羅 瓊， 姜 儻， 陳 景， 肖定璋△

(廣東省人民醫(yī)院1血液科，2醫(yī)學(xué)研究中心，廣東廣州510080;3中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣東廣州510080)

據(jù)WHO統(tǒng)計(jì)，目前全世界丙型肝炎病毒(hepatitis C virus，HCV)的感染率為3%［1］，約1.7億人感染丙型肝炎病毒。我國(guó)一般人群中抗HCV的陽(yáng)性率為3.2%，感染人數(shù)約4000萬(wàn)。統(tǒng)計(jì)分析表明55%～85%HCV感染者不能清除病毒而轉(zhuǎn)為慢性感染;丙肝一旦慢性化，10%～20%患者在20～30年內(nèi)發(fā)展為肝硬化，1%～7%將發(fā)展為肝癌［2］。與乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)感染一樣，丙型肝炎感染病毒是導(dǎo)致肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)的重要危險(xiǎn)因素，我國(guó)目前已能有效控制乙型肝炎病毒感染，但丙型肝炎感染卻依然呈上升趨勢(shì)，值得高度重視。

HCV基因1b亞型是目前感染最普遍的類(lèi)型，已有充分證據(jù)表明HCV1b型與慢性持續(xù)性感染、肝硬化和肝細(xì)胞癌有密切關(guān)系［3－6］。HCV感染引起慢性肝炎、肝硬化和肝細(xì)胞癌是一個(gè)長(zhǎng)期復(fù)雜的過(guò)程，在這個(gè)過(guò)程中，HCV核心蛋白通過(guò)影響多條細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，使受感染的細(xì)胞反復(fù)出現(xiàn)損傷與再生，最終導(dǎo)致纖維化或癌細(xì)胞出現(xiàn)。由于HCV－1b基因亞型的感染具有普遍性與典型性，所以成為國(guó)內(nèi)外的研究熱點(diǎn)。

我們構(gòu)建了丙型肝炎病毒核心蛋白(HCV－core－1b)基因真核重組質(zhì)粒，利用此質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞株，獲得穩(wěn)定表達(dá)HCV－core－1b的HepG2細(xì)胞株。采用流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期的變化，采用Western blotting檢測(cè)細(xì)胞cyclin D1和pRb/p130的表達(dá)水平，探討丙肝病毒慢性感染的內(nèi)在機(jī)制。

材料和方法

1 材料

1.1 質(zhì)粒與菌株 大腸桿菌DH5α購(gòu)自TaKaRa。表達(dá)載體pBabe－Flag－puro由本研究室改造構(gòu)建。

1.2 試劑與材料 pLXSN－HCV－core－1b由加拿大McGill大學(xué)Rongtuan Lin教授惠贈(zèng)，屬HCV1b亞型，cDNA全長(zhǎng)576 bp。限制性?xún)?nèi)切酶EcoRⅠ、SalⅠ和Pfu聚合酶、T4DNA連接酶購(gòu)自TaKaRa。質(zhì)粒小量提取試劑盒購(gòu)自上海Tiangen。質(zhì)粒純化試劑盒購(gòu)自Qiagen。PCR引物合成及序列測(cè)定，由上海博尚生物技術(shù)有限公司完成。DNA marker DL2000購(gòu)自TaKaRa。蛋白預(yù)染marker購(gòu)自Fermentas。丙烯酰胺、N，N'－亞甲叉雙丙烯酰胺、TEMED均購(gòu)自Sigma。Falg及anti－GAPDH鼠單克隆抗體均購(gòu)自Santa Cruz。

2 方法

2.1 pBabe－Flag－puro質(zhì)粒擴(kuò)增 pBabe－Flagpuro質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞，制備含100 μg/L氨芐青霉素LB瓊脂糖平板，將轉(zhuǎn)化菌涂于平板上，37℃倒置培養(yǎng)，第2 d挑取轉(zhuǎn)化菌落，經(jīng)LB液體培養(yǎng)基過(guò)夜擴(kuò)增培養(yǎng)后，按質(zhì)粒提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取pBabe－Flag－puro質(zhì)粒，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2 引物設(shè)計(jì)及合成 從 PubMed/Nucleotide－ AF165052獲取編碼hepatitis C virus subtype 1b的ORF全長(zhǎng)序列，根據(jù)pBabe－Flag－puro載體設(shè)計(jì)HCV－core－1b克隆引物。為便于隨后的定向克隆，在上游引物5’端添加限制性?xún)?nèi)切酶EcoRⅠ識(shí)別序列(下畫(huà)線(xiàn))和起始密碼子ATG(斜體)，在下游引物添加限制性?xún)?nèi)切酶SalⅠ識(shí)別序列(下畫(huà)線(xiàn))和終止密碼子TAG(反義)。目的片段為576 bp，引物合成由博尚公司合成完成。引物分別位于閱讀框前后的兩端，即:上游引物5’－ATATGAATTCCATGAGCACAAATCCTAAACCTCA－3’，下游引物5’－ATAGGTCGACCTAAGCGGAAGCTGGGATG－3’。

