胡 婷， 陳梅香， 翁澤平， 謝思明， 鐘雪云

(暨南大學(xué)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)系，廣東廣州510632)

腦膠質(zhì)瘤是腦內(nèi)最常見的原發(fā)性腫瘤，侵襲性強(qiáng)、惡性進(jìn)展快，目前，主要采取外科手術(shù)聯(lián)合放、化療的綜合策略進(jìn)行治療?？就。踓armustine，1，3 -bis(2-chloroethyl)-1-nitrosourea，BCNU］是一種烷化劑，屬于亞硝基脲類藥物，因其高脂溶性和易于通過血腦屏障的特性，被公認(rèn)為是治療腦膠質(zhì)瘤的標(biāo)準(zhǔn)化療藥物［1］。然而，原發(fā)性耐藥和獲得性耐藥的產(chǎn)生已成為其化療失敗的主要原因。原發(fā)性耐藥和獲得性耐藥的機(jī)制復(fù)雜且不盡相同，目前相關(guān)研究多集中在原發(fā)性耐藥方面，獲得性耐藥的具體機(jī)制尚不太清楚。

近年來，發(fā)現(xiàn)了一類具有轉(zhuǎn)錄后調(diào)控作用的小分子、非編碼的微小RNA(microRNA，miRNA)在腫瘤中異常表達(dá)，并能以癌基因或抑癌基因角色參與腫瘤發(fā)生發(fā)展。人類成熟miRNA至少調(diào)控著30%的人類蛋白質(zhì)編碼基因。miRNA在膠質(zhì)瘤的發(fā)生、發(fā)展以及耐藥等過程中也具有重要作用。具有原癌基因作用的微小RNA-21(microRNA-21，miR-21在腦膠質(zhì)瘤中常呈過度高表達(dá)狀態(tài)［2］，其能影響細(xì)胞增殖能力及細(xì)胞對(duì)多種化療藥物的敏感性，但miR-21在人腦膠質(zhì)瘤耐BCNU過程中的作用和機(jī)制尚不清楚。另外，本實(shí)驗(yàn)室從人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞系SWO38中克隆出兩株亞系SWOZ1(BCNU原發(fā)性耐藥株)和SWOZ2(BCNU敏感株)，并通過BCNU誘導(dǎo)SWOZ2獲得了SWOZ2-BCNU細(xì)胞株(BCNU獲得性耐藥株)［3-4］。本研究通過實(shí)時(shí)熒光定量 PCR (real-time fluorescence quantitative PCR，RFQPCR)檢測(cè)SWOZ2及SWOZ2-BCNU細(xì)胞中miR-21表達(dá)水平并分析其與細(xì)胞對(duì)BCNU敏感度的關(guān)系;通過轉(zhuǎn)染上調(diào)SWOZ2中miR-21的表達(dá)，進(jìn)一步探討miR-21在腦膠質(zhì)瘤對(duì)BCNU產(chǎn)生獲得性耐藥過程中可能的作用及機(jī)制。

材料和方法

1 材料

1.1 主要材料和試劑 BCNU為天津藥業(yè)公司產(chǎn)品;CCK-8(Cell Counting Kit-8)為日本同仁公司產(chǎn)品;Trizol試劑為Invitrogen產(chǎn)品;PrimeScriptTM逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Premix Ex TaqTM熒光定量PCR試劑盒均為TaKaRa產(chǎn)品;miR-21和U6 snRNA的Bulge -LoopTMmiRNA qRT-PCR Primer Set為廣州銳博公司產(chǎn)品;miR-21 mimics和miRNA mimics negative control為上海吉瑪公司產(chǎn)品;jetPRIMETMTransfection

