TaqTMII 5 μL，10 μmol/L引物0.8 μL，模板1 μL，DEPC水3.2 μL。反應(yīng)條件為:95℃ 30 s;95℃ 5 s，60℃ 30 s，40個循環(huán);72℃ 30 s。利用Sequence Detection System(SDS)Software 2.4對實驗數(shù)據(jù)進行分析，計算ABCA1和ABCG1相對于內(nèi)參照GAPDH的表達量。實驗中使用的引物分別為:ABCA1上游引物5’－AACATGGACATCCTGAAGCC－3’，下游引物5’－ATGTCGCTCCAGCTCTTTGT－3’;ABCG1上游引物5’－TCAACAGTGGAGAGCTGGTG－3’，下游引物5’－TGAACAGTGAGGTGAGGCAG－3’。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

結(jié)果

1 ApoE－/－小鼠脂蛋白在巨噬細胞內(nèi)聚集

透射電鏡顯示，與對照組相比，用LDLr－/－小鼠脂蛋白處理后細胞內(nèi)脂滴數(shù)量及體積并未明顯改變，但是用ApoE－/－小鼠脂蛋白處理48 h后，細胞內(nèi)脂滴數(shù)量明顯增加，脂滴體積明顯增大，提示用ApoE－/－小鼠脂蛋白處理后，巨噬細胞已經(jīng)呈現(xiàn)泡沫樣變化，見圖1。

Figure 1.The accumulation of ApoE－/－mouse lipoprotein in macrophages.圖1 ApoE－/－小鼠脂蛋白在巨噬細胞內(nèi)的聚集

圖2所示，與對照組相比，用LDLr－/－小鼠脂蛋白處理后細胞內(nèi)脂質(zhì)含量并未明顯改變，但是用ApoE－/－小鼠脂蛋白處理48 h后，細胞內(nèi)CE增加了60%;細胞內(nèi)FC含量無明顯變化。

Figure 2.The accumulation of ApoE－/－mouse lipoprotein in macrophages.A:cholesterol ester;B:free cholesterol.±s.n=3.*P＜0.05 vs control group.圖2 ApoE－/－小鼠脂蛋白在巨噬細胞內(nèi)的聚集

2 ApoE－/－小鼠脂蛋白降低巨噬細胞膽固醇流出

圖3所示，與LDLr－/－小鼠脂蛋白處理組相比，用ApoE－/－小鼠脂蛋白處理后，巨噬細胞膽固醇流出至ApoA－I和HDL的量均明顯降低，表明ApoE－/－小鼠脂蛋白在巨噬細胞內(nèi)的聚集與膽固醇流出降低有關(guān)。

Figure 3.Cholesterol efflux mediated by ABCA1(A)and ABCG1(B).±s.n=3*P＜0.05 vs LDLr－/－group.圖3ABCA1和ABCG1介導(dǎo)的膽固醇流出

3 ApoE－/－小鼠脂蛋白降低ABCA1和ABCG1的蛋白表達

如圖4所示，與對照組相比，LDLr－/－小鼠脂蛋白和ApoE－/－小鼠脂蛋白處理顯著增加ABCA1和 ABCG1的蛋白表達，但是 ApoE－/－小鼠脂蛋白對ABCA1和ABCG1蛋白表達的誘導(dǎo)程度明顯低于LDLr－/－小鼠脂蛋白處理組細胞，說明低水平的蛋白表達與低水平的膽固醇流出是相一致的。

Figure 4.The protein expression of ABCA1 and ABCG1.±s.n=3.*P＜0.05 vs control group;#P＜0.05 vs LDLr－/－group.圖4ABCA1和ABCG1的蛋白表達

4 ApoE－/－小鼠脂蛋白降低ABCA1和ABCG1的mRNA水平

如圖5所示，LDLr－/－小鼠脂蛋白和ApoE－/－小鼠脂蛋白處理顯著增加ABCA1和ABCG1的mRNA水平，但是ApoE－/－小鼠脂蛋白對ABCA1和ABCG1 mRNA水平的誘導(dǎo)程度明顯低于LDLr－/－小鼠脂蛋白處理組細胞。