2.3 獲取HCV－core－1b全長(zhǎng)cDNA目的片段以pLXSN－HCV－core－1b為模版，采用高保真Pfu酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系:總體積100 μL，模板cDNA 1 μL，上下游引物各10 pmol/L，常規(guī)量dNTPs，Mg2+及Pfu酶，10×PCR buffer。反應(yīng)條件: 94℃ 預(yù)變5 min后，94℃ 30 s，57℃ 45 s，72℃2 min，循環(huán)30次，72℃ 10 min，4℃保存。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定后，按上海Tiangen公司瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒回收目的片段DNA。

2.4 pBabe－Flag－puro－HCV－core－1b表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及序列測(cè)定 pBabe－Flag－puro載體與PCR產(chǎn)物分別用EcoRⅠ和SalⅠ酶進(jìn)行雙酶切。純化酶切產(chǎn)物，用T4DNA連接酶(TaKaRa)將pBabe－Flag－puro載體與目的片段進(jìn)行連接反應(yīng)，于16℃連接過(guò)夜。采用氯化鈣制備DH5α感受態(tài)菌，將7 μL重組質(zhì)粒與200 μL DH5α感受態(tài)菌充分混勻，冰浴30 min，置42℃水浴90s，再冰浴2 min。然后加入LB培養(yǎng)液800 μL，37℃振搖45 min，接種于LB+氨芐青霉素瓊脂培養(yǎng)皿中，37℃下培養(yǎng)16h。挑取細(xì)菌克隆，接種于含 Amp100 μg/L的LB培養(yǎng)基中置37℃振搖培養(yǎng)擴(kuò)增，搖菌過(guò)夜。取2 mL菌液，用質(zhì)粒小量提取試劑盒提取質(zhì)粒，經(jīng)酶切鑒定篩選重組質(zhì)粒陽(yáng)性克隆。酶切鑒定正確的重組質(zhì)粒陽(yáng)性克隆接種于氨芐青霉素+LB培養(yǎng)液中，置37℃振搖培養(yǎng)，大量擴(kuò)增。使用質(zhì)粒純化試劑盒大量制備質(zhì)粒DNA。送上海博尚生物技術(shù)有限公司測(cè)序鑒定，將測(cè)序獲得序列在GenBank上進(jìn)行BLAST比較分析，并與HCV－core－1b序列比較。

將構(gòu)建的測(cè)序正確的融合基因重組質(zhì)粒命名為pBabe－Flag－puro－HCV－core－1b，以同樣方法獲得的載體對(duì)照質(zhì)粒命名為pBabe－Flag－puro。

2.5 質(zhì)粒大量提取以備用轉(zhuǎn)染 采用質(zhì)粒純化試劑盒大量制備質(zhì)粒DNA。

2.6 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染病毒包裝細(xì)胞株和重組質(zhì)粒病毒感染靶細(xì)胞

2.6.1 采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)將新構(gòu)建的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染病毒包裝細(xì)胞Pheonix 293T。

2.6.2 采用Puromycin篩選上述包裝細(xì)胞，獲得高分泌HCV－core－1b病毒的包裝細(xì)胞株。

2.6.3 HepG2細(xì)胞株接種到6孔板中，加入3 mL Phoenix－pBabe－Flag－HCV－core－1b細(xì)胞上清濾液并加入6 mg/L polybrene，37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)，重復(fù)感染2次，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，更換含1 mg/L嘌呤霉素的完全培養(yǎng)基篩選培養(yǎng)，每3～4 d換液一次，約30 d后篩選完成。同時(shí)感染pBabe－Flag空載體作為對(duì)照。細(xì)胞擴(kuò)增、傳代，所產(chǎn)生的細(xì)胞株經(jīng)Western blotting檢測(cè)后Flag－HCV－core－1b過(guò)表達(dá)者命名為HepG2－pBabe－Flag－HCV －core－1b，對(duì)照組命名為HepG2－pBabe－Flag－mock。本研究中的實(shí)驗(yàn)組，是選取多個(gè)Flag－HCV－core－1b過(guò)表達(dá)細(xì)胞克隆混合后組成的，以避免極性誤差。對(duì)照組也是由多克隆組成。