Reagent為Polyplus Transfection產(chǎn)品;第10號(hào)染色體同源缺失性磷酸酶及張力蛋白(phosphatase and tensin homology deleted on chromosome ten，PTEN)和磷酸化蛋白激酶B(phosphorylated protein kinase B，p -Akt)兔抗人單克隆抗體均為Cell Signaling產(chǎn)品;P -糖蛋白(P-glycoprotein，P-gp)鼠抗人單克隆抗體、0.45 μm硝酸纖維素膜皆為Millipore產(chǎn)品;β-肌動(dòng)蛋白(β-actin)鼠抗人單克隆抗體、辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)標(biāo)記山羊抗兔IgG和 HRP標(biāo)記山羊抗鼠 IgG均為 Protein Tech Group產(chǎn)品;BCA法蛋白質(zhì)定量試劑盒為海門碧云天公司產(chǎn)品;ECL底物發(fā)光檢測(cè)試劑盒為Pierce產(chǎn)品。1.2 主要儀器和設(shè)備 二氧化碳培養(yǎng)箱為Harris產(chǎn)品;倒置相差顯微鏡為Olympus產(chǎn)品;ELx800自動(dòng)酶標(biāo)儀為Bio-Tek產(chǎn)品;MiniOpticon Real-Time PCR System、垂直電泳儀和電轉(zhuǎn)移儀均為Bio-Rad產(chǎn)品。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞株SOWZ2與SWOZ2-BCNU由本實(shí)驗(yàn)室建株并凍存保藏［3-4］，用含10% 胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)的RPMI -1640培養(yǎng)基在37℃、5%CO2、飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，0.25%胰酶+0.02%EDTA消化傳代。

2.2 RFQ-PCR檢測(cè)細(xì)胞中miR-21的表達(dá) 提取RNA:應(yīng)用Trizol提取細(xì)胞的總RNA，經(jīng)分光光度計(jì)檢測(cè)，A260/A280值為1.8～2.1的用于cDNA合成。首先，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng):按說明進(jìn)行，用PrimeScriptTM逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，反應(yīng)體系20μL，62.5 nmol/L miR-21及U6 Bulge-LoopTMmiRNA RT Primer各2 μL，反應(yīng)條件為37℃ 15 min，85℃ 5 s。其次，RFQPCR:反應(yīng)體系20 μL，SYBR Premix Ex TaqTM10 μL，5 μmol/L Bulge-LoopTMmiR-21或U6 snRNA上、下游引物各1 μL，cDNA 1 μL，無酶水7 μL，反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性20 s，95℃ 10 s，60℃ 20 s，70℃30 s，擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)。最后，所得數(shù)據(jù)用2-ΔΔCt評(píng)定不同細(xì)胞株miR-21相對(duì)表達(dá)量，ΔCt=CtmiR-21-CtU6，ΔΔCt=ΔCt實(shí)驗(yàn)組-ΔCt對(duì)照組。

2.3 CCK-8檢測(cè)BCNU處理后膠質(zhì)瘤細(xì)胞的存活率 將SWOZ2及SWOZ2-BCNU兩種細(xì)胞在不含藥物的培養(yǎng)基中培養(yǎng)48 h，以3 000 cells/well接種于96孔板中，每孔200 μL，24 h后待細(xì)胞貼壁加入BCNU，設(shè)7個(gè)呈2倍遞增梯度濃度(2～128 mg/L)、1個(gè)不加藥物的對(duì)照孔，各種藥物濃度做3個(gè)平行孔。培養(yǎng)72 h后，加入10 μL CCK-8試劑，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后在酶標(biāo)儀上檢測(cè)各孔對(duì)波長為450 nm的吸光度(A)，計(jì)算細(xì)胞存活率，其計(jì)算公式為:存活率= (實(shí)驗(yàn)孔A值/對(duì)照孔A值)×100%，并通過軟件計(jì)算出藥物作用的半數(shù)抑制濃度(the half-maximal inhibitory concentration，IC50)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.4 轉(zhuǎn)染miR-21 mimics 取狀態(tài)良好、對(duì)數(shù)生長期的SWOZ2細(xì)胞消化、計(jì)數(shù)，以平均每孔5.0×105個(gè)細(xì)胞種植于6孔板中。實(shí)驗(yàn)組加30 nmol/L miR-21 mimics、200 μL jetPRIMETMBuffer及4 μL jetPRIMETMReagent(命名為轉(zhuǎn)染組或SWOZ2-miR-21 mimics);陰性對(duì)照組是將實(shí)驗(yàn)組中miR-21 mimics換為同濃度的miRNA mimics negative control，余同實(shí)驗(yàn)組(命名為對(duì)照組或SWOZ2-miR-control mimics);兩組皆用含5%FBS的RPMI-1640。液調(diào)至2 mL。24 h后將培養(yǎng)液更換為含10%FBS的RPMI-1640，轉(zhuǎn)染步驟嚴(yán)格按說明書執(zhí)行。轉(zhuǎn)染48 h后，提取各組細(xì)胞總RNA用RFQ-PCR檢測(cè)miR-21表達(dá)量，或提取各組細(xì)胞總蛋白用Western blotting檢測(cè)相關(guān)蛋白表達(dá)情況;或在轉(zhuǎn)染24 h后消化細(xì)胞，并按3 000 cells/well接種于96孔板培養(yǎng)12 h，按以上方法用梯度濃度BCNU處理細(xì)胞48 h后用CCK-8檢測(cè)各組細(xì)胞的存活率并計(jì)算IC50。

