張守慶,王寶杰姜 珊,蔣克勇劉 梅王 雷

(1.中國(guó)科學(xué)院 海洋研究所,山東 青島 266071;2.中國(guó)科學(xué)院 研究生院 北京 100049)

抗菌肽(Antimicrobial peptides,AMP)是生物體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生的一類小分子生物活性物質(zhì),對(duì)真菌、細(xì)菌、病毒等病原微生物具有非特異性抑制或殺滅作用,廣泛存在于生物體中。隨著對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物抗菌肽的分離、結(jié)構(gòu)與功能的研究[1-4],利用水產(chǎn)動(dòng)物抗病功能基因構(gòu)建相應(yīng)的表達(dá)載體,實(shí)現(xiàn)重組抗菌肽的高效表達(dá),克服了天然抗菌肽來(lái)源有限、化學(xué)合成成本高、批量生產(chǎn)困難等不足。然而,直接口服抗菌肽極易被生物體內(nèi)的酶分解,其生物活性也隨之消失,使其在水產(chǎn)養(yǎng)殖疾病預(yù)防和治療領(lǐng)域受到很大程度的限制[5-6]。

建立蛋白類藥物的有效經(jīng)口導(dǎo)入途徑成為研究熱點(diǎn),通過(guò)可生物降解的微囊系統(tǒng)給藥,不僅可以防止藥物在體內(nèi)很快降解,還可以達(dá)到緩釋/控釋目的[7]。肖東等[8]研制的腸溶微囊式鯉魚(yú)生長(zhǎng)激素(rcGH)促生長(zhǎng)劑投喂胡子鯰,采用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法和酶聯(lián)免疫吸附受體測(cè)定法檢測(cè),結(jié)果發(fā)現(xiàn)腸溶膠囊對(duì)rcGH起到保護(hù)作用;余俊紅等[9]制備的全細(xì)胞疫苗和微膠囊疫苗口服免疫鱸魚(yú)魚(yú)苗,攻毒后,微囊組的死亡率較低;Romalde等[10]對(duì)非膠囊和微囊化的口服疫苗對(duì)虹鱒格氏乳球菌病的免疫保護(hù)作用進(jìn)行了評(píng)價(jià),結(jié)果表明微囊化的疫苗具有較好的保護(hù)作用。

抗菌肽作為飼料添加劑在畜禽和水產(chǎn)養(yǎng)殖中取得了一定的成果,但直接口服抗菌肽其生物利用度低。本研究是將基因工程發(fā)酵生產(chǎn)的海洋生物重組抗菌肽——對(duì)蝦素 3-2,親和層析分離純化后,以乳化凝聚法制備重組抗菌肽海藻酸鈉腸溶性微囊,不僅能夠提高抗菌肽的穩(wěn)定性,有效的防止胃液對(duì)重組抗菌肽的破壞,而且能夠?qū)崿F(xiàn)控制釋放,使重組抗菌肽長(zhǎng)效的發(fā)揮作用,為抗菌肽類制劑通過(guò)口服途徑應(yīng)用于養(yǎng)殖中的疾病防治提供了可能。

1 材料與方法

1.1 材料及主要試劑配制

重組抗菌肽發(fā)酵液,本實(shí)驗(yàn)室制備的畢赤酵母表達(dá)的對(duì)蝦素3-2(GenBank登錄號(hào)為DQ308408)。

分離純化平衡緩沖液：20 mmol/L磷酸鹽緩沖液,500 mmol/L NaCl,20 mmol/L咪唑,使用0.45 μm濾膜真空抽濾,pH7.4。

分離純化洗脫緩沖液：20 mmol/L磷酸鹽緩沖液,500 mmol/L咪唑,使用 0.45 μm 濾膜真空抽濾,pH 7.4。

模擬胃液：取稀鹽酸 16.4 mL,加超純水約 800 mL,再加入胃蛋白酶 10 g,攪拌均勻后調(diào)節(jié) pH至2.0,然后容量瓶定容至1000 mL。

模擬腸液：取磷酸二氫鉀6.8g加超純水500 mL溶解,另外將 10 g胰蛋白酶溶解與適量超純水中,將兩者混勻后,用0.1mol/L的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至7.8,容量瓶定容至1 000 mL。

1.2 重組抗菌肽的分離純化與純度檢測(cè)