2.7 Western blotting檢測(cè)重組Flag－HCV－core－1b蛋白及其它相關(guān)蛋白的表達(dá) 將轉(zhuǎn)染完成HepG2細(xì)胞株后輕輕混勻后置37℃、5%CO2孵箱培養(yǎng)48 h。同時(shí)轉(zhuǎn)染pBabe－Flag空載體作為對(duì)照。用適量細(xì)胞裂解液裂解。采用Bio－Rad蛋白分析液檢測(cè)蛋白濃度。以50 μg/well總蛋白上樣，12%SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到PVDF膜，用含5%脫脂奶粉的TTBS(0.1mol/L Tris－HCl，pH 7.5，0.2%NaCl;0.05%Tween20)室溫封閉1～2 h，TTBS漂洗5 min×3次，分別加入anti－Flag小鼠單克隆抗體(1∶1 000稀釋)cyclin D1、p130、鼠抗人GAPDH單克隆抗體(1∶1 000稀釋)，4℃孵育過(guò)夜。TTBS漂洗5 min×3次;鼠抗辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記Ⅱ抗(1∶2 000稀釋)37℃孵育1 h;TTBS漂洗5 min ×3次;采用Sper－Signal Weste Femto敏感曝光試劑盒，增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光反應(yīng)(ECL)曝光底片顯影。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次以上，并采用Quality one軟件分析。

2.8 流式細(xì)胞儀分析HepG2、HepG2－pBabe－Flag－mock和HepG2－pBabe－Flag－HCV －core－1b細(xì)胞的細(xì)胞周期 將HepG2、HepG2－pBabe－Flag－mock和HepG2－pBabe－Flag－HCV －core－1b細(xì)胞分別用0.25%胰蛋白酶和0.02%EDTA(1∶1)消化細(xì)胞，制備單個(gè)細(xì)胞懸液，并用預(yù)冷的PBS洗滌2次。70%乙醇固定洗后沉淀的細(xì)胞，置－20℃過(guò)夜。經(jīng)300×g離心5 min，細(xì)胞重懸于含 1 g/L RNase A的PBS緩沖液中，置37℃孵育30 min。調(diào)整細(xì)胞濃度5×108cells/L，加入流式細(xì)胞儀(FCM)專(zhuān)用分析試管中，每管100 μL，用ProfileⅡ型流式細(xì)胞儀，在488 nm激發(fā)波長(zhǎng)下測(cè)定細(xì)胞DNA，用Multicycle軟件分析細(xì)胞周期分布情況。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用SPSS 17.0軟件，兩組數(shù)據(jù)比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1 Flag－HCV－core－1b表達(dá)質(zhì)粒的篩選及序列測(cè)定

重組質(zhì)粒pBabe－Flag－HCV－core－1b經(jīng)限制性?xún)?nèi)切酶EcoRⅠ和SalⅠ酶切后，1.0%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果，在570 bp處出現(xiàn)特異性擴(kuò)增條帶，片段大小與預(yù)期值相符，且無(wú)非特異性擴(kuò)增帶，初步判斷此條帶為576 bp的HCV－core－1b目的條帶。而空載體pBabe－Flag－mock未見(jiàn)條帶出現(xiàn)，初步表明載體構(gòu)建成功，見(jiàn)圖1。

Figure 1.PCR results for constructed pBabe－Flag－HCV－core－1b.1:pBabe－Flag vector;2:pBabe－Flag－HCV－core－1b(digested by EcoRⅠand SalⅠ);M:marker.圖1 重組質(zhì)粒pBabe－Flag－HCV－core－1b的PCR結(jié)果

2 序列分析

將重組質(zhì)粒pBabe－Flag－HCV－core－1b擴(kuò)增純化后送上海博尚生物有限公司測(cè)序，測(cè)序得到的克隆基因序列與文獻(xiàn)報(bào)道［4］一致，表明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功，見(jiàn)圖2。