2.5 Western blotting檢測(cè)膠質(zhì)瘤細(xì)胞相關(guān)蛋白的表達(dá) 收集細(xì)胞，用RIPA細(xì)胞裂解液提取蛋白質(zhì)樣品。用BCA法在酶標(biāo)儀上用570 nm波長測(cè)定總蛋白濃度。樣本經(jīng)過SDS-PAGE電泳后，再用電轉(zhuǎn)儀以350 mA恒流1 h轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，分別加入PTEN(1∶1 000)、p-Akt (1∶1 000)、P-gp(1∶500)、內(nèi)參照 β-actin (1∶2 000)，4℃搖床孵育過夜，TBST洗膜3次，每次10 min。再加HRP標(biāo)記Ⅱ抗(1∶5 000)室溫孵育1 h，TBST洗膜3次，每次10 min。ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒顯影。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié)果

1 miR－21在細(xì)胞中的表達(dá)

1.1 miR-21的表達(dá) SWOZ2和SWOZ2-BCNU細(xì)胞中miR-21的表達(dá)量分別為1.000±0.079、2. 070±0.138，SWOZ2-BCNU細(xì)胞中miR-21的表達(dá)量明顯高于SWOZ2細(xì)胞(P＜0.01)，見圖1。

Figure 1.The relative expression of miR-21 in SWOZ2 and SWOZ2-BCNU cells detected by RFQ-PCR.±s.n=3.＊＊P＜0.01 vs SWOZ2.圖1RFQ－PCR檢測(cè)SWOZ2和SWOZ2－BCNU細(xì)胞中miR－21的表達(dá)

1.2 SWOZ2細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-21 mimics后miR-21的表達(dá) 轉(zhuǎn)染組miR-21的相對(duì)表達(dá)量(2 112.390 ±273.446)明顯高于對(duì)照組(1.000±0.069)(P＜0.01)，見圖2。

Figure 2.The relative expression of miR-21 in SWOZ2 cells transfected with miR-21 mimics or miR-control mimics for 48 h detected by RFQ-PCR.±s.n= 3.＊＊P＜0.01 vs miR-control mimics(control).圖2RFQ－PCR檢測(cè)SWOZ2細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR－21 mimics或miR－control mimics 48 h后miR－21的表達(dá)

2 細(xì)胞對(duì)BCNU的敏感性

2.1 SWOZ2-BCNU細(xì)胞對(duì)BCNU的耐藥性高于SWOZ2BCNU處理后SWOZ2-BCNU細(xì)胞的存活率高于SWOZ2細(xì)胞，見圖3;BCNU對(duì)SWOZ2和SWOZ2 -BCNU細(xì)胞的IC50分別為(25.160±2.604)mg/L和(58.800±9.264)mg/L，SWOZ2-BCNU細(xì)胞對(duì)BCNU的耐藥指數(shù)為2.34，明顯高于SWOZ2細(xì)胞(P＜0.05)，見圖4。

