胡 靜,齊興柱,尹紹武,,駱 劍,朱曉平,祝 斐,胡亞麗

(1.海南大學(xué) 海洋學(xué)院,海南大學(xué)熱帶生物資源教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,海南 ?？?570228;2.南京師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,江蘇 南京 210046)

波紋唇魚(yú)(Cheilinus undulatus),俗稱蘇眉,曲紋唇魚(yú),隸屬鱸形目(Perciformes)、隆頭魚(yú)科(Labridae)、唇魚(yú)屬(Cheilinus),分布于大洋洲、太平洋西部熱帶海域、大堡礁、印度洋西北部及紅海[1]。在中國(guó)分布于南海與東海的南部海域[2],海南的萬(wàn)寧、陵水、三亞等海域以及臺(tái)灣、香港。波紋唇魚(yú)肉質(zhì)細(xì)嫩而爽滑,味甚鮮美,營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高,深受亞洲人喜愛(ài),需求的劇增和巨額的利潤(rùn)吸引人們大量捕殺波紋唇魚(yú),加之環(huán)境污染、珊瑚礁棲息地的破壞等因素,自然海區(qū)的波紋唇魚(yú)數(shù)量越來(lái)越少,目前已經(jīng)瀕臨絕種。因此,有關(guān)波紋唇魚(yú)的的遺傳資源調(diào)查、資源保護(hù)、人工繁殖等工作亟待加強(qiáng)。

對(duì)于波紋唇魚(yú),國(guó)內(nèi)的研究及公開(kāi)報(bào)道很少,僅在食用中毒及中毒后急救護(hù)理和形態(tài)學(xué)兩方面有少許報(bào)道[3]。目前已有一些繁殖和生理特性方面的研究[4-5],國(guó)外對(duì)波紋唇魚(yú)的生物學(xué)等方面報(bào)道較多[6-7],但仍未見(jiàn)關(guān)于波紋唇魚(yú)線粒體控制區(qū)的研究報(bào)道。近年來(lái),隨著mtDNA的研究不斷深入,同時(shí)因?yàn)槠渚哂蟹肿有　⒔Y(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、演化速度快、母系遺傳等優(yōu)點(diǎn)而作為有效的分子標(biāo)記廣泛應(yīng)用于物種系統(tǒng)進(jìn)化研究[8],而mtDNA的控制區(qū)或D-loop區(qū)是最有意義的區(qū)域,也是線粒體基因組進(jìn)化最快的部分[9]。本研究對(duì)海南近海海域波紋唇魚(yú)種群 mtDNA D-loop區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增、克隆及測(cè)序,旨在研究波紋唇魚(yú)控制區(qū)的序列變異情況,分析其序列多態(tài)性,以獲得相關(guān)數(shù)據(jù),為該種群遺傳多樣性和保護(hù)生物學(xué)的研究提供科學(xué)資料。

1 材料與方法

1.1 材料

25尾波紋唇魚(yú)樣品于2009年采自海南三亞海域,平均質(zhì)量約350 g,長(zhǎng)約30cm,均為1齡魚(yú)。取其肌肉于超低溫冰箱中儲(chǔ)存(-80℃)備用。

1.2 方法

1.2.1 總DNA提取

分別取25尾個(gè)體(編號(hào)為1～25)0.1 g肌肉組織以提取總DNA?？侱NA的提取按常規(guī)的“酚-氯仿”方法進(jìn)行[10],DNA經(jīng)異丙醇沉淀、70%(體積分?jǐn)?shù))乙醇洗滌并干燥后,用50μLTE溶解,-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 PCR擴(kuò)增

采用PCR擴(kuò)增mtDNA D-loop區(qū)靠近Cyt b基因的蘇氨酸 tRNA基因和脯氨酸 tRNA基因及其后的D-loop序列。采用PCR類別為巢式PCR,通過(guò)引物設(shè)計(jì)所得巢式PCR正鏈引物和反鏈引物見(jiàn)表1。

表1 引物序列Tab.1 The sequences of primer

巢式PCR分步進(jìn)行兩次,每個(gè) PCR的總體積為25 μL,其中模板 1 μL,PCRmix12.5 μL(天根生化科技有限公司);去離子雙蒸水 8.9 μL;正、反鏈引物各1.3 μL,兩步引物分別為 cheilD-loopsen1、cheilD-loopant1和 cheilD-loopsen2、cheilD-loopant2。第一步PCR程序：94℃預(yù)變性4 min,然后進(jìn)行30個(gè)熱循環(huán)(94℃、30 s,54℃、30 s,72℃、2 min),72℃延伸 10 min;10℃保溫。第二步PCR的模板為第一次反應(yīng)產(chǎn)物,其退火溫度為51℃,其他程序與以上相同。

