徐 娜,逄少軍,劉 峰

(1.中國科學院 海洋研究所,山東 青島 266071;2.中國科學院 研究生院,北京 100049)

桑溝灣位于山東半島最東端,是一個面向黃海的半封閉型海灣,水域廣闊,是北方重要的海珍品和大型藻類養(yǎng)殖基地。2011年5月開始,桑溝灣養(yǎng)殖區(qū)暴發(fā)較大規(guī)模赤潮,一直持續(xù)到 8月上旬臺風“梅花”來襲才完全消亡。赤潮高密度暴發(fā)區(qū)海水呈黃棕色,透明度明顯下降。赤潮使養(yǎng)殖區(qū)的鮑魚攝食大大減少。據(jù)當?shù)仞B(yǎng)殖戶描述這種大規(guī)模赤潮在桑溝灣歷史上非常少見。桑溝灣養(yǎng)殖區(qū)環(huán)境質(zhì)量優(yōu)良,目前還沒有關于桑溝灣暴發(fā)赤潮的文獻記載。這次罕見的赤潮對桑溝灣環(huán)境及養(yǎng)殖業(yè)都造成了較大影響。作者采集了赤潮暴發(fā)區(qū)的海水,分離得到了一株優(yōu)勢種赤潮藻并對其進行了鑒定。

赤潮藻類個體微小,傳統(tǒng)的鑒定主要通過在顯微鏡下觀察其形態(tài)學特征,這需要鑒定人員有豐富的經(jīng)驗。此外一些有害赤潮藻種和無害物種形態(tài)相似,光學顯微鏡下難以分辨,需要電子顯微鏡下的細節(jié)觀察[1],而電鏡觀察需要設備條件及熟練的樣品處理能力。因此傳統(tǒng)的形態(tài)學鑒定方法受到一定的限制。基于DNA分子序列對物種的鑒定是一種簡單、準確而高效的分析方法,GenBank數(shù)據(jù)庫中也收錄了越來越多可供比對的分子序列,其中大部分信息較為可靠,因此非專業(yè)的藻類分類工作者易于通過分子序列完成對微藻的鑒定。18S rDNA和ITS序列是藻類分子鑒定和分類中最常用的分子指標[2]。本研究分離得到的赤潮藻在光學顯微鏡觀察下初步判斷為裸甲藻類似種,由于藻細胞固定時易變形,且電鏡觀察條件暫難滿足,因此作者以 18S rDNA和ITS分子序列為依據(jù)鑒定這株藻。

1 材料與方法

1.1 水樣的采集和種質(zhì)的分離培養(yǎng)

2011年6月于桑溝灣養(yǎng)殖區(qū)赤潮發(fā)生水域(37.14N,122.55E)采集水樣 1L,裝入潔凈的聚乙烯塑料瓶置于低溫環(huán)境下帶回實驗室。水樣加入滅菌海水配制的f/2培養(yǎng)液[3-4](不添加硅酸鹽),在依據(jù)采集地環(huán)境設定的條件下進行富集培養(yǎng)。對觀察到的優(yōu)勢藻在顯微鏡下進行藻種分離純化。定期觀察,得到純的藻種后擴大培養(yǎng)。培養(yǎng)溫度為 20℃,以白熾燈為光源,光照強度為 5 000 lx,光照周期控制在12L：12D。

1.2 分子鑒定

取50 mL處于對數(shù)生長期的純種藻液,7 000g離心5 min,棄上清收集藻細胞。用試劑盒提取基因組 DNA。18S rDNA序列的擴增采用真核生物 18S通用引物SSU-F/ SSU-R[5]。擴增ITS序列(包括ITS1、5.8S rDNA 和ITS2)的引物為 ITS1/ ITS2[2]。PCR反應體積50 μL,體系包括：模板基因組DNA 2.5 μL,引物(20 μmol/L)各 1.25μL,Taq酶預混合的 PCR反應液 25 μL,ddH2O 20 μL。18S 序列擴增循環(huán)程序為：94℃預變性10 min;之后94℃變性30 s,55℃退火45 s,72℃延伸90 s,循環(huán)32次;最后72℃延伸10 min[5]。ITS序列擴增程序為：95℃預變性5 min;之后94℃1 min,55℃ 1 min,72℃ 2 min,循環(huán) 30次,最后72℃延伸5 min[2]。擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后切膠回收目的片段,連接到 pMD19-T載體,并轉(zhuǎn)化感受態(tài)Escherichia coliDH-5α,用藍白斑法篩選陽性克隆。用菌液 PCR檢測白斑菌落,重組成功的菌落擴增培養(yǎng)后送至上海博尚測序公司測序。