2.2 SWOZ2細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-21 mimics后對(duì)BCNU耐藥性的變化 轉(zhuǎn)染組細(xì)胞的存活率高于對(duì)照組，見圖5;BCNU對(duì)轉(zhuǎn)染組和對(duì)照組細(xì)胞的IC50分別為(48.020±0.698)mg/L和(35.460±1.796)mg/L，轉(zhuǎn)染組細(xì)胞對(duì)BCNU的耐藥性明顯高于對(duì)照組(P＜0.01)，見圖6。

Figure 3.The viability of SWOZ2 and SWOZ2-BCNU cells treated with BCNU for 72 h detected by CCK-8 assay.±s.n=3.圖3CCK－8檢測(cè)BCNU處理72 h后SWOZ2和SWOZ2－BCNU細(xì)胞的存活率

Figure 4.The IC50of BCNU for SWOZ2 and SWOZ2-BCNU cells 72 h after treatment detected by CCK-8 assay.±s.n=3.*P＜0.05 vs SWOZ2.圖4CCK－8檢測(cè)BCNU處理72h后SWOZ2和SWOZ2－BCNU的IC50

3 Western blotting檢測(cè)細(xì)胞中相關(guān)蛋白的表達(dá)

3.1 SWOZ2和SWOZ2-BCNU細(xì)胞中PTEN、p-Akt和P-gp蛋白的表達(dá) 與SWOZ2細(xì)胞相比，SWOZ2-BCNU細(xì)胞中PTEN蛋白表達(dá)量明顯下降(P＜0.01)，而 p-Akt的表達(dá)量明顯升高(P＜0.05)，P-gp的表達(dá)量也明顯升高(P＜0.01)，見圖7。

Figure 5.The viability of SWOZ2 cells transfected with miR-21 mimics or miR-control mimics 48 h after BCNU treatment detected by CCK-8 assay.±s.n=3.圖5 CCK－8檢測(cè)BCNU處理轉(zhuǎn)染miR－21 mimics或miR－control mimics的SWOZ2細(xì)胞48 h后細(xì)胞的存活率

Figure 6.The IC50of BCNU for SWOZ2 cells transfected with miR-21 mimics or miR-control mimics 48 h after treatment detected by CCK-8 assay..n=3.＊＊P＜0.01 vs miR-control mimics.圖6 CCK－8檢測(cè)BCNU處理48 h后對(duì)轉(zhuǎn)染了miR－21 mimics或miR－control mimics的SWOZ2細(xì)胞的IC50

Figure 7.The relative expression of PTEN，p-Akt and P-gp in SWOZ2 and SWOZ2-BCNU cells detected by Western blotting. s.n=3.*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs SWOZ2.圖7 Western blotting檢測(cè)SWOZ2和SWOZ2－BCNU細(xì)胞中PTEN和p－Akt的表達(dá)

3.2 轉(zhuǎn)染miR-21 mimics對(duì)SWOZ2細(xì)胞中PTEN、p-Akt和P-gp表達(dá)的影響 與對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)染組細(xì)胞中PTEN蛋白表達(dá)量明顯降低 (P＜0.01)，而p-Akt的表達(dá)量則明顯升高(P＜0.01)，P-gp的表達(dá)量也明顯升高(P＜0.01)，見圖8。

該結(jié)果表明，在miR-21表達(dá)上調(diào)的細(xì)胞中PTEN蛋白表達(dá)下降，而p-Akt和P-gp蛋白表達(dá)增加。

Figure 8.The relative expression of PTEN，p-Akt and P-gp in SWOZ2 cells transfected with miR-21 mimics or miR-control mimics for 48 h detected by Western blotting.±s.n=3.＊＊P＜0.01 vs miR-control mimics.圖8 Western blotting檢測(cè)轉(zhuǎn)染miR－21 mimics或miR－control mimics 48 h后SWOZ2細(xì)胞中PTEN和p－Akt的表達(dá)