3 重組質(zhì)粒pBabe－Flag－HCV－core－1b轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞，Western blotting檢測(cè)Flag－HCV－core－1b蛋白的表達(dá)

Western blotting實(shí)驗(yàn)表明，anti－Flag抗體檢測(cè)pBabe－Flag－HCV－core－1b轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞，其蛋白提取物在分子量22 kD顯現(xiàn)條帶，未轉(zhuǎn)染組與空載體轉(zhuǎn)染對(duì)照組22 kD處未見(jiàn)條帶，GAPDH蛋白內(nèi)參照顯示各泳道蛋白量基本等量，見(jiàn)圖3。

Figure 2.Sequence analyze of pBabe－Flag－HCV－core－1b圖2 pBabe－Flag－HCV－core－1b測(cè)序結(jié)果

Figure 3.Detection of HCV core protein expression in HepG2 cells.圖3 Western blotting檢測(cè)HepG2細(xì)胞Flag－HCV－core－1b蛋白的表達(dá)

4 HCV－core－1b過(guò)表達(dá)對(duì)HepG2細(xì)胞生長(zhǎng)周期的影響

HepG2細(xì)胞過(guò)表達(dá)HCV－core－1b，細(xì)胞生長(zhǎng)顯著受到抑制。流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞生長(zhǎng)周期發(fā)現(xiàn)，HepG2－pBabe－Flag－mock細(xì)胞G0/G1期比例為50.58%±1.94%，S期為42.13%±1.34%;而 HepG2－pBabe－Flag－HCV－core－1b細(xì)胞G0/G1期比例為 71.80% ±3.12%，S期為 17.12% ± 0.98%;兩組比較有顯著差異(P＜0.01)，見(jiàn)圖4。

5 HCV－core－1b的過(guò)表達(dá)抑制HepG2細(xì)胞cyclin D1的表達(dá)

比較 HepG2、HepG2－pBabe－Flag－mock和HepG2－pBabe－Flag－HCV－core－1b細(xì)胞中cyclin D1表達(dá)發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染組和未轉(zhuǎn)染組比較有顯著差異(P＜0.01)，見(jiàn)圖5。

6 HCV－core－1b蛋白抑制Rb磷酸化，抑制HepG2細(xì)胞中pRb/p130的表達(dá)

比較 HepG2、HepG2－pBabe－Flag－mock和HepG2－pBabe－Flag－HCV －core－1b細(xì)胞中pRb/p130表達(dá)發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染組和未轉(zhuǎn)染組比較有顯著差異(P＜0.01)，見(jiàn)圖6。

Figure 4.Effect of overexpression of HCV－core－1b on cell cycle progression of HepG2 cells.圖4 流式細(xì)胞儀檢測(cè)HepG2、HepG2－pBabe－Flag－mock和HepG2－pBabe－Flag－HCV－core－1b細(xì)胞生長(zhǎng)周期的結(jié)果

討論

丙肝病毒在細(xì)胞內(nèi)持續(xù)感染是慢型肝炎重癥化、肝硬化和肝細(xì)胞癌的發(fā)生基礎(chǔ)。在丙肝慢性感染過(guò)程中，肝臟損傷與再生反復(fù)交替發(fā)生，病變組織可見(jiàn)變性細(xì)胞、活躍增殖的病變細(xì)胞與肝硬化結(jié)構(gòu)［7－8］，說(shuō)明HCV感染造成肝細(xì)胞損傷的同時(shí)，促衍進(jìn)肝細(xì)胞再生和部分細(xì)胞纖維化改變，最終導(dǎo)致肝細(xì)胞纖維化和肝癌。已有研究認(rèn)為HCV－core－1b型與慢型肝炎重癥化、肝硬化和肝細(xì)胞癌有密切相關(guān)［3－6］，但其內(nèi)在機(jī)制并不完全明了。

Figure 5.Inhibition of cyclin D1 by core protein in HepG2 cells.±s.n=3.*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs HepG2.△△P＜0.01 vs HepG2－pBabe－Flag－mock.圖5 Western blotting檢測(cè)HCV－core－1b過(guò)表達(dá)對(duì)HepG2細(xì)胞cyclin D1表達(dá)的影響

Figure 6.Inhibition of pRb/p130 by core protein in HepG2 cells.±s.n=3.＊＊P＜0.01 vs HepG2.△△P＜0.01 vs HepG2－pBabe－Flag－mock.圖6 Western blotting檢測(cè)HCV－core－1b過(guò)表達(dá)對(duì)HepG2細(xì)胞pRb/p130表達(dá)的影響

