張 潔， 陳俊杰， 陳成水， 王夢怡

(溫州醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院呼吸內(nèi)科，浙江溫州325000)

肺癌的發(fā)病率和死亡率均居世界惡性腫瘤的首位，嚴(yán)重危害著人類的健康。在我國，肺癌已超過死因的20%，肺癌每年大約有40萬例患者死亡［1］。目前在臨床上，雖然有不少腫瘤標(biāo)志物已經(jīng)在應(yīng)用，像鱗狀細(xì)胞癌抗原、癌胚抗原、細(xì)胞角蛋白19和神經(jīng)元特異性烯醇化酶，但是肺癌的發(fā)病率及死亡率每年仍呈持續(xù)增長。研究表明，腫瘤的發(fā)生是多基因、多因素導(dǎo)致細(xì)胞增殖和死亡異常的結(jié)果［2］。目前，有研究發(fā)現(xiàn)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子1(signal transducer and activator of transcription 1，STAT1)和細(xì)胞間黏附分子 －1(intercellular adhesion molecule－1，ICAM－1)與惡性腫瘤的發(fā)生關(guān)系密切，但它們與非小細(xì)胞肺癌(non－small－cell lung cancer，NSCLC)關(guān)系的報道較少。本研究應(yīng)用 real－time PCR和Western blotting方法對NSCLC組織中的STAT1和ICAM－1進(jìn)行檢測，擬探討它們在肺癌組織中的表達(dá)情況與腫瘤病理、不同分期、有無轉(zhuǎn)移的相互關(guān)系，了解其在肺癌發(fā)展和轉(zhuǎn)移中的作用，為肺癌的及早診斷和治療提供線索和依據(jù)。

材料和方法

1 材料

1.1 研究對象 選取2010年6月至2011年6月期間于溫州醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院行外科手術(shù)切除的肺癌患者，術(shù)后皆得到病理證實的NSCLC標(biāo)本40例;取離腫瘤組織5 cm以上的肺組織作為正常對照40例。男性29例，女性11例，年齡36～79歲，平均年齡56.2歲，病理圖片見圖1。依據(jù)WHO肺癌的分類方法進(jìn)行組織學(xué)分類，其中鱗癌13例，腺癌27例(其中包括2例肺泡細(xì)胞癌)，依照腫瘤分級標(biāo)準(zhǔn)(依據(jù)組織結(jié)構(gòu)、異型性、核分裂象等)分為高－中分化組及低分化組，高－中分化24例，低分化16例。按國際抗癌聯(lián)盟(UICC)2009年肺癌分期分為I期、II期、III期和IV期，由于本研究病例數(shù)有限，將I期和II期歸為臨床早期，III期和IV期歸為臨床晚期，早期肺癌29例，晚期肺癌11例。出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的有12例，無轉(zhuǎn)移的有28例。

1.2 試劑 Real－time PCR試劑盒(Fermentas); SsoFast EvaGreen Supermix with Low ROX(Bio－Rad);TRIzol裂解液(Invitrogen);BCA蛋白濃度測定試劑盒(Thermo);預(yù)染蛋白質(zhì)marker和膜封閉液(Thermo)。哺乳動物細(xì)胞蛋白提取試劑盒(Fermentas);PVDF膜(聯(lián)科生物公司，中國);鼠抗人STAT1單抗和兔抗人ICAM－1單抗(BD);鼠抗人β－actin單抗、HRP標(biāo)記的山羊抗鼠Ⅱ抗和HRP標(biāo)記的山羊抗兔Ⅱ抗(聯(lián)科生物公司);ECL發(fā)光液(Thermo)。

Figure 1.Pathological images of NSCLC and adjacent normal lung tissues(HE staining，×40).A:adenocarcinoma;B:lung tissue adjacent to the adenocarcinoma; C:squamous cell carcinoma;D:lung tissue adjacent to the squamous cell carcinoma.圖1 NSCLC及癌旁肺組織的病理圖片

