萬(wàn) 璟， 李小毛△， 舒珊榮， 張 宇

(1中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院婦科，廣東廣州510630;2廣州華僑醫(yī)院婦產(chǎn)科，廣東廣州510632)

子宮內(nèi)膜癌是婦科最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，近年來(lái)國(guó)內(nèi)外發(fā)病率均有上升趨勢(shì)。盡管多數(shù)子宮內(nèi)膜癌為分化較好的腺癌，早期診斷和早期治療預(yù)后好。但一旦發(fā)生腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移后，患者治療效果和預(yù)后都明顯較差，據(jù)統(tǒng)計(jì)，發(fā)生轉(zhuǎn)移后子宮內(nèi)膜癌患者的5年生存率不到25%［1］。探討子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移和侵襲的機(jī)制，找到新的治療靶點(diǎn)對(duì)子宮內(nèi)膜癌具有十分重要的意義。

胰島素樣生長(zhǎng)因子(insulin－like growth factor，IGF)系統(tǒng)在許多惡性腫瘤中起著重要的作用，并與子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。IGF－1與其受體(insulin－like growth factor type 1 receptor，IGF－1R)結(jié)合，激發(fā)自身磷酸化，導(dǎo)致下游的有絲分裂原激活的蛋白激酶通路及磷脂酶－3蛋白激酶激活，進(jìn)而引起細(xì)胞的增殖和腫瘤的轉(zhuǎn)移。IGF－1R在一些腫瘤中過(guò)度表達(dá)。這些受體的過(guò)度表達(dá)，外源性肽類使腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)化為不依賴于支持物生長(zhǎng)的類型［2］。研究發(fā)現(xiàn)IGF－1R與腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移有關(guān)，IGF－1能促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移［3］，采用反義技術(shù)阻斷IGF－1R的表達(dá)，能夠抑制鼠前列腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移［4］。但I(xiàn)GF－1R對(duì)子宮內(nèi)膜癌遷移和侵襲能力的作用仍然未知。本實(shí)驗(yàn)旨在利用RNA干擾技術(shù)沉默IGF－1R基因的表達(dá)，觀察其對(duì)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞體外遷移和侵襲能力的影響。

材料和方法

1 細(xì)胞培養(yǎng)

DH5α菌株，購(gòu)自Promega。HEK293T細(xì)胞、人子宮內(nèi)膜癌HEC－1B細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)，均采用含10%胎牛血清的DMEM低糖培養(yǎng)液(含青霉素1×105U/L和鏈霉素100 mg/L)培養(yǎng)，用含0.02%EDTA的2.5 g/L胰蛋白酶消化傳代。傳代后取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象。

2 主要試劑

特級(jí)胎牛血清、Opti－MEM I培養(yǎng)基和胰蛋白酶購(gòu)于Gibco;RNA提取物Trizol購(gòu)于Invitrogen;Reverse Transcription System試劑盒購(gòu)于TaKaRa;PCR引物由上海生工生物工程公司合成;Matrigel購(gòu)于BD;Transwell小室購(gòu)于Corning;MTT購(gòu)于Sigma。pGCSIL－GFP質(zhì)粒載體購(gòu)自上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司，pEGFP－N1－3FLAG質(zhì)粒載體購(gòu)自Becton Dickinson。鼠抗人IGF－1R購(gòu)自Cell Signaling Technology;鼠抗 β－actin多克隆抗體購(gòu)自 Santa Cruz Biotechnology;細(xì)胞總蛋白提取試劑盒購(gòu)自Pierce;蛋白分子質(zhì)量Marker購(gòu)自Fermentas。

3 siRNA設(shè)計(jì)、合成和篩選

根據(jù)IGF－1R基因序列和siRNA設(shè)計(jì)原則，設(shè)計(jì)5對(duì)siRNA序列。具體如下:siRNA1:5’－GCCGATGAGTGAGAAGACC－3’;siRNA2:5’－GCACGTCGAAGAATCGCAT－3’;siRNA3:5’－CGTTCTTTCAGCATCGAAC－3’;siRNA4:5’－CCATCAACAATGAGTACAA－3’;siRNA5:5’－GCATCACCGTTTACTACAA－3’。合成工作委托上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司完成，利用工具細(xì)胞HEK293T篩選出3條片段有沉默作用，選取其中沉默效果最好的1條進(jìn)行慢病毒包裝擴(kuò)增，并轉(zhuǎn)染子宮內(nèi)膜癌HEC－1B細(xì)胞，根據(jù)real－time PCR和Western blotting結(jié)果驗(yàn)證其沉默效果。吉?jiǎng)P基因慢病毒載體系統(tǒng)由pGC－LV載體、pHelper 1.0載體和pHelper 2.0載體3質(zhì)粒組成。pGC－LV載體中攜帶用于研究的PTEN基因，并帶有GFP標(biāo)記。