討論

化療是治療人腦膠質(zhì)瘤的一種重要手段，耐藥性的產(chǎn)生是其治療的重大障礙。腫瘤細(xì)胞的耐藥性包括原發(fā)性耐藥和獲得性耐藥。細(xì)胞耐藥的主要機(jī)制包括:(1)多種糖蛋白介導(dǎo)的藥物外排泵機(jī)制，包括P-gp、多藥耐藥相關(guān)蛋白(multidrug resistance associated protein，MRP)、肺耐藥相關(guān)蛋白(lung resistance-associated protein，LRP)、乳腺癌耐藥蛋白(breast cancer resistance protein，BCRP)等，這些蛋白均為能量依賴性藥物外排泵，可將細(xì)胞內(nèi)的藥物轉(zhuǎn)運(yùn)出細(xì)胞，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)藥物濃度減低而產(chǎn)生耐藥。(2)酶介導(dǎo)的耐藥機(jī)制，包括谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(glutathione S-transferases，GST)，能催化藥物與谷胱甘肽結(jié)合，形成水溶性較高的復(fù)合物，促進(jìn)藥物從體內(nèi)排泄。拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ(topoisomorasesⅡ，TopoⅡ)，能與藥物結(jié)合，促進(jìn)DNA斷裂。蛋白激酶C能誘導(dǎo)多藥耐藥基因1(multidrug resistance-1，mdr1)表達(dá)，促進(jìn)P-gp磷酸化。(3)凋亡調(diào)控基因介導(dǎo)的耐藥，其中與耐藥相關(guān)的基因有B淋巴細(xì)胞瘤2(B -cell lymphoma，bcl－2)、生存素(survivin)、骨髓細(xì)胞瘤癌基因(myelocytomatosis oncogene，c－myc);抑癌基因p53及PTEN等抑癌基因。(4)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路異常介導(dǎo)的耐藥，如磷酸肌醇-3激酶/蛋白激酶B (phosphoinositide 3-kinase/protein kinase B，PI3K/ Akt)通路及核因子κB(nuclear factor kappa B，NF-κB)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路激活導(dǎo)致的細(xì)胞多藥耐藥［5］。但有關(guān)耐藥方面的研究多沒有嚴(yán)格區(qū)分原發(fā)性耐藥或是獲得性耐藥，有關(guān)腦膠質(zhì)瘤對(duì)BCNU產(chǎn)生獲得性耐藥的機(jī)制依然不甚清楚。

新近的研究發(fā)現(xiàn)，具有轉(zhuǎn)錄后調(diào)控作用的小分子、非編碼miRNA在細(xì)胞的分化、增殖、凋亡、胚胎發(fā)育等生命活動(dòng)中具有重要作用，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲、耐藥以及診斷和預(yù)后等方面也具有重要作用。自1993年發(fā)現(xiàn)lin-4以來，目前，miRNA基因序列數(shù)據(jù)庫(http://www.mirbase.org/Release 18: November 2011)已收錄了動(dòng)植物及病毒等成熟miRNA 18 226條，其中人類的為1 527條。

與小干擾RNA完全互補(bǔ)的作用方式不同，miRNA與靶mRNA的相互作用是以完全互補(bǔ)或部分互補(bǔ)的方式相結(jié)合的，一種miRNA可作用于多種mRNA，多個(gè)miRNA也可協(xié)同作用于同一個(gè)mRNA［6］。miRNA可能是基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)、可能是腫瘤治療的有效新靶點(diǎn)。