重組抗菌肽在畢赤酵母表達(dá)體系中大量發(fā)酵表達(dá),發(fā)酵液經(jīng)4℃,12 000 r/min,離心20 min后取上清,上清液經(jīng)過(guò)0.22 μm的濾膜過(guò)濾。根據(jù)重組抗菌肽含有His標(biāo)簽選用Ni2+親和層析進(jìn)行分離純化。先用平衡緩沖液飽和,將重組抗菌肽上清液上柱吸附,再用洗脫緩沖液洗滌,收集合并活性峰組分。純化的重組抗菌肽樣品,通過(guò)考馬斯亮藍(lán)試劑盒測(cè)定濃度,上樣量20 μL,Tricine-SDS-PAGE(15.5%)40V冰浴電泳過(guò)夜,考馬斯亮藍(lán)染色,檢測(cè)純化后重組抗菌肽的純度。

1.3 微囊的制備方法

在室溫(25℃±1℃)下,取氯化鈣溶液在磁力攪拌器上攪拌,用注射器逐滴滴入含重組抗菌肽(總量為G)的海藻酸鈉溶液,即可得到白色凝膠狀固體,繼續(xù)在溶液中孵育(室溫)15 min左右,將微囊用純水洗滌后過(guò)濾分離,冷凍干燥48 h[11]。

1.4 微囊粒徑的測(cè)定與形態(tài)表征

隨機(jī)選取制備好的微囊(n＞30)緊密排成一排,用游標(biāo)卡尺測(cè)量[12],重復(fù) 3次,求其平均值作為每粒粒徑,同時(shí)觀察和記錄腸溶性微囊的形狀及其圓整度。粒徑計(jì)算公式為D=∑Di/n。

1.5 微囊包封率的測(cè)定

按照1.3方法制備好微囊后,將反應(yīng)剩余液倒入量筒,量其體積V,再用Bradford法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度C。按照公式：包封率E= (G－CV)/G×100%計(jì)算微囊包封率。式中G代表制備微囊時(shí)加入的重組抗菌肽的總量,CV代表制備微囊時(shí)未被包封的重組抗菌肽的量。

1.6 微囊制備工藝的研究

考察氯化鈣的濃度、海藻酸鈉的濃度對(duì)制備微囊影響。選取氯化鈣濃度的三個(gè)水平(1.0%,1.5%,2.0%)和海藻酸鈉的3個(gè)水平(1.0%,1.5%,2.0%),每個(gè)試驗(yàn)處理重復(fù) 3次,分別制備重組抗菌肽海藻酸鈉微囊,觀察不同水平對(duì)微囊成型的影響,選擇微囊成型速度快,粒徑圓整,包封率較高的為最優(yōu)制備工藝。

1.7 重組抗菌肽海藻酸鈉微囊的體外釋放

采用最佳工藝制備的抗菌肽海藻酸鈉微囊,等比例分為兩份,分別置于盛有 30 mL的模擬胃液(pH 2.0)和模擬腸液(pH 7.8)的三角瓶中,于 28.0℃±0.5℃恒溫?fù)u床中震蕩,震蕩速度為90 r/min,定時(shí)取出一定量的釋放液樣品,再補(bǔ)加入等量的模擬胃液和模擬腸液。Bradford法測(cè)定樣品中的重組抗菌肽含量,從而繪出釋放曲線。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組抗菌肽的純化結(jié)果

重組抗菌肽純化樣品電泳結(jié)果見(jiàn)圖1。在 5.8 kDa處,純化前后的重組抗菌肽樣品都有一條比較清楚的帶,與重組抗菌肽的分子質(zhì)量一致。同等上樣量和電泳條件下,純化后的重組抗菌肽較純化前雜帶減少,表明其純度有所提高;但其蛋白濃度也相對(duì)降低,表明在純化過(guò)程中重組抗菌肽部分損失。

圖1 重組抗菌肽純化樣品的Tricine-SDS-PAGE電泳圖Fig.1 Tricine-SDS-PAGE profile of purified recombinant AMP