4 病毒載體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染

轉(zhuǎn)染前1 d將細(xì)胞接種到6孔板(2×105cells/ well)，待第2 d細(xì)胞密度為40%～50%進(jìn)行轉(zhuǎn)染;將每個(gè)6孔板中的舊培養(yǎng)基吸盡，用不含血清的培養(yǎng)基洗滌1～2次;然后每個(gè)6孔板中加入1.5 mL的無(wú)血清培養(yǎng)基;HEC－1B細(xì)胞按感染復(fù)數(shù)(multiplicity of infection，MOI)為50進(jìn)行慢病毒轉(zhuǎn)染，分別設(shè)對(duì)照組(HEC－1B－CON)、目的基因病毒轉(zhuǎn)染組(HEC－1B－KD)及陰性病毒轉(zhuǎn)染對(duì)照組(HEC－1B－NC);轉(zhuǎn)染8 h后將無(wú)血清培養(yǎng)基換為含10%胎牛血清的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。

5 Real－time PCR檢測(cè)

轉(zhuǎn)染后5 d，用Trizol抽提總RNA，變性電泳，測(cè)定A260及A280值，調(diào)整總RNA濃度為1 g/L，－80℃保存?zhèn)溆?。根?jù)IGF－1R、基質(zhì)金屬蛋白酶2(matrix metalloproteinases－2，MMP－2)和基質(zhì)金屬蛋白酶9 (matrix metalloproteinases－9，MMP－9)序列設(shè)計(jì)合成引物，β－actin為內(nèi)參照(表1)。先以總RNA為模板進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，然后以 cDNA為模板采用TaKaRa的real－time RT－PCR試劑盒在ABI 7700熒光PCR儀上進(jìn)行real－time RT－PCR反應(yīng)，PCR反應(yīng)條件為預(yù)變性95℃ 10 s，95℃5 s，60℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)。Real－time PCR擴(kuò)增完畢進(jìn)行熔解曲線分析，采用相對(duì)定量法以β－actin為內(nèi)參照，利用Ct值計(jì)算各基因mRNA的相對(duì)量。目的基因mRNA相對(duì)表達(dá)量用2－ΔCt來(lái)表示(ΔCt由目的基因的Ct值減去β－actin的Ct值)。

表1 IGF－1R、MMP－9和MMP－2的引物序列Table 1 .The primers for IGF－1R，MMP－9 and MMP－2

6 Western blotting檢測(cè)

轉(zhuǎn)染后第7 d，提取1×106個(gè)細(xì)胞的蛋白，紫外分光光度計(jì)定量，聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜上，常規(guī)進(jìn)行免疫印跡實(shí)驗(yàn)操作，IGF－1R兔抗1∶1 000和β－actin兔抗1∶1 000稀釋及羊抗兔Ⅱ抗抗體孵育，增強(qiáng)發(fā)光(ECL)顯色。對(duì)膜上的免疫復(fù)合物條帶進(jìn)行分析，IGF－1R蛋白的相對(duì)表達(dá)水平為IGF－1R蛋白條帶密度/β－actin條帶密度。

7 平板集落形成實(shí)驗(yàn)

轉(zhuǎn)染5 d后，將3組細(xì)胞按每個(gè)皿5 000個(gè)細(xì)胞密度接種到10 cm細(xì)胞培養(yǎng)皿中，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱連續(xù)培養(yǎng)18 d后中止培養(yǎng)。細(xì)胞經(jīng)甲醇固定15 min，0.1%結(jié)晶紫染色30 min，顯微鏡下計(jì)數(shù)細(xì)胞克隆數(shù)。實(shí)驗(yàn)設(shè)3個(gè)平行樣品，重復(fù)3次，結(jié)果取平均值。

8 細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)

