李 彬,榮小軍,廖梅杰,張 正,王印庚,王 嵐,劉智超,3,薛太山

(1.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院 黃海水產(chǎn)研究所,青島市海水魚類種子工程與生物技術(shù)重點實驗室,山東青島266071;2 .青島瑞滋海珍品發(fā)展有限公司,山東青島266409;3.中國海洋大學(xué),山東青島 266100)

近年來,刺參養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展迅速,成為中國北方主要的養(yǎng)殖品種之一,隨著刺參養(yǎng)殖規(guī)模的不斷增加,各種病害接踵而至,嚴(yán)重制約了該產(chǎn)業(yè)的健康和持續(xù)發(fā)展[1],其中“腐皮綜合征”最為嚴(yán)重,死亡率可達90%以上[2],該病的發(fā)生具有季節(jié)性,一般在冬、春低溫季節(jié)爆發(fā)[3],低溫季節(jié)刺參處于冬眠時期,很難用藥物投喂的方式進行疾病的預(yù)防和治療,從生態(tài)學(xué)角度入手,掌握該病發(fā)病原因是進行預(yù)防的關(guān)鍵。

刺參屬底棲食性生物,主要以棲息環(huán)境中微生物、原生動物、微藻、大型藻類碎片、有機碎片、海泥等為食[4],攝入的食物復(fù)雜,其中也包括一些病原微生物。養(yǎng)殖環(huán)境中菌群變化直接影響著刺參腸道內(nèi)細(xì)菌群落組成,與疾病的發(fā)生密切相關(guān)。因此,研究刺參腸道與養(yǎng)殖池塘環(huán)境中細(xì)菌數(shù)量的周年變化,掌握細(xì)菌數(shù)量的變化規(guī)律對疾病的預(yù)防尤為重要。迄今尚未見刺參腸道與養(yǎng)殖池塘環(huán)境中細(xì)菌數(shù)量周年變化的報道。本文通過對刺參腸道和養(yǎng)殖環(huán)境異養(yǎng)細(xì)菌和弧菌數(shù)量的周年變化及刺參疾病多發(fā)季節(jié)優(yōu)勢菌的鑒定,為刺參腸道與養(yǎng)殖環(huán)境細(xì)菌的相關(guān)性分析和病害防控提供有益參考。

1 材料和方法

1.1 采樣時間及地點

2008年9月～2009年9月,每個月定期對青島膠南市室外刺參腸道與養(yǎng)殖池塘環(huán)境中細(xì)菌數(shù)量進行調(diào)查,采樣坐標(biāo)北緯 35°39′,東經(jīng) 119°50′,采樣選 3個池塘,池塘長400 m、寬100 m、水深1.8 m,每個池塘設(shè)立3個采樣點。

1.2 樣品采集

利用調(diào)查船駛到池塘中預(yù)先標(biāo)記好的采樣點,按照《國家海洋調(diào)查規(guī)范》海洋生物調(diào)查中規(guī)定的方法進行采樣,使用擊開式采水器(2.5 L)采集水體表層(距水面約5cm)、水體底層(距底表5cm)水樣;用采泥器采集池塘表層底泥,每個池塘取 9片瓦狀附著基(每個采樣點3片),用無菌勺刮取刺參附著基上的沉積物,放入無菌袋中,每個池塘采集9頭刺參(每個采樣點 3頭),無菌操作下取完整腸道用鑷子輕輕擠出內(nèi)容物,樣品采集后4℃保存,在12 h內(nèi)處理。

1.3 細(xì)菌計數(shù)方法

1.3.1 可培養(yǎng)異養(yǎng)細(xì)菌總數(shù)(HPC)

對樣品進行梯度稀釋,取 0.1 mL直接涂布于TSB海水培養(yǎng)基上,28℃培養(yǎng)2 d計數(shù),選取平均菌落數(shù)在 30～300之間的平板計數(shù),計數(shù)菌落形成單位數(shù)(Colony Forming Units ,CFU)。

TSB培養(yǎng)基：胰蛋白胨大豆肉湯(TSB) 30 g,NaCl 15 g,瓊脂 15 g,海水 1 000 mL,pH 7.4～7.6,121℃,20 min滅菌。

1.3.2 弧菌總數(shù)(VBC)

對樣品進行梯度稀釋,取 0.1 mL直接涂布于TCBS弧菌培養(yǎng)基上,28℃培養(yǎng)2 d計數(shù),計數(shù)方法與異養(yǎng)細(xì)菌總數(shù)計數(shù)方法相同。