2.2 重組抗菌肽海藻酸鈉微囊的制備工藝

根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果,當(dāng)氯化鈣的濃度低于 1.5%時(shí),形成的微囊凝膠膜較薄,硬度較低,冷凍干燥后圓整度較低;但隨著氯化鈣濃度的增大,包封率逐漸降低,同時(shí)考慮到高濃度的氯化鈣會(huì)對(duì)固定生物分子有破壞作用,因此氯化鈣的濃度在 1.5%為宜。而海藻酸鈉濃度低于 1.0%時(shí)微囊的成型性能差;當(dāng)濃度提高到 1.5%時(shí),可以得到圓整光滑的微囊;海藻酸鈉的濃度增大,得到的海藻酸鈉微囊的包封率越高,故選取海藻酸鈉的濃度為2.0%。如表1所示。

根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果,選取氯化鈣的濃度 1.5%和海藻酸鈉的濃度2.0%作為重組抗菌肽海藻酸鈉微囊的最優(yōu)制備條件。

表1 氯化鈣濃度和海藻酸鈉濃度對(duì)微囊的形態(tài)和包封率的影響(平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差,n=3)Tab.1 Effects of calcium chloride concentration and sodium alginate concentration on the morphology and encapsulation rate of microcapsules(mean±SD,n=3)

2.3 微囊的包封率和粒徑

在所選取的最優(yōu)制備條件下,可得到光滑圓整的重組抗菌肽海藻酸鈉微囊,冷凍干燥后的微囊直徑約為1.1 mm,包封率為83.87%。

圖2 重組抗菌肽海藻酸鈉微囊的粒徑Fig.2 The size of recombinant AMP sodium alginate microcapsules

2.4 微囊的體外釋放情況

隨著重組抗菌肽在模擬胃液中的釋放,溶出液中的重組抗菌肽的濃度逐漸升高,大約2 h之后趨于穩(wěn)定,約為14%,如圖3所示。說(shuō)明重組抗菌肽在模擬胃液中的溶出程度很小,表明重組抗菌肽海藻酸鈉微膠囊對(duì)酸性環(huán)境不敏感(pH 2.0),可以耐受胃酸的破壞。

圖3 海藻酸鈉微囊在模擬胃液中的釋放曲線(pH 2.0)Fig.3 In vitro releasing curve of sodium alginate microcapsules in simulated gastric fluid (pH 2.0)

重組抗菌肽海藻酸鈉微囊在模擬腸液中的釋放速度和釋放量明顯增大,5 h時(shí)重組抗菌肽釋放量達(dá)到98%,如圖4所示。比較圖3和圖4可知,重組抗菌肽在模擬腸液中的釋放速度和釋放量遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于在模擬胃液中。因此可認(rèn)為采用海藻酸鈉為腸溶性壁材制得的微囊確實(shí)具有腸溶性,使重組抗菌肽在口服時(shí)可以減少胃液中胃酸的破壞。

圖4 海藻酸鈉微囊在模擬腸液中的釋放曲線(pH 7.8)Fig.4 In vitro releasing curve of sodium alginate microcapsules in simulated intestinal fluid (pH 7.8)

3 討論

近年來(lái),水產(chǎn)品安全問(wèn)題備受關(guān)注。然而,由于高密度、工廠化、集約化養(yǎng)殖模式的建立和推廣,盲目追求產(chǎn)量效益的同時(shí)導(dǎo)致病害問(wèn)題逐年增加,抗生素等藥物的過(guò)度使用,不僅造成水環(huán)境的污染,而且導(dǎo)致部分水產(chǎn)動(dòng)物耐藥性增加并在其體內(nèi)殘留,嚴(yán)重影響了水產(chǎn)品安全和出口,給我國(guó)的水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[13]。因此開(kāi)發(fā)和研究環(huán)境友好型、無(wú)公害新型漁藥成為發(fā)展趨勢(shì)。