轉(zhuǎn)染后第7 d，細(xì)胞培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，消化細(xì)胞，用PBS和無(wú)血清培養(yǎng)基先后洗滌1次，用無(wú)血清培養(yǎng)基懸浮細(xì)胞，計(jì)數(shù)，調(diào)整濃度為1×108/L;使用Transwell小室，在下室加入600 μL含10%血清的培養(yǎng)基上室加入100 μL細(xì)胞懸液，繼續(xù)在孵箱培養(yǎng)24 h;取出Transwell用PBS洗2遍，甲醇固定，室溫20 min;加入結(jié)晶紫(0.1%)染色，室溫0.5 h，PBS洗2遍，用棉球擦去上表面細(xì)胞，顯微鏡下取10個(gè)隨機(jī)視野計(jì)數(shù)，每個(gè)標(biāo)本重復(fù)3次。

9 細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)

轉(zhuǎn)染第7 d，提前準(zhǔn)備好基質(zhì)膠，將凍存于－80℃冰箱的BD Matrigel 4℃過(guò)夜(24 h)，變成液態(tài);取無(wú)血清培養(yǎng)基，加入Matrigel(20%)，混勻(冰上操作)，加入上室，每孔100 μL;放入37℃培養(yǎng)箱中，孵育5 h;消化細(xì)胞，無(wú)血清培養(yǎng)基洗3次，計(jì)數(shù)，配成細(xì)胞懸液;調(diào)整濃度為5×109/L;下室中加入10% FBS條件培養(yǎng)基;上室每孔加入100 μL細(xì)胞懸液;37℃培養(yǎng)箱中，孵育24 h;取出Transwell小室用PBS洗2遍，甲醇固定，室溫20 min;加入結(jié)晶紫(0.1%)染色，室溫0.5 h，PBS洗2遍，用棉球擦去上表面細(xì)胞，顯微鏡下取10個(gè)隨機(jī)視野計(jì)數(shù)，每個(gè)標(biāo)本重復(fù)3次。

10 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用SPSS 11.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，組間比較采用單因素方差分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1 siRNA序列篩選

將HEK293T細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)篩選細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后提取RNA進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)圖1。篩選出siRNA1、2、4、5均能降低IGF－1R mRNA水平至30%以下，選取沉默效果最好的siRNA1進(jìn)行慢病毒包裝擴(kuò)增。

Figure 1.Expression of IGF－1R mRNA in HEK293T cells after different siRNA transfection.±s.n=3.*P＜0.05 vs CON and NC.圖1 轉(zhuǎn)染后各組細(xì)胞IGF－1R mRNA的表達(dá)

2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率的檢測(cè)

HEC－1B細(xì)胞轉(zhuǎn)染后5 d可見(jiàn)較多特異性GFP綠色熒光的表達(dá)，表明我們的轉(zhuǎn)染相對(duì)成功，見(jiàn)圖2。

Figure 2.Expression of green fluorescent protein in HEC－1B cells 5 days after transfection(×100).圖2 轉(zhuǎn)染后5 d HEC－1B細(xì)胞綠色熒光蛋白的表達(dá)

3 轉(zhuǎn)染siRNA后HEC－1B細(xì)胞中IGF－1R mRNA水平和蛋白水平的變化

在轉(zhuǎn)染后第5 d，分別提取各組細(xì)胞的mRNA，進(jìn)行檢測(cè)驗(yàn)證其沉默效果，結(jié)果顯示，siRNA1序列能使HEC－1B細(xì)胞的IGF－1R在mRNA水平下降81%。在轉(zhuǎn)染后第7 d，提取細(xì)胞蛋白進(jìn)行Western blotting檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)HEC－1B－KD組細(xì)胞IGF－1R蛋白水平下降91.5%(P＜0.05)，見(jiàn)圖3、4。通過(guò)上述驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，證明靶點(diǎn)序列能有效降低HEC－1B細(xì)胞中IGF－1R的表達(dá)，保證后續(xù)實(shí)驗(yàn)的順利進(jìn)行。

Figure 3.Expression of IGF－1R mRNA in HEC－1B cells after transfection.±s.n=3.*P＜0.05 vs HEC－1BCON and HEC－1B－NC.圖3 轉(zhuǎn)染后HEC－1B細(xì)胞IGF－1R mRNA的表達(dá)

Figure 4.Expression of IGF－1R protein in HEC－1B cells after transfection.±s.n=3.*P＜0.05 vs HEC－1BCON and HEC－1B－NC.圖4 轉(zhuǎn)染后HEC－1B細(xì)胞IGF－1R蛋白的表達(dá)