2 方法

2.1 Real－time PCR方法檢測STAT1和ICAM－1的表達(dá) 手術(shù)切除后采集的新鮮標(biāo)本在液氮下保存。用TRIzol裂解液提取總RNA，然后逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，進(jìn)行實時定量PCR。各引物序列如下:STAT1上游引物5’－TGC ATC ATG GGC TTC ATC AGC－3’，下游引物5’－GAA GTC AGG TTC GCC TCC GTT C－3’;ICAM－1上游引物5’－GGC TGG AGC TGT TTG AGA AC－3’，下游引物5’－ACfT GTG GGG TTC AAC CTC TG－3’;GAPDH上游引物5’－CCA GCC GAG CCA CAT CGC TC－3’，下游引物5’－ATG AGC CCC AGC CTT CTC CAT－3’。所有數(shù)值采用2－ΔΔCt法進(jìn)行相對定量分析。

2.2 Western blotting檢測 將組織標(biāo)本剪碎，加入細(xì)胞裂解液和蛋白酶抑制劑及磷酸化酶抑制劑，提取組織蛋白，用BCA法測定蛋白濃度。每組取30 μg蛋白樣品經(jīng)凝膠電泳分離后將蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF膜，含5%脫脂奶粉(BD)的緩沖液室溫封閉2 h后，Ⅰ抗(1∶1 000鼠抗人STAT1單克隆抗體，1∶1 000的β－actin單克隆抗體)4℃孵育過夜，TBST緩沖液洗膜，Ⅱ抗(1∶8 000山羊抗鼠IgG－HRP多克隆抗體)室溫孵育2 h，再用TBST緩沖液洗膜，ECL化學(xué)發(fā)光顯色，X光顯影。重復(fù)上述過程，檢測ICAM－1蛋白，Ⅰ抗?jié)舛葹?∶1 000，Ⅱ抗?jié)舛葹?∶8 000，β－actin同上。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理，配對資料采用配對樣本t檢驗，例數(shù)不同時，采用獨立樣本t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié)果

1 Real－time PCR檢測STAT1和ICAM－1在組織中的表達(dá)

STAT1和ICAM－1在非小細(xì)胞肺癌組織中的表達(dá)明顯高于非惡性肺組織(癌旁肺組織)，且兩者差異顯著(P＜0.05)，見表1。

表1 STAT1和ICAM－1在組織中的表達(dá)比較Table 1 .The expression of STAT1 and ICAM－1 in lung tissues detected by real－time PCR(±s.n=40)

表1 STAT1和ICAM－1在組織中的表達(dá)比較Table 1 .The expression of STAT1 and ICAM－1 in lung tissues detected by real－time PCR(±s.n=40)

*P＜0.05 vs normal lung tissue.

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2 Real－time PCR檢測STAT1表達(dá)與非小細(xì)胞肺癌臨床病理特征的關(guān)系

STAT1在低分化組織中的表達(dá)高于高－中分化組織，且兩者差異顯著(P＜0.05);在臨床分期中，肺癌早期組高于肺癌晚期組，差異顯著(P＜0.05);而在不同病理類型、有無轉(zhuǎn)移、不同性別、不同年齡組別中，表達(dá)無顯著差異(P＞0.05)，見表2。

3 Real－time PCR檢測ICAM－1表達(dá)與非小細(xì)胞肺癌臨床病理特征的關(guān)系

ICAM－1的表達(dá)在腺癌中比在鱗癌中強(qiáng)，且兩者差異顯著(P＜0.05);在臨床分期中，肺癌晚期組高于肺癌早期組，顯著差異(P＜0.05);表達(dá)在有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移組高于無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移組，且差異顯著(P＜0.05)。而在不同性別、年齡組別中，表達(dá)無顯著差異(P＞0.05)。但在低分化組織中與在高－中分化組織中的表達(dá)相比有過度表達(dá)的趨勢，但無顯著差異(P＞0.05)，見表2。

4 Western blotting檢測STAT1和ICAM－1在組織中的表達(dá)

STAT1及ICAM－1在非小細(xì)胞肺癌組織中的表達(dá)明顯高于非惡性肺組織(癌旁肺組織)中的表達(dá)，且兩者差異顯著(P＜0.05)，見圖2、3。