將測得的序列在 NCBI用 BLAST (http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/)進行同源檢測,找出與其最相近的物種。在Genbank下載其他相關物種的18S rDNA序列及ITS序列,與該藻株的序列一起用BioEdit軟件的Clustal W[6]程序進行多序列對位分析。后用MEGA 4[7]的 Kimura 2-parameter 模型計算遺傳距離,采用鄰接法(neighbor-joining/NJ)[8]構建系統(tǒng)進化樹,用自展檢驗(bootstrap)[9]估計系統(tǒng)樹分支節(jié)點的置信度,自舉數(shù)據(jù)集為1000次。

2 結(jié)果與分析

2.1 形態(tài)學特點

分離純化得到的這株藻記錄為 SGW201106-1。生長狀態(tài)良好的藻液呈黃褐色。在顯微鏡下觀察,活躍的游動細胞長 10～15 μm,寬7～12 μm,游動較迅速。細胞橫溝明顯,將細胞分為基本同樣大小的上下兩部分(圖1)。鞭毛兩條,一條從細胞基部伸出,另一條從中間的橫溝處伸出。加入固定液后,細胞容易變形。根據(jù)形態(tài)特點初步判斷這株藻為裸甲藻類似種。

圖1 甲藻SGW201106-1的形態(tài)特征Fig.1 Light microscopic photos of strain SGW201106-1

2.2 基因序列分析

2.2.1 18S rDNA序列

經(jīng) PCR擴增后測序得到的藻株 SGW201106-1的 18S rDNA序列長度為 1 783 bp,將序列提交GenBank,得到序列索引號為JN986577。

將此18S rDNA序列經(jīng)BLASTn搜索,與之比對得分最高的是卡羅藻K.micrum(=K.veneficum,見下文討論部分),并與 GenBank中收錄的 11條K.micrum18S rDNA序列的最大相似性都為99%。用MEGA 4以鄰接法(NJ)構建的18S rDNA系統(tǒng)進化樹見圖2,建樹所用的外類群為甲藻門塔瑪亞歷山大藻(Alexandrium tamarense)。圖2表明,SGW201106-1與11株K.micrum和1株K.veneficum聚為一支,再與同為凱倫藻科(Kareniaceae)的達卡藻屬(Takayama)聚在一起,與同科的凱倫藻屬(Karenia)親緣關系相對稍遠。

經(jīng)Clustal W對位分析比較,SGW201106-1的18S rDNA與索引號為EF492506的K.micrum只在1 783 bp序列的第343個位點有一個堿基替換的差異。

2.2.2 ITS序列

PCR擴增后獲得SGW201106-1的ITS序列長度為687 bp,去除兩端多余rDNA序列后實際長595 bp,其中ITS1為218 bp,中間5.8S rDNA 159 bp,ITS2序列 218 bp,后提交至 GenBank獲得序列索引號JN986578。

ITS序列經(jīng)BLASTn搜索,與之比對得分最高的前17條序列都是K.micrum和K.veneficum,與之相似性都高于97%,最高為100%。依據(jù)ITS序列構建的系統(tǒng)進化樹(圖3)中,SGW201106-1與GenBank中的11株K.micrum和6株K.veneficum完全聚在一起,支持率99%,后與Karlodinium屬另一種K.armiger聚為一支。這一支與同為 Kareniaceae科的Takayama屬聚在一起,最后再與同科的另一屬Karenia聚合。

經(jīng) Clustal W 對位分析比較,SGW201106-1的ITS序列與GenBank索引號為AJ557026的K.micrum只在595 bp的序列中第415、416位點有兩個堿基插入的差異,位于ITS2區(qū)。

圖2 依據(jù)18S rDNA序列通過鄰接法構建的系統(tǒng)樹(重復1000次計算bootstrap值),以Alexandrium tamarense為外類群Fig.2 The neighbor-joining tree of 18S rDNA sequences.Bootstrap values (%) of 1000 replicates are given adjacent to each node.Alexandrium tamarense is used as outgroup

以上結(jié)果表明,SGW201106-1的18S rDNA和ITS序列與GenBank中的K.veneficum/ K.micrum非常接近,而K.micrum與K.veneficum是同種異名,已被修訂為K.veneficum[10]。因此,本文中在桑溝灣赤潮水樣中的分離得到的這株優(yōu)勢種甲藻為卡羅藻Karlodinium veneficum,屬于裸甲藻目(Gymnodiniales),凱倫藻科(Kareniaceae),卡羅藻屬(Karlodinium)。

