何 易， 李旭東， 王東寧， 肖若芝， 王文文， 胡 元， 林東軍△

(中山大學(xué)1附屬第三醫(yī)院血液科，2血液病研究所，廣東廣州510630)

涉及11q23的染色體異常是造血系統(tǒng)腫瘤中常見(jiàn)的遺傳學(xué)改變，分子水平研究揭示此異常導(dǎo)致位于11q23的混合譜系白血病(mixed－lineage leukemia，MLL)基因發(fā)生重排，此基因亦被稱(chēng)為 ALL1、HTRX、HRX或TRX1基因。MLL異?？煞譃閮深?lèi)，一類(lèi)為MLL重排，包括涉及MLL的易位、倒位和串聯(lián)重復(fù)序列(partial tandem duplication，PTD);第二類(lèi)為MLL擴(kuò)增，包括多倍體、均勻染色區(qū)(homogeneously staining region，hsr)和雙微染色體(double minutes，dmin)以及標(biāo)記染色體(marker chromosome，mar)。WHO已將涉及11q23/MLL基因重排的急性白血病單獨(dú)列為11q23/MLL白血病，累及的白血病大多惡性程度高，對(duì)常規(guī)化療不敏感，生存期短，是預(yù)后差的獨(dú)立因素［1－2］，而早期進(jìn)行造血干細(xì)胞移植可能為改善預(yù)后帶來(lái)好處［3－4］。因此，MLL基因重排的檢測(cè)對(duì)急性白血病(acute leukemia，AL)預(yù)后判斷和治療方案選擇具有重要意義。我們對(duì)201例已進(jìn)行常規(guī)染色體核型分析(conventional cytogenetics analysis，CCA)的AL患者回顧性地總結(jié)熒光原位雜交技術(shù)(fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH)和逆轉(zhuǎn)錄多重巢式聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)(reverse transcriptionmultiplex nested PCR，multiplex RT－PCR)對(duì)MLL基因異常的檢出率，探討兩者聯(lián)合應(yīng)用的價(jià)值。

材料和方法

1 研究對(duì)象

自2008年1月～2011年5月于我院住院并行常規(guī)CCA、FISH和multiplex RT－PCR檢測(cè)的原發(fā)AL患者共201例，包括急性髓細(xì)胞白血病(acute myeloid leukemia，AML)患者128例及急性淋巴細(xì)胞白血病(acute lymphoid leukemia，ALL)患者73例。共檢出19例MLL基因重排患者，其中13例為AML，按FAB分型M5 10例，M4 2例，M2 1例;6例為ALL。19例患者中男12例，女7例，中位年齡25.5 (2～68)歲。所有病例均進(jìn)行形態(tài)學(xué)、免疫學(xué)、分子生物學(xué)和細(xì)胞遺傳學(xué)(MICM)分型。

2 方法

2.1 細(xì)胞遺傳學(xué)分析 取患者治療前骨髓3 mL，采用短期培養(yǎng)法培養(yǎng)骨髓24 h，終止培養(yǎng)前1 h加0.05 g/L秋水仙堿，按常規(guī)方法制備染色體，采用RHG顯帶技術(shù)進(jìn)行核型分析，染色體核型描述參照ISCN2005的標(biāo)準(zhǔn)。

2.2 間期FISH檢測(cè) 采用染色體短期培養(yǎng)法的標(biāo)本，氣干法滴片，并于2×SSC中洗片2 min，70%、85%、100%乙醇梯度脫水各2 min，加入MLL breakpoint探針(Cytocell)，實(shí)驗(yàn)方法按說(shuō)明書(shū)操作。橡皮水泥密封，37℃恒溫雜交儀過(guò)夜，次日洗片后用含0.1 mg/L二咪基苯基吲哚(DAPI)的抗褪色液復(fù)染標(biāo)本10 min后在熒光顯微鏡下觀察，分析間期細(xì)胞200個(gè)。11q23/MLL基因重排陰性的細(xì)胞顯示2個(gè)黃色融合信號(hào)(0R0G2Y)，重排陽(yáng)性的細(xì)胞顯示1個(gè)黃色融合信號(hào)和1個(gè)紅色及1個(gè)綠色信號(hào)(1R1G1Y)，MLL擴(kuò)增顯示為3個(gè)以上的黃色融合信號(hào)。

2.3 中期FISH檢測(cè) 方法同間期FISH，選擇分散較好的中期分裂相在熒光顯微鏡下觀察MLL信號(hào)。

2.4 Multiplex RT－PCR檢測(cè) 取治療前EDTA抗凝的骨髓2 mL，采用 Trizol(Invitrogen)試劑提取(1～2)×106個(gè)有核細(xì)胞總RNA，用Maxima試劑盒(Fermentas)反轉(zhuǎn)錄為cDNA。MLL融合基因引物設(shè)計(jì)及檢測(cè)方法參照文獻(xiàn)［5］進(jìn)行。2%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像儀(Tanon 2500)軟件分析。共檢測(cè)11種較常見(jiàn)的MLL融合基因，包括:MLL/AFX、MLL/ AF1p、MLL/AF1q、MLL/AF4、MLL/AF6、MLL/AF9、MLL/AF10、dupMLL(11q23)、MLL/AF17、MLL/ELL和MLL/ENL。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，分類(lèi)資料用χ2檢驗(yàn)。