1.2.3 PCR產(chǎn)物克隆

擴(kuò)增產(chǎn)物用DNA純化試劑盒純化。將目的片段與pMDTM18-T Vector*1(寶生物工程有限公司)連接。連接產(chǎn)物與 DH5ɑ感受態(tài)細(xì)胞[11]充分混勻轉(zhuǎn)化。挑取目的單克隆菌落于含有氨芐的液體培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng),后菌液PCR。測(cè)序工作由天根生化科技(北京)有限公司操作。

1.2.4 數(shù)據(jù)分析

測(cè)序結(jié)果在 BLAST上進(jìn)行比對(duì)分析;在ClustalX軟件上對(duì)比以剪切所有序列為相近長(zhǎng)度;整理后的序列在MEGA軟件上計(jì)算個(gè)體間的遺傳距離,并構(gòu)建UPGMA和NJ系統(tǒng)樹(shù);DNASP軟件上計(jì)算遺傳多樣性參數(shù),及堿基含量、突變位點(diǎn)等。

2 結(jié)果

2.1 目的片段的序列特征及群體內(nèi)的序列變異

本實(shí)驗(yàn)共測(cè)定了波紋唇魚(yú) 25尾個(gè)體的 mtDNA D-loop序列片段,在對(duì)比除去部分端部序列后,堿基序列長(zhǎng)度共出現(xiàn) 4種情況：1141bp、1142bp、1143bp、1144bp,即 25個(gè)序列中存在堿基缺失或插入的情況。利用 BLAST軟件將 25個(gè)序列與 NCBI上波紋唇魚(yú)線粒體全序列(序列號(hào)：GU296101)的D-loop序列區(qū)域進(jìn)行對(duì)比,結(jié)果表明兩者同源性很高,均為97%～99%。A、T、C、G 4個(gè)堿基在25尾個(gè)體中的平均含量分別為 27.6%、24.9%、28.4%、19.1%(表2),且 AT 含量(52.5%)高于 CG 含量(47.5%)。

表2 25尾波紋唇魚(yú)線粒體D-loop序列堿基含量(%)Tab.2 Nucleotide compositions of mtDNA D-loop sequences in 25 C.undulatus(%)

波紋唇魚(yú)D-loop序列變異位點(diǎn)如表3所示。25尾個(gè)體中共檢出66個(gè)變異位點(diǎn),其中包括0個(gè)堿基缺失,4個(gè)堿基插入,59個(gè)轉(zhuǎn)換位點(diǎn),2個(gè)顛換位點(diǎn)及1個(gè)轉(zhuǎn)換和顛換同時(shí)存在的位點(diǎn)。結(jié)果可以看出,在所有核苷酸序列中變異位點(diǎn)主要分布在 200bp～1 000bp。

2.2 群體內(nèi)遺傳多樣性

2.2.1 遺傳多樣性參數(shù)

由DNASP軟件計(jì)算出這25尾個(gè)體的遺傳多樣

性參數(shù)[12],單倍型數(shù)目h為25,單倍型多樣性Hd為1,多態(tài)位點(diǎn)數(shù)(S)為62,核苷酸多樣性(Pi)為0.00606,平均核苷酸差異數(shù)(K)為6.907。

表3 變異位點(diǎn)在25尾波紋唇魚(yú)D-loop序列中的分布Tab.3 Distribution of D-loop variable sites in 25 C.undulatus

2.2.2 個(gè)體間的遺傳關(guān)系

應(yīng)用MEGA5.0軟件,根據(jù)D-loop序列計(jì)算出了25尾個(gè)體間的 Kumar遺傳距離(表4)。從表4可以看出,25尾個(gè)體任何兩個(gè)個(gè)體間的遺傳距離不為零,即任何 2個(gè)個(gè)體的核苷酸序列不完全相同,故共有25個(gè)單倍型;個(gè)體10和個(gè)體11之間的遺傳距離最大(0.015),個(gè)體13及個(gè)體個(gè)體22分別與個(gè)體17之間的遺傳距離最小(0.001)。由此可以看出個(gè)體間的差異很小。