3 討論

K.veneficum是一種常見的赤潮甲藻,它的分類名稱曾有多種,后經(jīng)研究證實有幾種與它相近的甲藻都是同種異名。Daugbjerg等[11]將Gymnodinium galatheanum,Gymnodinium micrum,Gyrodinium galatheanum都修正為K.micrum,并認為與K.veneficum是同屬不同種。而Bergholtz等[10]則通過形態(tài)學比較和核糖體大亞基基因(LSU rDNA)分析,認為K.micrum與K.veneficum是同一種,將K.micrum修正為K.veneficum。Garcés等[12]的研究也表明K.micrum與K.veneficum的色素組成一致,支持Bergholtz的結(jié)論,認為二者應該為同一種。目前大多研究人員已接受K.micrum與K.veneficum為同一種的說法[13-18]。因此過去所有報道中用到的名稱(包括Gymnodinium galatheanum,Gymnodinium micrum,Gyrodinium galatheanum,Karlodinium micrum,Karlodinium galatheanum,Gymnodinium veneficum)都應當修正為K.veneficum。K.veneficum之前廣被接受的中文譯名是微小卡羅藻,由K.micrum翻譯而來,修正為K.veneficum后,國內(nèi)有一篇中文文章將其譯為劇毒卡爾藻[19]。

K.veneficum屬于裸甲藻目(Gymnodiniales),是一種世界廣布性的赤潮甲藻且能產(chǎn)生卡羅藻毒素[20-21],曾被報道在歐洲、非洲和北美洲等很多地方引起赤潮并導致魚類死亡[22]。在中國,關于K.ve-neficum引發(fā)赤潮的正式報道較少,其曾在中國香港海域發(fā)生過赤潮,但沒有相關魚類死亡的報道[23-24]。另有文章提到2005年6月K.veneficum與其他藻一起在洞頭東海海域引發(fā)赤潮,但其不是主要優(yōu)勢種;2007年6月,K.veneficum在象山灣的一個蝦池中大量暴發(fā)[25]。

圖3 依據(jù)ITS序列通過鄰接法構建的系統(tǒng)樹(重復1000次計算bootstrap值),以Alexandrium tamarense為外類群Fig.3 The neighbor-joining tree of ITS sequences.Bootstrap values (%) of 1000 replicates are given adjacent to each node.Alexandrium tamarense is used as outgroup

桑溝灣是中國北方地區(qū)歷史悠久的水產(chǎn)養(yǎng)殖灣之一,其養(yǎng)殖區(qū)環(huán)境優(yōu)良[26],大型海藻海帶養(yǎng)殖規(guī)模很大,其中也夾雜著部分牡蠣、扇貝以及鮑魚的筏式混養(yǎng)。桑溝灣被認為是海水水產(chǎn)動物和植物養(yǎng)殖搭配合理的典范。因此其水質(zhì)中營養(yǎng)鹽基本保持平衡,多年來鮮有大面積赤潮發(fā)生。2011年5月份的這次赤潮規(guī)模在桑溝灣歷史上比較罕見。另外,先前科研人員對桑溝灣浮游植物優(yōu)勢種調(diào)查結(jié)果中都沒有發(fā)現(xiàn)卡羅藻K.veneficum[27-29]。因此不排除K.veneficum來自桑溝灣以外水域環(huán)境的可能。鮑魚和龍須菜在我國福建養(yǎng)殖區(qū)和桑溝灣的季節(jié)性互移養(yǎng)殖[30-31]都有可能將新的物種從南方水域帶入桑溝灣。K.veneficum在桑溝灣被發(fā)現(xiàn)是否屬于這種情況需要進一步的數(shù)據(jù)支持。桑溝灣有豐富的營養(yǎng)物質(zhì)基礎及適宜的環(huán)境條件,外來種一旦遇到這些適宜的條件,容易暴發(fā)性增長。桑溝灣海區(qū)溶解無機氮和活性磷酸鹽的濃度在夏秋季高于春冬季,夏秋季陸源豐水期河流徑流水攜帶大量的工農(nóng)業(yè)廢水和城市生活污水中所含氮、磷化合物進入該灣[32],而 5、6月份灣內(nèi)養(yǎng)殖的大量海帶、裙帶菜等大型藻類多已采收完畢,對海水中營養(yǎng)鹽的消耗減少,因此此時的高營養(yǎng)水平是赤潮暴發(fā)的物質(zhì)基礎。另外此時恰逢高水溫期,風力小,為赤潮暴發(fā)和蔓延提供了最適宜的條件。赤潮暴發(fā)后,對當?shù)氐酿B(yǎng)殖業(yè)帶來較大影響,本項研究的結(jié)果將為今后桑溝灣海區(qū)環(huán)境監(jiān)測和赤潮預防提供有價值的信息。

致謝：感謝山東榮成市蜊江水產(chǎn)有限責任公司的工作人員在水樣采集中給予的幫助。

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