Figure 5.The mRNA levels of ABCA1 and ABCG1.±s.n=3.*P＜0.05 vs control group;#P＜0.05 vs LDLr－/－group.圖5 ApoE－/－小鼠脂蛋白從轉(zhuǎn)錄水平對ABCA1和ABCG1表達的調(diào)節(jié)

討論

脂質(zhì)在巨噬細胞內(nèi)聚集引起巨噬細胞泡沫樣改變是AS的特征性病理變化。脂質(zhì)攝入和流出的不平衡是脂質(zhì)在巨噬細胞內(nèi)聚集的一個重要原因［2］。本次研究中，我們主要觀察到ApoE－/－小鼠脂蛋白顯著降低膽固醇流出至ApoA－I和HDL，引起脂質(zhì)在巨噬細胞內(nèi)聚集。同時我們也觀察到，ApoE－/－小鼠脂蛋白導(dǎo)致膽固醇流出的減少與ABCA1和ABCG1的蛋白表達水平降低有關(guān)。

膽固醇從巨噬細胞內(nèi)流出是膽固醇逆向轉(zhuǎn)運過程中最關(guān)鍵的一個步驟，如果膽固醇從巨噬細胞內(nèi)流出至細胞外接受體ApoA－I和HDL的過程發(fā)生障礙，會引起大量膽固醇在細胞內(nèi)聚集［7］。Tangier疾病是一種罕見的遺傳性疾病，Tangier疾病患者的肝臟、脾臟以及其它許多組織器官的巨噬細胞內(nèi)均可發(fā)現(xiàn)膽固醇和膽固醇酯聚集，這主要是由于那些患者ABCA1突變而喪失轉(zhuǎn)運膽固醇的功能所致［8］。Yvan－Charvet等［9］研究發(fā)現(xiàn)，與Tangier疾病患者相似，ABCA1和ABCG1基因敲除小鼠也因巨噬細胞膽固醇流出至ApoA－I和HDL的水平降低而加速小鼠AS的進程。Lu等［10］在最近的一項研究中指出，促紅細胞生成素能夠促進巨噬細胞膽固醇流出，進而抑制脂質(zhì)在巨噬細胞內(nèi)的聚集，阻止巨噬細胞發(fā)生泡沫樣改變;與此相反，當(dāng)抑制細胞膽固醇流出過程后，則有大量的脂質(zhì)在巨噬細胞內(nèi)聚集。我們本次的研究結(jié)果也證實膽固醇流出在維持巨噬細胞內(nèi)膽固醇動態(tài)平衡中的作用，同時我們也發(fā)現(xiàn)，用ApoE－/－小鼠脂蛋白處理細胞后，流出至ApoA－I和HDL的膽固醇量明顯降低，表明ApoE缺失在一定程度上抑制膽固醇流出，進而導(dǎo)致脂質(zhì)在巨噬細胞內(nèi)的聚集。

膽固醇流出與ABCA1和ABCG1的表達水平密切相關(guān)。Lu等［10］的研究主要集中在促紅細胞生成素通過增加ABCA1和ABCG1的表達進而調(diào)節(jié)巨噬細胞的膽固醇流出狀況，提示ABCA1和ABCG1作為轉(zhuǎn)運體發(fā)揮作用，在細胞受到外來干擾時盡量把細胞內(nèi)多余的脂質(zhì)轉(zhuǎn)運出去，達到保護細胞的目的。與上述觀察相一致，我們的實驗結(jié)果也顯示，當(dāng)用脂蛋白處理巨噬細胞時，細胞表面ABCA1和ABCG1的蛋白表達都上調(diào)，只是上調(diào)程度有差異。諸如，LDLr－/－小鼠脂蛋白和ApoE－/－小鼠脂蛋白處理顯著增加ABCA1和ABCG1的蛋白表達，但是ApoE－/－小鼠脂蛋白對ABCA1和ABCG1蛋白表達的誘導(dǎo)程度明顯低于LDLr－/－小鼠脂蛋白處理組細胞。這表明，ApoE在調(diào)節(jié)ABCA1和ABCG1蛋白表達水平進而維持膽固醇從巨噬細胞內(nèi)流出平衡的過程中發(fā)揮了重要作用，本實驗中對ABCA1和ABCG1轉(zhuǎn)錄水平的研究進一步支持了上述觀點。

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