HCV－core是HCV的結(jié)構(gòu)蛋白，在各亞型HCV病毒中高度保守，由191個(gè)氨基酸組成。丙肝核心蛋白不僅參與調(diào)節(jié)HCV病毒RNA翻譯、病毒粒子組裝，與糖蛋白作用產(chǎn)生完整的病毒粒子。還參與細(xì)胞內(nèi)蛋白的相互作用、影響細(xì)胞中信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與脂質(zhì)代謝、調(diào)控細(xì)胞漸進(jìn)性死亡或凋亡、促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)和永生化［9］。Simmoonds［3］根據(jù)HCV核苷酸的同型程度，將HCV分為6個(gè)主要基因型，各型由若干亞型組成(即a－c)。1b亞型是目前最普遍的感染亞型。HCV－core在各亞型中高度保守，研究顯示感染丙型肝炎患者，血液中HCVcAg與HCV RNA密切相關(guān)，檢測(cè)HCVcAg是診斷HCV的金標(biāo)準(zhǔn)［10］。

本研究根據(jù)HCV－core－1b基因的開(kāi)放閱讀框(ORF)，設(shè)計(jì)PCR擴(kuò)增引物，采用Eco RⅠ和SalⅠ酶切PCR產(chǎn)物，亞克隆入pBabe－Flag－puro載體，重組質(zhì)粒pBabe－Flag－HCV－core－1b經(jīng)酶切及測(cè)序鑒定。采用逆轉(zhuǎn)錄病毒感染技術(shù)將新構(gòu)建的重組質(zhì)粒感染靶細(xì)胞HepG2，測(cè)序結(jié)果得到的克隆基因序列與文獻(xiàn)報(bào)道一致，Western blotting檢測(cè)蛋白的表達(dá)，anti－Flag抗體檢測(cè)見(jiàn)pBabe－Flag－HCV－core－1b轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞，其蛋白提取物在分子量22 kD顯現(xiàn)條帶，未轉(zhuǎn)染組與空載體轉(zhuǎn)染對(duì)照組22 kD處未見(jiàn)條帶，GAPDH蛋白內(nèi)參照顯示各泳道蛋白量基本等量，見(jiàn)圖3，說(shuō)明穩(wěn)定表達(dá)pBabe－Flag－HCV－core－1b的HepG2細(xì)胞株篩選是成功的。

關(guān)于HCV－core對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)周期、凋亡的影響，不同學(xué)者用于實(shí)驗(yàn)研究的靶細(xì)胞系不同，所得的結(jié)果不盡相同。長(zhǎng)期慢性感染是丙肝病毒致病的典型過(guò)程，為了真實(shí)反映這一特征，我們?cè)谘芯恐胁捎没蜣D(zhuǎn)染技術(shù)將HCV－core－1b基因組導(dǎo)入包裝細(xì)胞，再用包裝細(xì)胞分泌產(chǎn)生的病毒感染HepG2細(xì)胞，從而建立長(zhǎng)期穩(wěn)定表達(dá)HCV－core－1b的HepG2細(xì)胞株。HCV－core－1b－HepG2細(xì)胞株中HCV復(fù)制水平較低，與人體內(nèi)病毒持續(xù)慢性感染相似，用于研究丙肝、丙肝相關(guān)的肝硬化和肝細(xì)胞癌的發(fā)生機(jī)制具備一定優(yōu)勢(shì)。該細(xì)胞株自建立后一直穩(wěn)定表達(dá)HCV－core－1b蛋白，為下一步研究提供了可靠的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

我們采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)HepG2、HepG2－pB-abe－Flag－mock以及HepG2－pBabe－Flag－HCV－core－1b細(xì)胞的生長(zhǎng)周期，分析 HCV－core對(duì)HepG2細(xì)胞生長(zhǎng)周期的影響，發(fā)現(xiàn)HepG2－pBabe－Flag－HCV－core－1b停留 G0/G1期比例為71.80%±3.12%，S期為17.12% ±0.98%，而對(duì)照組HepG2－pBabe－Flag－mock停留在G0/G1期比例為50.58%±1.94%，S期為42.13%±1.34%;2組比較顯著差異(P＜0.01)。這提示因?yàn)镠epG2細(xì)胞HCV－core－1b蛋白的表達(dá)，使HCV－core－1b (+)的細(xì)胞大部分停滯在G0/G1期，細(xì)胞從G1期向S期的轉(zhuǎn)變受到了損害，HCV－core－1b抑制了細(xì)胞的增殖，而對(duì)照組HCV－core－1b(－)的細(xì)胞增殖不受影響，大部分進(jìn)入了S期。