結(jié)果

1 間期FISH正常分界值的確定

正常分界值的計(jì)算為陰性對(duì)照組中所觀察到的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)的均數(shù)±3×標(biāo)準(zhǔn)差。陰性對(duì)照組為10例經(jīng)骨髓形態(tài)學(xué)確診的患者，包括特發(fā)性血小板減少性紫癜4例，缺鐵性貧血4例，大致正常骨髓象2例。間期FISH檢測(cè)該組陽(yáng)性細(xì)胞百分率為1%～2.5%，均數(shù)為2%，標(biāo)準(zhǔn)差為0.51%，分界值=2%+ 3×0.51%=3.53%。將陽(yáng)性細(xì)胞百分率大于該值的標(biāo)本定為MLL基因重排陽(yáng)性。

2 CCA、FISH和multiplex RT－PCR檢測(cè)結(jié)果

共有19例患者出現(xiàn)11q23/MLL基因重排，見(jiàn)表1。在AML中檢出13例(13/128，10.2%)，ALL中檢出6例(6/73，8.2%)。11例(11/201，5.47%)經(jīng)CCA檢測(cè)到11q23異常，分別為:t(4;11)伴+11 1例，t(6;11)2例，t(9;11)2例，t(10;11)3例，t(11; 19)3例。FISH檢測(cè)見(jiàn)15例(15/201，7.46%)出現(xiàn)陽(yáng)性MLL異常信號(hào)，其中11例為MLL分離信號(hào)，2例為擴(kuò)增信號(hào)，同時(shí)出現(xiàn)分離和擴(kuò)增信號(hào)的2例。第4例患者CCA正常，中期FISH見(jiàn)MLL分離的紅綠信號(hào)分別位于11號(hào)染色體的長(zhǎng)短臂上，提示inv (11)，見(jiàn)圖1。18例患者(18/201，8.86%)檢出MLL融合基因陽(yáng)性表達(dá)，分別為:dup MLL(11q23)6例，MLL/AF6 2例，MLL/AF10 3例，MLL/AF9 2例，MLL/ ELL 2例，MLL/ENL、MLL/AF4和 MLL/ELL伴 dup MLL(11q23)各1例，見(jiàn)表1。

表1 19例11q23/MLL基因重排陽(yáng)性患者核型、FISH和PCR結(jié)果Table 1 .The results of karyotype，F(xiàn)ISH and PCR in 19 MLL－positive cases

Figure 1.FISH results of the MLL probe.MLL gene exhibit yellow fluorescent.The break－apart of red and green signals stands for MLL rearrangement.圖1MLL探針的FISH結(jié)果

3 CCA與FISH、multiplex RT－PCR聯(lián)合檢測(cè)的比較

將CCA中無(wú)11q23重排的患者分為2組，一組為正常核型組，另一組為其它附加染色體異常組。5例正常核型組患者經(jīng)FISH檢測(cè)1例為inv(11)，1例為MLL擴(kuò)增;multiplex RT－PCR檢出4例dup MLL (11q23)。3例具有其它染色體異常的患者中1例為超二倍體，F(xiàn)ISH檢測(cè)發(fā)現(xiàn)MLL擴(kuò)增，1例 +8，F(xiàn)ISH未發(fā)現(xiàn)異常，這2例患者multiplex RT－PCR檢出均為 dup MLL(11q23);第3例患者為四倍體，F(xiàn)ISH檢測(cè)發(fā)現(xiàn)MLL重排并擴(kuò)增，multiplex RT－PCR檢出MLL/ELL并dup MLL(11q23)，見(jiàn)圖2。FISH聯(lián)合multiplex RT－PCR檢出MLL異常率為9.45% (19/201)，較CCA檢出MLL異常率(5.47%)明顯提高，χ2=100.558，P＜0.01。19例MLL陽(yáng)性的患者中，CCA敏感度為57.9%(11/19)，F(xiàn)ISH敏感度為78.9%(15/19)，multiplex RT－PCR敏感度為94.7%(18/19)。

Figure 2.PCR results for MLL rearrangement.A:dup(MLL) positive product.Lane 1:MLLex5/MLLex2.B:MLL/ ELL(+)product.Lane 1，2:CBF/MYH11;Lane 3: MLL/AFX Lane 4:MLL/AF6;Lane 5:MLL/ELL.M:DNA marker.圖2MLL重排的PCR結(jié)果