以25尾個(gè)體的D-loop序列構(gòu)建的NJ系統(tǒng)樹(shù)分別如圖1所示。從圖中可見(jiàn),25尾個(gè)體形成了2大分支。線粒體DNA屬于母系遺傳,可推斷該群體的25個(gè)個(gè)體可能來(lái)源于2個(gè)不同母系祖先[13]。

3 討論

3.1 目的片段序列特征及變異分析

A、T、C、G 4個(gè)堿基在25尾個(gè)體中的平均含量為27.6%、24.9%、28.4%、19.1%(表2),且AT含量(52.5%)高于CG含量(47.5%)。結(jié)果表明波紋唇魚(yú)mtDNA D-loop基因的 AT含量與稀有白甲魚(yú)(Onychostoma rara)D-loop基因的AT含量(66.1%)非常接近[14],這也符合脊椎動(dòng)物mtDNA D-loop區(qū)域堿基組成的特點(diǎn)[15]。

3.2 遺傳多樣性以及個(gè)體間的遺傳關(guān)系分析

由DNASP軟件計(jì)算出這25尾個(gè)體的遺傳多樣性參數(shù),單倍型數(shù)目h為25,單倍型多樣性Hd為1,多態(tài)位點(diǎn)數(shù)(S)為 62,核苷酸多樣性(Pi)為 0.00606,平均核苷酸差異數(shù)(K)為 6.907,從表4可以看出 25尾波紋唇魚(yú)個(gè)體間的遺傳距離很小,即個(gè)體間的差異很小。

魚(yú)類線粒體DNA D環(huán)是mtDNA中不編碼多肽鏈的核苷酸片段,無(wú)修復(fù)系統(tǒng),不受選擇壓力的影響,因而積累了較多的變異[16]。mtDNA母系遺傳特性使得相對(duì)較少個(gè)體即可代表該群體的有效樣本,因此,這些參數(shù)已經(jīng)能代表該群體的 D環(huán)序列的變異水平。

波紋唇魚(yú)個(gè)體間的差異很小其原因可能是波紋唇魚(yú)群體由一個(gè)較小的有效群體迅速增長(zhǎng)形成,雖然通過(guò)變異產(chǎn)生了單倍型多態(tài)性,但還未能積累相對(duì)較豐富的核苷酸序列的多樣性[17]。

由實(shí)驗(yàn)結(jié)果得出,波紋唇魚(yú)單倍型多樣性程度較高而個(gè)體差異較低。由于有限的群體會(huì)導(dǎo)致近交頻繁發(fā)生進(jìn)而加劇遺傳多樣性的減少[18],而過(guò)度捕撈也會(huì)降低個(gè)體核苷酸序列一致的幾率,故波紋唇魚(yú)的以上遺傳變異情況可能受其分布地域小和過(guò)度捕撈影響嚴(yán)重。目前波紋唇魚(yú)的野生資源有限,波紋唇魚(yú)分布較窄,有利于個(gè)體間產(chǎn)生基因交流,而基因交流會(huì)進(jìn)一步地減少個(gè)體間的差異,使得遺傳多樣性降低。此外,由于需求增加和利潤(rùn)吸引,波紋唇魚(yú)的漁業(yè)捕撈強(qiáng)度日益加大,群體數(shù)量劇烈減少,小群體產(chǎn)生的基因丟失某種程度上會(huì)降低該群體的遺傳多樣性,故捕撈過(guò)度必然導(dǎo)致遺傳多樣性的降低。

圖1 由D-loop 序列得到的NJ系統(tǒng)樹(shù)(無(wú)其他序列作參照)Fig.1 NJ phylogenetic tree based on D-loop sequences Bootstrap (500 replicateseed=64238)

Pi值是衡量群體多態(tài)程度和群體遺傳分化的重要指標(biāo)之一,Pi值越大表示群體多態(tài)程度越高,反之亦然。本研究所得的波紋唇魚(yú)遺傳多樣性參數(shù)Pi較黑鯛的 D-loop數(shù)值(Pi=0.00903)[19]和稀有白甲魚(yú)的D-loop數(shù)值(Pi=0.0107)[14]低。這種現(xiàn)象可能與種類差異和棲息地及活動(dòng)范圍狹窄有關(guān),因?yàn)椴y唇魚(yú)為珊瑚礁棲息類魚(yú),而珊瑚礁正大面積的污染,甚至面臨瀕臨消失的險(xiǎn)境。此外,作為近幾年的增養(yǎng)殖魚(yú)類,波紋唇魚(yú)的遺傳多樣性在一定程度上也受到了由于人工苗種培育而導(dǎo)致的近郊等方面的影響。