1.4 細(xì)菌鑒定

1.4.1 細(xì)菌基因組DNA提取方法

將細(xì)菌接種在 TSB平板培養(yǎng)基上,28℃培養(yǎng)過夜。取單菌落懸浮于50 μL 無菌生理鹽水(1.5%)中,100 °C水浴5 min,12 000 r/min離心5 min,取上清備用。

1.4.2 16S rDNA序列的克隆與測序

用細(xì)菌通用引物 27F(5’-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3’)和 1492R(5’-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3’)對純培養(yǎng)細(xì)菌16S rDNA序列進行PCR擴增,并對擴增產(chǎn)物進行克隆測序。

1.4.3 序列的分析和系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

16S rDNA序列在NCBI中用BLAST進行同源性比較,從中選取與其相似性最高的細(xì)菌16S rDNA序列,采用Clustalw軟件進行多序列匹配排序,用系統(tǒng)發(fā)生推斷軟件包PHYLP 3.67進行聚類分析。采用鄰位相連法獲得系統(tǒng)發(fā)育樹,通過自舉進行系統(tǒng)進化樹的評估,自舉的數(shù)據(jù)集為1 000次。

2 結(jié)果

2.1 刺參腸道與養(yǎng)殖池塘環(huán)境中細(xì)菌數(shù)量周年變化

刺參腸道與養(yǎng)殖池塘環(huán)境中異養(yǎng)細(xì)菌數(shù)量同期差異較大如圖1,水體表層異養(yǎng)細(xì)菌為 90～4.1×104CFU/mL,水體底層異養(yǎng)細(xì)菌為 1.04×102～1.37×105CFU/mL,底泥異養(yǎng)細(xì)菌為 9.80×104～6.72×106CFU/g,附著基異養(yǎng)細(xì)菌為 2.78×105～2.57×107CFU/g,腸道中異養(yǎng)細(xì)菌為 1.85×105～2.17×109CFU/g,同期水體中水底異養(yǎng)細(xì)菌數(shù)量高于水表,但差異不大。水體與底泥、附著基、腸道中異養(yǎng)細(xì)菌數(shù)量差異顯著,最高可達3個數(shù)量級,其中,腸道內(nèi)異養(yǎng)細(xì)菌數(shù)量最高,其次是附著基、底泥。從時間分布上,刺參腸道與養(yǎng)殖環(huán)境中異養(yǎng)細(xì)菌數(shù)量的變化趨勢基本相同,秋季、夏季異養(yǎng)細(xì)菌數(shù)量較高,冬、春季較低。在 10月份、7月份分別達到高峰,水體中6月份、7月份細(xì)菌數(shù)量有下降趨勢。隨著季節(jié)的變化,底泥中異養(yǎng)細(xì)菌數(shù)量變化幅度較小,水體、附著基、刺參腸道中異養(yǎng)細(xì)菌的數(shù)量變化幅度較大。

圖1 刺參腸道與養(yǎng)殖池塘環(huán)境中異養(yǎng)細(xì)菌數(shù)量周年變化Fig.1 Annual changes of heterotrophic bacteria in the intestine and cultured environment of A.japonicus

2.2 刺參腸道與養(yǎng)殖池塘環(huán)境中弧菌數(shù)量周年變化

刺參腸道與養(yǎng)殖池塘環(huán)境中弧菌數(shù)量同期差異較大如圖2,養(yǎng)殖水體表層弧菌數(shù)量為 11～2.4×103CFU/mL,水體底層弧菌數(shù)量為19～5.3×103CFU/mL,底泥中弧菌數(shù)量為 1.01×104～5.75×105CFU/g,附著基弧菌數(shù)量為 4.6×104～1.31×107CFU/g,刺參腸道中弧菌數(shù)量為 4.1×104～2.2×108CFU/g。刺參腸道與養(yǎng)殖池塘環(huán)境中弧菌數(shù)量同期比較與異養(yǎng)細(xì)菌一致：腸道＞附著基＞底泥＞水底＞水表。從時間分布上看,弧菌數(shù)量的周年變化趨勢和異養(yǎng)細(xì)菌的變化趨勢相似。在1～4月份,水體和刺參腸道中弧菌數(shù)量開始急劇上升,刺參腸道和附著基弧菌數(shù)量在 7月份達到最高值,水體和底泥中弧菌數(shù)量在10月份達到最高值。底泥中弧菌數(shù)量季節(jié)變化幅度較小,水體、附著基、刺參腸道中弧菌數(shù)量變化幅度較大。

圖2 刺參腸道與養(yǎng)殖池塘環(huán)境中弧菌數(shù)量周年變化Fig.2 Annual changes of vibrio bacteria in the intestine of A.japonicus and cultured environment