在腦膠質(zhì)瘤中，miR-21、miR-125b、miR-221、miR-222和miR-10b等17個(gè)miRNA呈過度高表達(dá)，而miR-7、miR-181a/b/c、miR-124、miR -137和 miR-128等33個(gè) miRNA的表達(dá)下調(diào)［7-8］。具有原癌基因活性的miR-21位于染色體的脆性區(qū)域17q23.2。miR-21在乳腺癌、肝癌以及腦膠質(zhì)瘤等多種惡性腫瘤中高表達(dá)，與腫瘤的惡性分級(jí)正相關(guān)。在不同級(jí)別膠質(zhì)瘤中，膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(glioblastoma，GBM)中miR-21的表達(dá)上調(diào)最明顯，miR-21可作為GBM的獨(dú)立預(yù)后指標(biāo)［9］。敲除GBM細(xì)胞中的miR-21，細(xì)胞生長受抑、凋亡增強(qiáng)、侵襲能力減弱并可抑制腫瘤的發(fā)生。本研究通過RFQ-PCR分析發(fā)現(xiàn)，SWOZ2-BCNU細(xì)胞(BCNU獲得性耐藥株)中 miR-21的表達(dá)量較其親本SWOZ2細(xì)胞(BCNU敏感株)明顯升高。為進(jìn)一步觀察miR-21在膠質(zhì)瘤細(xì)胞對(duì)BCNU耐藥過程中的作用，本研究將miR-21 mimics和陰性對(duì)照序列分別轉(zhuǎn)入SWOZ2細(xì)胞，繼而用RFQ-PCR檢測(cè)兩組細(xì)胞miR-21的表達(dá)，發(fā)現(xiàn):與對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)染組SWOZ2-miR-21-mimics細(xì)胞中，miR-21的表達(dá)顯著上調(diào)，轉(zhuǎn)染組細(xì)胞對(duì)BCNU的耐藥性亦明顯升高。這些結(jié)果表明，miR-21表達(dá)上調(diào)后可介導(dǎo)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞對(duì)BCNU產(chǎn)生獲得性耐藥。相關(guān)研究也發(fā)現(xiàn)了類似的結(jié)果:Li等［10］在多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中發(fā)現(xiàn)，抑制miR-21的功能可上調(diào)靶因子富亮氨酸重復(fù)序列相互作用蛋白1(leucine-rich repeat flightless-interacting protein 1，LRRFIP1)的表達(dá)，進(jìn)而導(dǎo)致NF-κB的活化，導(dǎo)致膠質(zhì)瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物替尼泊甙敏感性增強(qiáng);Shi等［11］在U87MG中發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)miR-21可降低Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bcl-2-associated X protein，Bax)和半胱氨酸蛋白酶 3 (caspase-3)的表達(dá)、降低Bax/Bcl-2的比值，進(jìn)而抑制替莫唑胺誘導(dǎo)的凋亡。這些結(jié)果表明，腦膠質(zhì)瘤中miR-21表達(dá)的上調(diào)可介導(dǎo)細(xì)胞對(duì)化療藥物耐藥。