4 慢病毒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染后HEC－1B細(xì)胞克隆形成能力的變化

穩(wěn)定轉(zhuǎn)染后進(jìn)行平板克隆實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞克隆形成能力，結(jié)果發(fā)現(xiàn)HEC－1B－KD組細(xì)胞形成克隆數(shù)目(153±11)明顯少于HEC－1B－CON細(xì)胞(471 ±7)和HEC－1B－NC細(xì)胞(461±11)(P＜0.05)，而HEC－1B－CON與HEC－1B－NC組細(xì)胞之間沒(méi)有明顯差異，見(jiàn)圖5。

Figure 5.Colony formation ability of HEC－1B cells after down－regulation of IGF－1R.±s.n=3.*P＜0.05 vs HEC－1B－CON and HEC－1B－NC.圖5 轉(zhuǎn)染后HEC－1B細(xì)胞的克隆形成能力變化

5 慢病毒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染后HEC－1B細(xì)胞遷移和侵襲能力的變化

轉(zhuǎn)染7 d后，HEC－1B－KD組遷移細(xì)胞相對(duì)于HEC－1B－CON組和HEC－1B－NC組明顯減少(P＜0.05)，而HEC－1B－CON組和HEC－1B－NC組沒(méi)有明顯差異，見(jiàn)圖6;HEC－1B－KD組侵襲細(xì)胞相對(duì)于HEC－1B－CON組和HEC－1B－NC組亦有明顯減少(P＜0.05)，見(jiàn)圖7。這些結(jié)果提示由于IGF－1R表達(dá)受到明顯抑制，子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞HEC－1B的遷移和侵襲能力也受到不同程度的抑制。

6 慢病毒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染后HEC－1B細(xì)胞MMP－2和MMP－9 mRNA水平的變化

慢病毒轉(zhuǎn)染7 d后，HEC－1B－KD組細(xì)胞MMP－2及MMP－9 mRNA水平明顯下降(P＜0.05)，分別下降了76%和86.5%，見(jiàn)圖8。

Figure 6.Inhibition of HEC－1B cells migration after downregulation of IGF－1R.±s.n=3.*P＜0.05 vs HEC－1B－CON and HEC－1B－NC.圖6 轉(zhuǎn)染后HEC－1B細(xì)胞遷移能力的變化

Figure 7.Inhibition of HEC－1B cells invasion after down－regulation of IGF－1R.±s.n=3.*P＜0.05 vs HEC－1B－CON and HEC－1B－NC.圖7 轉(zhuǎn)染后HEC－1B細(xì)胞的侵襲能力變化

討論

IGF是一類十分重要的生長(zhǎng)因子，具有促進(jìn)細(xì)胞增殖、分化等多種生物學(xué)活性，參與多種惡性腫瘤的發(fā)生與發(fā)展過(guò)程，如乳腺癌、前列腺癌、肝癌、結(jié)直腸癌、腎癌、黑色素瘤等［5］。IGFs系統(tǒng)是一個(gè)龐大的家族，包括IGF－1、IGF－2及其受體IGF－1R、IGF－2R和至少6種胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白(IGF－binding protein，IGF－BP)。

Figure 8.Inhibition of MMP－2 and MMP－9 mRNA expression in HEC－1B cells after down－regulation of IGF－1R.±s.n=3.*P＜0.05 vs HEC－1B－CON and HEC－1B－NC.圖8轉(zhuǎn)染后HEC－1B細(xì)胞MMP－2和MMP－9的表達(dá)

IGF－1是酪氨酸激酶生長(zhǎng)因子受體家族的成員，由細(xì)胞外的2個(gè)α亞單位及細(xì)胞內(nèi)2個(gè)β亞單位通過(guò)二硫鍵結(jié)合形成的二聚體。一旦生長(zhǎng)因子結(jié)合于該受體，受體β亞單位發(fā)生自身磷酸化，同時(shí)誘導(dǎo)胰島素受體底物(insulin receptor substrate，IRS)家族相應(yīng)銜接蛋白的募集。其中IRS1的激活與腫瘤的增殖和凋亡有關(guān)，而IRS2與腫瘤的遷移和轉(zhuǎn)移有關(guān)［6］。

