(華南師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,廣東省水產(chǎn)健康安全養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣東省高等學(xué)校生態(tài)與環(huán)境科學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣東 廣州 510631)

細(xì)胞在吞噬過(guò)程中,伴隨有大量活性氧(Reactive oxygen species,簡(jiǎn)稱ROS)產(chǎn)生的過(guò)程稱為呼吸爆發(fā)。這些活性氧是細(xì)胞毒氧化劑,包括超氧陰離子(O2-)、過(guò)氧化氫(H2O2)和羥自由基[·OH]等,在殺滅和消化病原微生物的免疫防御中起著十分重要的作用[1-2]。在蝦類營(yíng)養(yǎng)免疫學(xué)研究中,呼吸爆發(fā)活力常作為反映蝦體免疫狀況的重要指標(biāo)。ROS含量也極易受外界脅迫環(huán)境的誘導(dǎo),鹽度、pH、溫度、重金屬等環(huán)境應(yīng)激均會(huì)導(dǎo)致 ROS的大量上升,因此ROS含量也是反映蝦類是否受到不良因素脅迫的重要指標(biāo)[3]。這些 ROS在生物體內(nèi)的壽命很短,建立一種更加快速、靈敏的ROS檢測(cè)方法尤為重要。

流式細(xì)胞術(shù)(Flow cytometry,簡(jiǎn)稱FCM)是一種快速、靈敏、準(zhǔn)確和檢測(cè)量大的細(xì)胞水平的檢測(cè)技術(shù),現(xiàn)已逐漸應(yīng)用到一些貝類的研究中[4-7]。2′,7′-二氫二氯熒光黃雙乙酸鈉(DCFH-DA)是活性氧的特異探針,它本身不發(fā)熒光,可自由穿過(guò)細(xì)胞膜進(jìn)入到細(xì)胞內(nèi),被胞內(nèi)的酯酶分解為 DCFH而保留在胞內(nèi),各類ROS會(huì)氧化DCFH為發(fā)強(qiáng)綠色熒光的DCF,利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)胞內(nèi)的DCF熒光強(qiáng)度即可反映細(xì)胞的ROS水平。此方法在高等哺乳動(dòng)物的細(xì)胞研究中已被廣泛應(yīng)用,但在蝦類細(xì)胞研究中的應(yīng)用仍未見(jiàn)報(bào)道。由于蝦類血細(xì)胞和高等動(dòng)物細(xì)胞存在較大的差異,因此本研究對(duì)FCM檢測(cè)蝦類血細(xì)胞ROS含量的方法中的染料濃度和孵育時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化確定,以期為FCM在蝦類細(xì)胞學(xué)和免疫學(xué)研究中的應(yīng)用推廣打下一定的基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

斑節(jié)對(duì)蝦(Penaeus monodon)購(gòu)于廣東省珠海市某養(yǎng)殖場(chǎng),體長(zhǎng)5～8cm。對(duì)蝦在實(shí)驗(yàn)室馴養(yǎng)一周后,選取附肢完整、無(wú)病患、活力強(qiáng)、處于蛻皮間期的個(gè)體作為實(shí)驗(yàn)用對(duì)蝦。DCFH-DA和碘化丙錠(PI)均購(gòu)自Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 血細(xì)胞懸液的制備

用 1mL一次性注射器吸取預(yù)冷的抗凝劑(葡萄糖20.5 g/L,檸檬酸鈉8 g/L,氯化鈉4.2 g/L,pH 7.5),然后從蝦的圍心腔抽取等量的血淋巴。獲得足量的血淋巴后,再用預(yù)冷的抗凝劑調(diào)整細(xì)胞濃度約為1×106個(gè)/mL。取200 μL測(cè)定細(xì)胞活性,剩下的血淋巴進(jìn)行分裝4管,每管1.6 mL。

1.2.2 流式細(xì)胞儀

實(shí)驗(yàn)所用流式細(xì)胞儀是美國(guó) BD(Becton Dickinson)公司生產(chǎn)的FACSCalibur,應(yīng)用CellQuest軟件(Becton Dickinson Immunocytometry Systems,San Jose,CA) 進(jìn)行實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的獲取和分析。每個(gè)樣品均獲取 10 000個(gè)細(xì)胞。檢測(cè)細(xì)胞的前向角散射光(Forward light scatter,簡(jiǎn)稱 FSC)和側(cè)向角散射光(Side light scatter,簡(jiǎn)稱SSC),FSC顯示細(xì)胞的大小,SSC顯示細(xì)胞的顆粒復(fù)雜度。第一熒光通道檢測(cè)DCF熒光強(qiáng)度,第二熒光通道檢測(cè)PI熒光強(qiáng)度。