在遺傳背景相同的細(xì)胞中，miR-21可能是通過轉(zhuǎn)錄后調(diào)控某些蛋白的表達(dá)進(jìn)而介導(dǎo)細(xì)胞對(duì)BCNU發(fā)生獲得性耐藥。有研究發(fā)現(xiàn)，在肝細(xì)胞癌、乳腺癌等多種腫瘤中，抑癌因子PTEN是miR-21的直接靶標(biāo)［12］。在腦膠質(zhì)瘤，特別是高級(jí)別的腦膠質(zhì)瘤中，PTEN基因常發(fā)生突變或缺失、PTEN蛋白表達(dá)常呈下調(diào)或缺失狀態(tài)。PTEN蛋白是PI3K/Akt通路的負(fù)性調(diào)節(jié)因子，PTEN可參與引起腦膠質(zhì)瘤對(duì)藥物耐藥［13］。本研究通過Western blotting分析發(fā)現(xiàn)，相對(duì)于親本細(xì)胞SWOZ2而言，在miR-21高表達(dá)且耐BCNU的SWOZ2-BCNU細(xì)胞中，PTEN蛋白的表達(dá)明顯下調(diào)，而p-Akt和P-gp的表達(dá)卻明顯上調(diào)。本研究進(jìn)一步通過轉(zhuǎn)染和相關(guān)分析，發(fā)現(xiàn):與對(duì)照組相比，上調(diào)miR-21表達(dá)后的轉(zhuǎn)染組細(xì)胞，不僅對(duì)BCNU的耐藥性明顯增強(qiáng)，而且其細(xì)胞中PTEN蛋白表達(dá)明顯下調(diào)、p-Akt和P-gp蛋白表達(dá)明顯上調(diào)。PTEN蛋白是PI3K/Akt通路的負(fù)性調(diào)節(jié)因子，轉(zhuǎn)染組細(xì)胞PTEN蛋白表達(dá)下調(diào)后可激活PI3K/Akt通路并導(dǎo)致p-Akt表達(dá)上調(diào)。相關(guān)研究也發(fā)現(xiàn):在乳腺癌、白血病中，miR-21能下調(diào)PTEN蛋白的表達(dá)進(jìn)而引起細(xì)胞對(duì)化療藥物耐藥［14-15］;激活p-Akt可上調(diào)P-gp進(jìn)而引起胃癌細(xì)胞的多藥耐藥［16］。本研究結(jié)果和相關(guān)資料表明，在腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞中，上調(diào)miR-21可降低PTEN蛋白的表達(dá)、激活PI3K/Akt通路，繼而上調(diào)P-gp表達(dá)，進(jìn)而介導(dǎo)細(xì)胞對(duì)BCNU耐藥。

BCNU上調(diào)miR-21表達(dá)的具體機(jī)制尚不清楚。BCNU可上調(diào)脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)進(jìn)而增加細(xì)胞因子白細(xì)胞介素6(interleukin 6，IL-6)等的釋放［17-18］;信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3(signal transducer and activator of transcription 3，STAT3)在多種惡性腫瘤以及腦膠質(zhì)瘤中高表達(dá)，IL-6可通過激活的STAT3靶向上調(diào)miR-21促進(jìn)多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞的存活［19］。這些資料表明，BCNU或許可通過上調(diào)LPS、增加IL-6的釋放繼而激活STAT3，進(jìn)而上調(diào)miR-21的表達(dá)。但在BCNU誘導(dǎo)耐藥的SWOZ2-BCNU細(xì)胞中，miR-21的表達(dá)上調(diào)是否由LPS/IL-6/STAT3調(diào)控尚需進(jìn)一步研究。

在膠質(zhì)瘤中，miR-21還可靶向作用于基質(zhì)金屬蛋白酶抑制因子Kazal基序逆向誘導(dǎo)半胱氨酸豐富蛋白(reversion-inducing-cysteine-rich protein with Kazal motifs，RECK)、金屬蛋白酶組織抑制因子(tissue inhibitor of metalloproteinase，TIMP)、程序性細(xì)胞死亡因子4、異質(zhì)核核糖核蛋白K、轉(zhuǎn)錄激活型p63(transcription activation p63，TAp63)和LRRFIP1，參與調(diào)節(jié)p53、轉(zhuǎn)化生長因子β(transforming growth factor beta，TGF-β)、線粒體凋亡、NF-κB、Bcl-2、表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)通路等［20］。總之，作為一種致癌基因的miR -21可參與調(diào)節(jié)多條信號(hào)通路中多種腫瘤相關(guān)蛋白的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞生長、抑制凋亡、提高腫瘤的耐藥性;miR-21可能是基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)，靶作用于miR-21或許能發(fā)揮“單擊多靶”效應(yīng)，miR-21可能是腦膠質(zhì)瘤等惡性腫瘤治療的一個(gè)有效靶標(biāo)。然而，miR-21在細(xì)胞內(nèi)的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)是錯(cuò)綜復(fù)雜的，細(xì)胞調(diào)控miR-21表達(dá)的具體機(jī)制仍有待深入探究。

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