IGF－1在多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起重要作用，已成為腫瘤治療的新靶點(diǎn)。很多研究數(shù)據(jù)表明，IGF－IR能調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖、代謝。對(duì)不同腫瘤的研究發(fā)現(xiàn)，抑制IGF－1R水平不僅影響裸鼠腫瘤的生長(zhǎng)，還能影響腫瘤的轉(zhuǎn)移。降低結(jié)腸癌細(xì)胞中IGF－1R的表達(dá)后，在裸鼠肝臟上成瘤率明顯降低。而在過(guò)表達(dá)IGF－1R的胰腺癌裸鼠模型中，腫瘤的侵襲力和淋巴轉(zhuǎn)移都顯著增加。降低前列腺癌中IGF－1R的表達(dá)后腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移能力都明顯被抑制。在最近的一項(xiàng)研究當(dāng)中，使用抗IGF－1R表達(dá)的抗體作用于裸鼠模型，發(fā)現(xiàn)在不影響原發(fā)瘤生長(zhǎng)的情況下，可以抑制腫瘤的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。上述研究均提示IGF－1R在腫瘤的轉(zhuǎn)移當(dāng)中起著重要的作用［7］。

IGF－1R在子宮內(nèi)膜癌中同樣表達(dá)異常。Mc-Campbell研究發(fā)現(xiàn)高表達(dá)和活化的IGF－1R與子宮內(nèi)膜不典型增生和子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生密切相關(guān)［8］。Pavelié的研究發(fā)現(xiàn)IGF－1R在III、IV期子宮內(nèi)膜癌中的表達(dá)顯著高于I、II期及正常子宮內(nèi)膜。提示IGF－1R可能與子宮內(nèi)膜癌的發(fā)展有關(guān)［9］。本課題組先前研究過(guò)沉默IGF－1R表達(dá)對(duì)子宮內(nèi)膜癌有增殖抑制作用，并能增加細(xì)胞凋亡［10］，但沉默IGF－1R是否能影響子宮內(nèi)膜癌的侵襲和轉(zhuǎn)移仍然未知。本實(shí)驗(yàn)采用RNA干擾技術(shù)，使用慢病毒載體，穩(wěn)定沉默IGF－1R基因的表達(dá)，觀察了IGF－1R水平降低對(duì)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞侵襲能力的影響。結(jié)果提示，在細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)中，KD組的細(xì)胞遷移能力顯著下降，在基質(zhì)侵襲實(shí)驗(yàn)中，轉(zhuǎn)染組穿膜細(xì)胞較未轉(zhuǎn)染組和載體對(duì)照組明顯減少，具有顯著意義。表明沉默IGF－1R表達(dá)可明顯降低子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力。

MMPs是一類依賴Zn2+和Ca2+并可降解細(xì)胞外基質(zhì) (extracellular matrix，ECM)的蛋白水解酶類［11］。其中MMP－2、MMP－9是MMPs超家族的重要成員，屬明膠酶類，能降解明膠、Ⅳ型膠原、纖維連接蛋白、彈力纖維等，其能通過(guò)蛋白水解酶的作用降解間質(zhì)結(jié)締組織和基底膜成份，還可以對(duì)生長(zhǎng)因子、細(xì)胞表面受體、細(xì)胞黏附分子或趨化因子的剪切作用來(lái)影響腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為，在腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移過(guò)程中發(fā)揮重要作用［12－13］。MMP－2和MMP－9與子宮內(nèi)膜癌的的侵襲轉(zhuǎn)移有十分密切的關(guān)系，且隨病理分級(jí)增高、肌層浸潤(rùn)加深及臨床分期升高而呈增加趨勢(shì)［14－15］。在我們的實(shí)驗(yàn)中，同時(shí)KD組中與侵襲轉(zhuǎn)移能力相關(guān)的MMP－2和MMP－9水平明顯下降，提示IGF－1R可能通過(guò)影響MMPs的水平來(lái)調(diào)節(jié)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的侵襲能力。

綜上所述，特異靶向IGF－1R的干擾片段能有效抑制子宮內(nèi)膜癌HEC－1B細(xì)胞內(nèi)源性IGF－1R的表達(dá)，降低IGF－1R的表達(dá)能抑制子宮內(nèi)膜癌的遷移和侵襲能力，同時(shí)能影響MMP－2和MMP－9的水平。IGF－1R可能成為抑制子宮內(nèi)膜癌發(fā)生、發(fā)展、侵襲的的分子治療靶點(diǎn)。

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