討論

染色體易位是白血病常見(jiàn)的遺傳學(xué)改變，不同染色體或同一染色體不同區(qū)段易位后可造成2個(gè)基因融合，從而導(dǎo)致相應(yīng)基因功能的異常獲得或喪失，使細(xì)胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化并出現(xiàn)增生異常、分化障礙和凋亡減少。MLL易位、串聯(lián)重復(fù)和擴(kuò)增等可造成HOX基因的持續(xù)表達(dá)而分化失控，導(dǎo)致造血干細(xì)胞惡變［6］。MLL重排是白血病重現(xiàn)性的遺傳學(xué)改變之一，具有MLL重排的急性白血病對(duì)常規(guī)化療反應(yīng)差，對(duì)急性白血病的分型診斷、治療方案選擇和預(yù)后評(píng)價(jià)有指導(dǎo)意義，因此是急性白血病的常規(guī)檢查項(xiàng)目。CCA能全面分析人類(lèi)23對(duì)染色體異常情況，是分析11q23重排的常用方法，但由于受染色體中期分裂相數(shù)量和質(zhì)量以及染色體隱匿易位或PTD的影響，CCA將導(dǎo)致部分11q23異常漏檢。MLL重現(xiàn)性易位已達(dá)100種以上，已鑒定的伙伴基因達(dá)60多種［7］，龐大的易位種類(lèi)也給CCA帶來(lái)一定的困難。本研究中CCA檢出11q23重排的敏感度為57.9%，而FISH和multiplex RT－PCR檢出MLL敏感度分別為78.9%和94.7%，提示CCA并非為檢測(cè)11q23/MLL重排的敏感方法。

FISH是結(jié)合了細(xì)胞遺傳學(xué)、分子生物學(xué)和免疫學(xué)的一種新技術(shù)，具有快速直觀、敏感性和特異性高、可重復(fù)性好等特點(diǎn)。間期FISH不受染色體質(zhì)量的影響，可用于單細(xì)胞水平的直接觀察［8－9］。11q23/MLL易位的斷裂點(diǎn)絕大多數(shù)發(fā)生在8.5 kb的BamH I酶切片段、包含了外顯子5～11的斷裂集中區(qū)(breakpoint cluster region，BCR)，我們使用的11q23/MLL雙色分離信號(hào)探針正是以BCR為界線，用2個(gè)DNA片段以不同的熒光染料分別標(biāo)記MLL基因斷裂集中區(qū)的中心粒端和端粒端。11q23/MLL雙色分離探針在間期細(xì)胞中易于觀察累及11q23/ MLL的各種易位、缺失和擴(kuò)增而無(wú)需預(yù)先知道伙伴基因，但不能判斷倒位、插入和PTD。結(jié)合中期FISH則可明確易位的伙伴基因、倒位和插入。本研究中第4例患者CCA未見(jiàn)異常，于間期細(xì)胞中僅見(jiàn)分離信號(hào)，而中期分裂相上見(jiàn)MLL分離的紅綠信號(hào)分別位于11號(hào)染色體的長(zhǎng)短臂上，證實(shí)為 inv(11)。FISH檢出的4例MLL擴(kuò)增，包括多倍體和mar，CCA只報(bào)告了1例11三體和1例四倍體。這提示FISH能檢出CCA難以發(fā)現(xiàn)的MLL隱匿易位、倒位和擴(kuò)增，其敏感性要高于CCA。

MLL與伙伴基因融合后轉(zhuǎn)錄出融合基因轉(zhuǎn)錄本，雖然涉及的伙伴基因眾多，但以MLLT2(AF4)、MLLT3(AF9)、MLLT1(ENL)、MLLT10(AF10)和MLLT4(AF6)出現(xiàn)頻率最高［10］。多數(shù)研究表明具有MLL基因重排的患者對(duì)常規(guī)化療反應(yīng)差，預(yù)后不良，尤其年齡小于1歲的嬰幼兒治療效果更差［1－2］。PTD為MLL自身融合的形式，具有MLL－PTD的患者同樣生存期也較MLL－PTD陰性者短［11］。我們采用的multiplex RT－PCR方法中包含了MLL/AFX、 MLL/AF1P、MLL/AF1q、MLL/AF4、MLL/AF6、MLL/ AF9、MLL/AF10、MLL/AF17、MLL/ELL和 MLL/ENL等常見(jiàn)的融合基因，也包含了dupMLL(11q23)這種不能被CCA和FISH方法檢測(cè)出的串聯(lián)重復(fù)形式。本研究確定了12例MLL的伙伴基因，還檢出了7例dupMLL(11q23)，彌補(bǔ)了CCA和FISH的不足。

綜上所述，F(xiàn)ISH的雙色分離探針能夠檢測(cè)間期細(xì)胞和中期分裂相上的MLL信號(hào)，無(wú)需預(yù)先知道伙伴基因，其檢測(cè)范圍大大高于multiplex RT－PCR;而multiplex RT－PCR能夠明確常見(jiàn)的MLL融合基因及其伙伴基因，還能檢出FISH無(wú)法測(cè)到的MLLPTD，兩者結(jié)合顯著提高了MLL重排的檢出率。

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