2.3 刺參腸道與養(yǎng)殖環(huán)境中弧菌占異養(yǎng)了細(xì)菌比例的周年變化

由刺參腸道與養(yǎng)殖環(huán)境(水體、底泥、附著基)中弧菌與異養(yǎng)細(xì)菌數(shù)量的比值可以看出,底泥、附著基、腸道中弧菌與異養(yǎng)細(xì)菌數(shù)量的比例平均水平高于水體。冬季和春季細(xì)菌總數(shù)較低,而弧菌與異養(yǎng)細(xì)菌的比值一直處于較高的水平,其中底泥1月份和4月份最高可達43.8%、43.2%,9月份、10月份雖然細(xì)菌總數(shù)較高,而弧菌與異養(yǎng)細(xì)菌的比值處于較低的水平,如圖3。

圖3 養(yǎng)殖腸道與環(huán)境中弧菌與異養(yǎng)細(xì)菌數(shù)量的比值Fig.3 The ratio of vibrio to heterotrophic bacteria in the cultured environment and intestinal tract

2.4 冬、春季節(jié)優(yōu)勢細(xì)菌 16S rDNA分子鑒定

利用平板培養(yǎng)的方法從弧菌比值較高的冬、春季節(jié)分離了 8株優(yōu)勢菌,并進行16S rDNA測序,8株菌所測得的序列結(jié)果通過互聯(lián)網(wǎng) NCBI,在Genbank采用BLAST程序與其他細(xì)菌的16S rDNA序列進行比對,找出相似性高的序列構(gòu)建系統(tǒng)進化樹(圖4),優(yōu)勢菌鑒定為：施氏假單胞菌(Pseudomonas stutzeri)、門多薩假單胞菌(P.mendocina)、蠟狀芽孢桿菌(Bacillus cereus)、燦爛弧菌(Vibrio splendidus)、Shewanella affinis、殺鮭弧菌(V.salmonicida)、S.kaireitica,同源性在 99%以上。所測得的8株優(yōu)勢菌其中有7株菌屬于變形菌門的γ-變形菌綱,1株為芽孢桿菌。冬、春兩季優(yōu)勢菌均發(fā)現(xiàn)有燦爛弧菌。

圖4 優(yōu)勢菌16S rDNA基因序列聚類分析結(jié)果Fig.4 Results of 16S rDNA cluster analysis

3 討論

3.1 刺參腸道與養(yǎng)殖環(huán)境(水體、底泥、附著基)中細(xì)菌數(shù)量周年變化

刺參養(yǎng)殖塘營養(yǎng)結(jié)構(gòu)簡單、食物鏈短,養(yǎng)殖過程中投餌、養(yǎng)殖動物排泄物和有機生物殘體等物質(zhì)的分解容易造成水體污染[5],為了保持刺參養(yǎng)殖塘中良好的水質(zhì)條件,養(yǎng)殖期間定時的大量換水,水體透明度比較高,水體表層有機物質(zhì)含量較少,細(xì)菌總數(shù)也相對較少,底層水體中細(xì)菌總量還受底泥表層細(xì)菌的影響,水體底層細(xì)菌數(shù)量顯著高于表層,與張振飛等[6]鋸緣青蟹養(yǎng)殖環(huán)境中細(xì)菌數(shù)量和類群變化的結(jié)果一致,底層與表層水溫的差異也是底層細(xì)菌數(shù)量高于表層的原因之一。

附著基是細(xì)菌繁殖的有利場所,在附著基上有大量的底棲生物附著,生物量非常豐富,因此,本研究結(jié)果表明,附著基細(xì)菌量比較豐富,細(xì)菌數(shù)量在105～108CFU/g,李筠等[7]對海灣扇貝附著基異養(yǎng)細(xì)菌的數(shù)量進行了研究,其海灣扇貝附著基異養(yǎng)細(xì)菌數(shù)量與本研究有一定的差異,可能是海灣扇貝幼蟲在附著基上的代謝產(chǎn)物或者分泌的特殊物質(zhì)有利于細(xì)菌的大量生長和繁殖。刺參養(yǎng)殖池塘底泥中含有大量的刺參排泄物、殘餌以及一些大型藻類的殘體,這種環(huán)境非常適宜細(xì)菌的生長繁殖,因此在底泥中滋生大量細(xì)菌。刺參攝食無選擇性[8],在池塘底層攝入大量的底泥、有機物質(zhì)以及大量的細(xì)菌,加之刺參的腸道中有穩(wěn)定的細(xì)菌菌群輔助消化[9],腸道中細(xì)菌數(shù)量較多。