討論

腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移是十分復(fù)雜的生物學(xué)現(xiàn)象，是腫瘤細(xì)胞與宿主間一系列復(fù)雜、多步驟、相互作用的結(jié)果［3］。STAT1和ICAM－1分別參與其中。

表2 STAT1和ICAM－1表達(dá)與NSCLC臨床病理特征的關(guān)系Table 2 .The relationship between the expression of STAT1 and ICAM－1 and the clinicopathological characteristics of NSCLC detected by real－time PCR(±s)

表2 STAT1和ICAM－1表達(dá)與NSCLC臨床病理特征的關(guān)系Table 2 .The relationship between the expression of STAT1 and ICAM－1 and the clinicopathological characteristics of NSCLC detected by real－time PCR(±s)

*P＜0.05 vs squamous cell carcinoma;△P＜0.05 vs well differentiated;#P＜0.05 vs late(stage);▲P＜0.05 vs without (lymph node metastasis).

?

STAT是一種DNA結(jié)合蛋白，STAT蛋白最重要的功能是參與機(jī)體免疫應(yīng)答和調(diào)控細(xì)胞增殖與轉(zhuǎn)化，STATs家族共有 7個成員［4］，其中 STAT1是STAT家族最早被發(fā)現(xiàn)的成員，分子量為91 kD，其基因位于小鼠1號染色體上面，相當(dāng)于人的2號染色體的q12至q33區(qū)［5］。STAT1是一類新型細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和基因表達(dá)調(diào)控因子家族，與炎癥、腫瘤、免疫性疾病的關(guān)系日益受到人們的重視［6］。STAT1具有與P53相近的功能:腫瘤的監(jiān)視和抑制作用，可被IFN－α、IFN－γ、IL－6、IL－2、表皮生長因子、IL－10等細(xì)胞因子激活［7］。研究顯示在多種惡性腫瘤組織和細(xì)胞中有STAT表達(dá)異?；蚧钚悦黠@增強(qiáng)，這提示STAT表達(dá)異常與惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展有密切關(guān)系［8］。在人類多發(fā)性骨髓瘤、肺癌和乳腺癌等腫瘤中，均可檢測到STAT1高表達(dá)。STAT1是腫瘤抑制子［9］，并主導(dǎo)干擾素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程;除為先天性免疫所必需外，也充當(dāng)生長抑制子和凋亡促動子［10－11］。有臨床研究表明，在肺癌的早期(I～I(xiàn)I期)，STAT1表達(dá)較高，隨著肺癌的臨床病理進(jìn)展(III期)，STAT1的表達(dá)下降。提示STAT1在早期肺癌患者中的免疫監(jiān)視和抗腫瘤的作用較強(qiáng)［12］。本研究發(fā)現(xiàn)，非小細(xì)胞肺癌組織中的STAT1表達(dá)明顯高于癌旁肺組織，并且在肺癌早期組高于肺癌晚期組，這提示，STAT1在肺癌組織中持續(xù)激活，發(fā)揮著腫瘤抑制因子的抗腫瘤作用。而且STAT1在肺癌早期發(fā)揮了一定的免疫監(jiān)視作用，隨著肺癌疾病進(jìn)展免疫監(jiān)視功能亦下降，可能是癌細(xì)胞通過某種抑制作用，抑制STAT1的表達(dá)，從而逃避機(jī)體的免疫監(jiān)視。在本研究中，不同分化程度的肺癌STAT1表達(dá)有差異，與分化程度呈負(fù)相關(guān)趨勢，低分化癌高表達(dá)，高分化癌低表達(dá)，提示STAT1與肺癌的惡性程度有相關(guān)性。

Figure 2.STAT1 protein expression in lung tissues detected by Western blotting.Lane 1，3:normal lung tissue;Lane 2，4:NSCLC.±s.n=40.*P＜0.05 vs normal lung tissue.圖2 STAT1在肺組織中的表達(dá)