本研究基于線粒體D-loop序列變異對(duì)海南近海海域的波紋唇魚(yú)進(jìn)行了遺傳多樣性研究,有關(guān)結(jié)果尚不能肯定人為因素對(duì)其遺傳多樣性影響的程度,但仍不能忽視對(duì)波紋唇魚(yú)的必要保護(hù)和管理;也不能完全反映所有波紋唇魚(yú)群體遺傳多樣性水平和群體分化程度,但為后續(xù)的波紋唇魚(yú)研究積累了遺傳多樣性參考資料。

[1]區(qū)又君,齊旭東,李加兒.波紋唇魚(yú)不同組織 5種同工酶表達(dá)的差異[J].南方水產(chǎn),2009,5(2)：51-55.

[2]Donadson T J,Sadovy Y.Threatened fishes of the world：Cheilinnus undulatusRǘppell,1835 (Labridae)[J].Environ Biol Fish,2001,62：428.

[3]李桂英,馬曉華.32例蘇眉中毒患者的急救與護(hù)理[J].現(xiàn)代護(hù)理,2005,11：10.

[4]王永波,陳國(guó)華,駱劍,等.波紋唇魚(yú)消化系統(tǒng)的形態(tài)解剖與腸道上皮的掃描電鏡觀察[J].海洋通報(bào),2010(2)：199-205.

[5]陳國(guó)華,王永波,王珺,等.波紋唇魚(yú)消化系統(tǒng)的組織學(xué)[J].水生生物學(xué)報(bào),2010,34(4)：685-693.

[6]Olivier Chateau,Laurent Wantiez.Site fidelity and activity patterns of a humphead wrasse,Cheilinus undulatus(Labridae),as determined by acoustic telemetry[J].Environ Biol Fish,2007,80：503-508.

[7]Sadovy Y,Kulbicki M,Labrosse P.Synopsis of a threatened and poorly known giant coral reef fish[J].Reviews in Fish Biology and Fisheries,2003,13：327-364.

[8]郭新紅,劉少軍,劉巧,等.魚(yú)類線粒體DNA研究新進(jìn)展[J].遺傳學(xué)報(bào),2004,31(9)：983-1000.

[10]薩姆布魯克J,弗里奇 E F,曼尼阿蒂斯T.分子克隆實(shí)驗(yàn)指南(第二版) [M].北京：科學(xué)出版社,1995：464-467.

[11]霍蕊.波紋唇魚(yú)的核型和線粒體全基因組結(jié)構(gòu)分析[D].?？冢汉Ｄ洗髮W(xué),2008：33-34.

[12]劉若余,夏先林,雷初朝,等.貴州黃牛mtDNA D-loop遺傳多樣性研究[J].遺傳,2006,28(3)：279-284.

[13]石拓,孔杰,劉萍,等.中國(guó)對(duì)蝦遺傳多樣性的RAPD分析——朝鮮半島西海岸群體的DNA多態(tài)性[J].海洋與湖沼,1999,30(6)：609-615.

[14]彭珊,代應(yīng)貴.瀕危魚(yú)類稀有白甲魚(yú)清水江種群mtDNA D-loop序列多態(tài)性[J].中國(guó)水產(chǎn)科學(xué),2007,14(3)：352-360.

[15]Meyer A.DNA technology and phylogeny of fish[M].London：Chapman and Hall.1994：219-249.

[16]錢(qián)亞屏,諸嘉佑,初正韜,等.應(yīng)用線粒體 DNA D-LOOP區(qū)遺傳多樣性分析云南4個(gè)少數(shù)民族的遺傳關(guān)系[J].遺傳學(xué)報(bào),2001,28(4)：291-300.

[17]Avise J C.Phylogeography the History and Formation of Species[M].Cambridge,Massachusetts London,England：Harvard University Press.2000：447-448.

[18]李娜,陳少波,謝起浪,等.閩浙地區(qū)香魚(yú)線粒體Cyt b基因和D-loop區(qū)遺傳多態(tài)性分析[J].遺傳學(xué)報(bào),2008,30(7)：919-925.

[19]龔金波,蘇天鳳,夏軍紅,等.中國(guó)近海黑鯛線粒體DNA控制區(qū)序列多態(tài)性分析[J].南方水產(chǎn),2006,2(4)：24-30.