為了進(jìn)一步探討HCV－core－1b過(guò)表達(dá)影響HepG2細(xì)胞周期的機(jī)制，我們選擇了調(diào)控細(xì)胞周期具有重要意義的細(xì)胞調(diào)控分子cyclin D1和pRb/p130作為研究對(duì)象，觀察HCV－core－1b對(duì)cyclin D1和pRb/p130表達(dá)的影響。Cyclin D1屬于G1周期素，是控制G1/S細(xì)胞周期關(guān)卡的一個(gè)重要分子，G1期的推進(jìn)需要cyclin D1的表達(dá)，它與cyclin D家族其他成員共同啟動(dòng)程序細(xì)胞向一個(gè)階段發(fā)育。在控制G1/S期轉(zhuǎn)換過(guò)程中，cyclin D1/CDK4和cyclin D4/CDK2兩條限制性途徑起到關(guān)鍵作用，但一般認(rèn)為cyclin D1/CDK4途徑更重要。因此，我們選擇cyclin D1作為觀察HCV－core生長(zhǎng)周期的指標(biāo)，采用Western blotting技術(shù)檢測(cè) HepG2、HepG2－pBabe－Flagmock以及HepG2－pBabe－Flag－HCV－core－1b 3組細(xì)胞cyclin D1表達(dá)的差異，結(jié)果發(fā)現(xiàn)HCV－core－1b蛋白過(guò)表達(dá)的HepG2細(xì)胞，其cyclin D1表達(dá)顯著下降(圖5)。這一結(jié)果與HepG2細(xì)胞生長(zhǎng)阻滯在G0/G1期狀態(tài)是一致的。

Rb對(duì)細(xì)胞周期的調(diào)節(jié)也起到很重要作用。Rb是腫瘤抑制基因，pRb和pRb的相關(guān)蛋白(p130、p107)是CDK的主要作用底物。當(dāng)生長(zhǎng)信號(hào)通過(guò)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑和早期應(yīng)答蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞周期調(diào)控機(jī)制時(shí)，首先是cyclin D的表達(dá)增加，激活CDK4，活化的CDK4從ATP分子得到大量的磷酸基團(tuán)，并將它們轉(zhuǎn)移到細(xì)胞周期主要制動(dòng)分子Rb上，cyclin D/CDK使pRb磷酸化，磷酸化的pRb釋放E2F(轉(zhuǎn)錄因子)，Rb進(jìn)入高磷酸化狀態(tài)，從而失去了對(duì)細(xì)胞周期的制動(dòng)功能，促使細(xì)胞進(jìn)入S期。當(dāng)Rb處于低磷酸化狀態(tài)時(shí)，其扣留著大量的轉(zhuǎn)錄因子(如E2F)，使它們不能發(fā)揮作用，從而阻斷了細(xì)胞周期的運(yùn)行。

p130是pRb的相關(guān)蛋白，為了能更好的了解HCV－core對(duì)HepG2細(xì)胞生長(zhǎng)周期的影響，我們進(jìn)而觀察HCV core對(duì)pRb/p130蛋白表達(dá)的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)HCV－core－1b蛋白過(guò)表達(dá)的HepG2細(xì)胞，pRb/p130表達(dá)顯著下降。這一結(jié)果與HepG2細(xì)胞生長(zhǎng)阻滯在G0/G1期狀態(tài)也是一致的(圖6)。