影響刺參腸道與養(yǎng)殖環(huán)境中菌群變化的因素有水溫、無機營養(yǎng)鹽、水體中浮游生物及其刺參的攝食活動情況。細(xì)菌數(shù)量的變化趨勢和水溫的變化一致,溫度對大多數(shù)異養(yǎng)細(xì)菌的新陳代謝能力產(chǎn)生一定影響,是造成細(xì)菌季節(jié)變化的主要因素[10],水溫還能影響刺參攝食和生理活動,間接影響刺參腸道與養(yǎng)殖環(huán)境中菌群的變化。秋季9月份水溫20℃左右,刺參結(jié)束夏蟄開始活動攝食,10月份水溫18 ℃左右,刺參攝食、活動活躍,池塘沉積物中有大量的刺參排泄物,為細(xì)菌的增長提供了營養(yǎng)物質(zhì),此時期還是投餌的主要時段,未被攝食的殘餌也促進了細(xì)菌的增殖,細(xì)菌數(shù)量較多。11月份水溫較低,刺參開始冬眠,細(xì)菌代謝活動、繁殖能力較弱,細(xì)菌數(shù)量開始下降,冬季 12月份水溫在 6℃左右,刺參處于冬眠時期,低溫條件抑制了細(xì)菌的生長和有機物質(zhì)的分解,細(xì)菌的含量顯著低于11月,1月份水溫2 ℃,細(xì)菌數(shù)量達到最低。3月份或4月份隨著溫度的回升,細(xì)菌數(shù)量增加較顯著,6月份、7月份水體表層中細(xì)菌數(shù)量有所下降,可能是受水溫或者水體有機物的影響。

3.2 刺參疾病多發(fā)季節(jié)(冬、春季)優(yōu)勢菌分析

冬、春季弧菌數(shù)量與異養(yǎng)細(xì)菌數(shù)量比例較高,特別是在3、4月份比例顯著增高,說明刺參池塘部分弧菌具有耐受低溫能力,通過優(yōu)勢菌的鑒定,冬、春季節(jié)均發(fā)現(xiàn)有燦爛弧菌,燦爛弧菌是引起養(yǎng)殖刺參“腐皮綜合征”的主要病原菌,該株細(xì)菌能夠在溫度較低的環(huán)境中生長,與王印庚等[3]養(yǎng)殖刺參腐皮綜合征病原菌的分離與鑒定的研究結(jié)果一致。冬、春季節(jié)養(yǎng)殖環(huán)境與腸道中優(yōu)勢菌還存在假單胞菌、芽孢桿菌,其分析結(jié)果與近年來國內(nèi)外有關(guān)海洋微生物多樣性的報道一致[11-12]。正常情況下,刺參腸道中的燦爛弧菌與芽孢桿菌等處于一種平衡狀態(tài),在低溫狀態(tài)下,刺參抵抗力較弱,環(huán)境變化容易使細(xì)菌菌群平衡遭到破壞,部分低溫致病菌繁殖迅速,從而引發(fā)疾病[13]。

生態(tài)養(yǎng)殖是漁業(yè)可持續(xù)發(fā)展的重要保證[14],利用益生菌來改善養(yǎng)殖環(huán)境、調(diào)節(jié)養(yǎng)殖動物腸道中菌群組成[15-16],從生態(tài)學(xué)角度入手,預(yù)防疾病的發(fā)生,為水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)朝著綠色健康養(yǎng)殖的方向發(fā)展提供新的途徑[17]。冬、春低溫季節(jié)是刺參疾病的多發(fā)季節(jié),多數(shù)水產(chǎn)微生態(tài)是從陸生動物養(yǎng)殖環(huán)境和腸道中分離獲得[18],不耐受低溫,不適于刺參養(yǎng)殖環(huán)境,因此,從刺參疾病多發(fā)的低溫季節(jié)篩選土著益生菌,更有利于疾病的防控。本研究在冬、春季節(jié)發(fā)現(xiàn)有蠟狀芽孢桿菌,有報道蠟狀芽孢桿菌可以維持動物腸道中微生態(tài)平衡和恢復(fù)腸道正常菌群的作用[19-20],該菌能夠耐受低溫,并且是刺參腸道和養(yǎng)殖環(huán)境中的土著菌,能夠更好地適應(yīng)低溫刺參養(yǎng)殖環(huán)境,可以作為潛在的益生菌應(yīng)用于低溫疾病多發(fā)季節(jié)的疾病預(yù)防。

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