Figure 3.ICAM－1 protein expression in lung tissues detected by Western blotting.Lane 1，3:normal lung tissue; Lane 2，4:NSCLC.±s.n=40.*P＜0.05 vs normal lung tissue.圖3 ICAM－1在肺組織中的表達(dá)

ICAM－1又稱 CD54，屬于免疫球蛋白超家族［13］，是淋巴細(xì)胞功能相關(guān)抗原 －1(lymphocyte function－associated antigen－1，LFA－1)的配體。研究表明，ICAM－1在多種類型的腫瘤組織中存在異常表達(dá)，一定程度上反映了腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移能力［14］。目前報道較多的有黑色素瘤、腎癌、肝癌、卵巢癌等［15］。ICAM－1分子在腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移及抗腫瘤免疫中的作用成為近幾年的研究熱點。ICAM－1分布在淋巴管及血管內(nèi)皮細(xì)胞、纖維母細(xì)胞、腎上皮細(xì)胞等，是參與介導(dǎo)細(xì)胞間黏附識別的重要黏附分子［16］，它可與淋巴細(xì)胞表面的受體LFA結(jié)合，從而使淋巴細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞穩(wěn)定黏附。ICAM－1過度活化可促使過多可溶性ICAM－1(sICAM－1)進(jìn)入血液，競爭性抑制血液循環(huán)中ICAM－1/LFA－1依賴的MHC－1類抗原對游離癌細(xì)胞的免疫識別作用，從而使癌細(xì)胞逃離免疫監(jiān)視，更容易發(fā)生侵襲和轉(zhuǎn)移［17］。本實驗結(jié)果顯示，肺癌組織ICAM－1明顯高于非惡性肺組織。提示肺癌組織表達(dá)ICAM－1是機(jī)體抗腫瘤免疫功能提高的表現(xiàn)，ICAM－1通過與相應(yīng)LFA－1、Mac－1結(jié)合使更多的免疫效應(yīng)細(xì)胞聚集，發(fā)揮機(jī)體免疫系統(tǒng)的抗腫瘤作用，使機(jī)體的免疫監(jiān)視能力增強(qiáng)［18］。在臨床分期中，肺癌晚期組高于肺癌早期組，ICAM－1的表達(dá)上調(diào)可能與肺癌細(xì)胞的TNM分期有密切關(guān)系，說明隨著疾病的加重，ICAM－1水平也伴隨升高，促進(jìn)細(xì)胞的惡性增殖，導(dǎo)致癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移，這可作為評估非小細(xì)胞肺癌是否進(jìn)展的指標(biāo)之一。腺癌的ICAM－1表達(dá)高于鱗癌，這與腺癌比鱗癌易于侵襲和轉(zhuǎn)移的臨床特點基本符合。同時有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的肺癌病人組織中ICAM－1表達(dá)增強(qiáng)，預(yù)示了ICAM－1與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有密切關(guān)系，可能是ICAM－1與LFA－1結(jié)合后，隨著淋巴細(xì)胞的轉(zhuǎn)移進(jìn)入血液循環(huán)，在毛細(xì)血管或淋巴竇內(nèi)滯留和著床，形成轉(zhuǎn)移灶，有利于淋巴細(xì)胞黏附血管內(nèi)皮細(xì)胞并向鄰近組織侵襲。

本實驗發(fā)現(xiàn)，STAT1和ICAM－1在肺癌組織中的表達(dá)與癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。這提示檢測STAT1和ICAM－1水平有助于判斷肺癌患者的病情，期待能為臨床上肺癌轉(zhuǎn)移及預(yù)后判斷和基因治療提供實驗室依據(jù)。而隨著肺癌的臨床病理進(jìn)展(III～I(xiàn)V期)，STAT1的表達(dá)下降，相應(yīng)的免疫監(jiān)視功能亦下降，具體機(jī)制還有待探討和明確。本次研究發(fā)現(xiàn)STAT1在肺癌早期中的表達(dá)高于晚期，而ICAM－1則剛好相反，STAT1通過何種途徑怎樣具體調(diào)節(jié)ICAM－1的表達(dá)，從而在不同的肺癌分期及病理類型中有差異，還有待研究。

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