抗菌肽具有廣譜抗菌活性。重組抗菌肽作為飼料添加劑對(duì)肉雞生長(zhǎng)[14]、仔豬腹瀉[15]有較好的效果。目前,抗菌肽用于水產(chǎn)養(yǎng)殖生產(chǎn)的應(yīng)用研究較少。姜蘭等[16]將重組酵母表達(dá)的重組抗菌肽濃縮干燥后,添加到飼料中,對(duì)中華鱉紅鼻子病、赤斑病、穿孔病等一些常見(jiàn)病害具有一定的防治效果;陳冰等[17]通過(guò) 8周的生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)研究了在飼料中添加家蠅幼蟲(chóng)抗菌肽提取物對(duì)凡納濱對(duì)蝦的影響,結(jié)果表明,添加適量的抗菌肽對(duì)其具有一定的促生長(zhǎng)作用,并能提高對(duì)蝦的免疫相關(guān)指標(biāo);王廣軍等[18]研究了抗菌肽在南美白對(duì)蝦養(yǎng)殖中的應(yīng)用效果,結(jié)果表明,在飼料中添加抗菌蛋白,無(wú)論是日生長(zhǎng)速度、相對(duì)增重率、飼料系數(shù)、成活率,還是抗病力方面均顯著提高;黃自然等[19]研究抗菌肽飼養(yǎng)南美白對(duì)蝦的效果,在飼料中添加抗菌肽,結(jié)果表明抗菌肽有利于對(duì)蝦的孵化?？咕膶?duì)水產(chǎn)動(dòng)物具有促生長(zhǎng)、保健和治療疾病的功能,屬于無(wú)毒副作用、無(wú)殘留、無(wú)致細(xì)菌耐藥性的一類環(huán)保型制劑。本研究中通過(guò)親和層析對(duì)重組抗菌肽進(jìn)行分離純化,獲得高純度的重組抗菌肽,為進(jìn)一步研究抗菌肽的抗菌活性奠定了基礎(chǔ)。

目前,由于海藻酸鈉凝膠具有良好的生物相容性、對(duì)生物組織無(wú)免疫原性、可生物降解等優(yōu)點(diǎn)可用作新型藥物的載體,既能保證抗菌肽的活性又能實(shí)現(xiàn)控制釋放[20-21]。在制備重組抗菌肽海藻酸鈉微囊的過(guò)程中,氯化鈣的濃度和海藻酸鈉的濃度對(duì)微囊的包封率有顯著影響。當(dāng)海藻酸鈉與 Ca2+反應(yīng)形成微囊時(shí),隨著海藻酸鈉的濃度的增加,其包封率逐漸增大,與高春鳳等[22]的研究結(jié)果一致;當(dāng)氯化鈣的濃度過(guò)低,鈣離子與海藻酸鈉交聯(lián)不完全,成囊效果差,影響了包封率,隨著氯化鈣濃度的增加,包封率先變大后變小[23],本研究中隨著氯化鈣的濃度增加,包封率降低,說(shuō)明鈣離子與海藻酸鈉交聯(lián)完全。海藻酸鈉還可以與氯化鋇、聚賴氨酸、殼聚糖等為壁材[24],采用膜乳化等新型技術(shù)制備復(fù)合型微囊[25],通過(guò)方法的改進(jìn)和各項(xiàng)參數(shù)的優(yōu)化進(jìn)一步提高微囊的穩(wěn)定性,最大限度的保持生物活性物質(zhì)的活性。

本研究利用海藻酸鈉制備了具有腸溶性的重組抗菌肽海藻酸鈉微囊,能夠使重組抗菌肽在水產(chǎn)動(dòng)物的胃中釋放較少,并在其腸道中大量釋放,從而起到抑菌殺毒的作用。目前多肽和蛋白類藥物常用的給藥途徑通常是注射或浸泡,但在水產(chǎn)養(yǎng)殖中浸泡法免疫有效期較短,往往需同時(shí)提高滲透壓或使用各種佐劑等;而注射法僅適用于較大規(guī)格的養(yǎng)殖動(dòng)物且工作量大,不適應(yīng)大規(guī)模使用[26];而口服給藥是最簡(jiǎn)單和最方便的給藥方式,對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物無(wú)損傷,操作方便,不受時(shí)間、地點(diǎn)、生長(zhǎng)階段的限制,但由于多肽和蛋白質(zhì)自身特性,直接口服后會(huì)被胃蛋白酶、胰蛋白酶等降解成小分子氨基酸,其生物活性也隨之消失,而將多肽和蛋白類藥物制成微粒系統(tǒng)給藥,不僅能有效的防止藥物在體內(nèi)很快降解,提高其生物利用度,還能將藥物緩慢釋放并靶向給藥。腸溶性微囊的研究為以后抗菌肽在水產(chǎn)動(dòng)物疾病預(yù)防與治療方面實(shí)現(xiàn)口服給藥提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

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