細(xì)胞周期的調(diào)控是細(xì)胞維持正常生長(zhǎng)發(fā)育的必要條件，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)周期的蛋白非常復(fù)雜。有許多蛋白分子參與其過(guò)程，其中包括p53、p21、pRb、E2F、c－Myc和cyclin D。有研究提示HCV－core影響細(xì)胞生長(zhǎng)周期，但由于實(shí)驗(yàn)條件不同，特別是實(shí)驗(yàn)中所采用的細(xì)胞系不同，所得結(jié)論不盡一致。Ruggieri等［11］發(fā)現(xiàn)在非同步HCV－core穩(wěn)定表達(dá)的HepG2細(xì)胞株中，HCV－core誘導(dǎo)c－Myc蛋白水平穩(wěn)定增加，進(jìn)而干擾細(xì)胞周期;Honda等［12］發(fā)現(xiàn)HCV－core可促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)周期的進(jìn)展;Ohkawa等［13］發(fā)現(xiàn)HCV－core的表達(dá)，抑制CL－2細(xì)胞G1進(jìn)入S期;Yan等［14］觀察Chang氏肝細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，HCV－core抑制細(xì)胞生長(zhǎng)周期，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。上述研究提示我們HCV－core的表達(dá)，可能具有雙重作用:既可促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)周期又可抑制細(xì)胞生長(zhǎng)周期。然而HCV－core是如何促進(jìn)或抑制細(xì)胞生長(zhǎng)周期的機(jī)制尚不清楚。Yao等［15］研究證實(shí)HCV－core通過(guò)p21－CDK雙相調(diào)節(jié)途徑抑制和調(diào)節(jié)肝細(xì)胞生長(zhǎng)周期。Classon等［16］報(bào)道HCV－core能使T淋巴細(xì)胞的CDK2/4和cyclin E/D表達(dá)下降，穩(wěn)定p27信號(hào)通路，阻滯T淋巴細(xì)胞從G0期進(jìn)入S期，抑制細(xì)胞增殖。Gao等［17］已報(bào)道p130的下調(diào)可延長(zhǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)周期的G1期而縮短S期;Cho等［18］認(rèn)為HPV、HBV、HCV、EBV、HHV－8/KSHV和HTLV－1能抑制p53和pRb的功能，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞融合。在鼠細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定表達(dá)的HCV－core可明顯下調(diào)pRb水平和上調(diào)E2F－1，促進(jìn)細(xì)胞增殖和凋亡［7］。

我們的實(shí)驗(yàn)顯示HCV－core(+)HepG2細(xì)胞對(duì)cyclin D1和p130的影響是一致的，HCV－core既抑制cyclin D1又抑制p130的表達(dá)，這與我們流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)的HCV－core(+)HepG2細(xì)胞停滯在G0/G1期也相吻合，由于HCV－core－1b(+)的細(xì)胞cyclin D1低表達(dá)，使磷酸化p130也下降，去磷酸化的p130結(jié)合E2F(轉(zhuǎn)錄因子)，使其處于失活狀態(tài)，從而阻止細(xì)胞周期推進(jìn)，最終的結(jié)果就是HCV－core－1b(+)的細(xì)胞大部分停滯在G0/G1期，而對(duì)照組HCV－core－1b(－)的細(xì)胞大部分進(jìn)入了S期。

眾所周知，慢性肝炎——肝硬化——肝細(xì)胞肝癌是肝病進(jìn)展的三部曲，HCV引起慢性肝炎、肝硬化和肝細(xì)胞肝癌與HCV慢性持續(xù)感染密切相關(guān)。從以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果，我們可以推測(cè)HCV－core損傷細(xì)胞生長(zhǎng)周期，致使細(xì)胞不能從 G1期進(jìn)入到 S期，使HCV潛伏在G0/G1期細(xì)胞內(nèi)，G0期的細(xì)胞可以長(zhǎng)期不增殖，但細(xì)胞處于持續(xù)病毒感染狀態(tài)，病毒在休眠的宿主細(xì)胞內(nèi)反復(fù)復(fù)制，使被感染的宿主細(xì)胞不斷受損傷或使基因突變，一旦在生長(zhǎng)因子或細(xì)胞外增殖信號(hào)呼喚下，部分?jǐn)y帶HCV－core的異常細(xì)胞又能重返S期增殖，潛伏在G0/G1的HCV－core(+)異常細(xì)胞不斷向S期增殖，最終引起慢性肝炎、肝硬化和肝細(xì)胞肝癌等病變。

綜上所述，HCV－core對(duì)細(xì)胞周期具有明顯的影響，可能通過(guò)下調(diào)cyclin D1和p130阻滯細(xì)胞增殖使細(xì)胞停留在G0/G1期，從分子水平上解釋了HCV長(zhǎng)期慢性持續(xù)感染的可能機(jī)制，為進(jìn)一步研究HCV相關(guān)的慢性肝炎、肝硬化和肝細(xì)胞肝癌提供了很好的模型。

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