1.2.3 染料濃度和孵育時(shí)間對(duì)細(xì)胞DCF熒光量的影響

以二甲基亞砜(DMSO)為溶劑把DCFH-DA稀釋為不同濃度(0.01,0.1,1和10 mmol/L)的工作液,每管血淋巴中分別加入 16 μL各濃度的染料工作液,以獲得染料的終濃度分別為0.1,1,10和100 μmol/L。加入染料后在室溫下避光孵育,在加入染料后的第0,15,30,45和60分鐘分別取200 μL,用200目篩網(wǎng)過(guò)濾后上機(jī)檢測(cè)。結(jié)果以 DCF熒光量為橫坐標(biāo),細(xì)胞數(shù)量為縱坐標(biāo)的單參數(shù)直方圖顯示,分析 DCF平均熒光量。

1.2.4 染料濃度和孵育時(shí)間對(duì)細(xì)胞形態(tài)的影響

在檢測(cè)DCF熒光量的同時(shí),在FSC為橫坐標(biāo)、SSC為縱坐標(biāo)的散點(diǎn)圖中獲取細(xì)胞的FSC和SSC數(shù)據(jù)。比較各組與0 h時(shí)的FSC-SSC散點(diǎn)圖,分析細(xì)胞的形態(tài)特征是否受到染料濃度和孵育時(shí)間的影響。

1.2.5 染料濃度和孵育時(shí)間對(duì)細(xì)胞活性的影響

為確定不同濃度的染料以及孵育時(shí)間是否會(huì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒性,以 PI作為探針,對(duì)細(xì)胞的活性進(jìn)行檢測(cè)。在加入DCFH-DA后第30和60分鐘,分別各取200 μL細(xì)胞懸液加入10 μg/mL的PI,避光孵育10 min后,200目篩網(wǎng)過(guò)濾后上機(jī)檢測(cè)。另設(shè)一個(gè)不加DCFH-DA的空白對(duì)照組。結(jié)果以PI熒光量為橫坐標(biāo),細(xì)胞數(shù)量為縱坐標(biāo)的單參數(shù)直方圖顯示。PI是核酸特異性染料,活細(xì)胞對(duì) PI低染,死細(xì)胞因細(xì)胞膜不完整而對(duì) PI高染,在 PI直方圖上以標(biāo)尺(Marker)劃定死、活細(xì)胞的區(qū)域,分析死、活細(xì)胞的比例(圖1)。

圖1 斑節(jié)對(duì)蝦血細(xì)胞PI染色直方圖Fig.1 PI staining histogram of Penaeus monodon haemocytes

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)利用SPSS 11.5進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,結(jié)果顯示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean ± SD),P＜0.05確認(rèn)為差異性顯著,P＜0.01確認(rèn)為差異性極顯著。

2 結(jié)果

2.1 不同染料濃度和孵育時(shí)間的細(xì)胞 DCF熒光強(qiáng)度

結(jié)果如圖2所示,染料濃度為0.1、1和10 μmol/L時(shí),隨著孵育時(shí)間的延長(zhǎng),細(xì)胞 DCF熒光均不斷地增強(qiáng)。0.1和1 μmol/L組的細(xì)胞DCF熒光強(qiáng)度一直低于10 μmol/L組。10 μmol/L組在前 30 min熒光量急劇上升,30 min后上升較緩。100 μmol/L組在前15 min熒光量高于10 μmol/L組,15 min后上升緩慢并且低于10 μmol/L組,45 min后熒光量下降。

圖2 不同DCFH-DA濃度下斑節(jié)對(duì)蝦血細(xì)胞DCF平均熒光量隨時(shí)間的變化Fig.2 DCF mean fluorescence of Penaeusmonodon haemocytes incubated with different concentration of DCFH-DA

2.2 不同染料濃度和孵育時(shí)間的細(xì)胞形態(tài)的影響

如圖3-1,DCFH-DA染色的斑節(jié)對(duì)蝦新鮮血細(xì)胞通過(guò) FSC-SSC散點(diǎn)圖能很好地區(qū)分為 3類細(xì)胞：透明細(xì)胞(R1),半顆粒細(xì)胞(R2)和顆粒細(xì)胞(R3)。0.1、1和10 μmol/L染料組在60 min內(nèi)細(xì)胞的形態(tài)沒(méi)有明顯的變化,能較好地區(qū)分 3類細(xì)胞。100 μmol/L染料孵育30 min開始細(xì)胞呈現(xiàn)固縮現(xiàn)象,部分小顆粒細(xì)胞和大顆粒細(xì)胞的FSC下降至與透明細(xì)胞相似。60 min時(shí)細(xì)胞固縮現(xiàn)象加劇,有更多的顆粒細(xì)胞偏離原來(lái)區(qū)域,部分細(xì)胞SSC下降(圖3-2)。

2.3 不同染料濃度和孵育時(shí)間的細(xì)胞活性的影響

由圖4可見(jiàn),細(xì)胞的最初活性為96.3±1.1%。在添加 DCFH-DA 30 min 后,0.1、1、10 和 100 μmol/L組的活細(xì)胞比例分別為93.2%、91.5%、92.5%、79.7%,100 μmol/L組顯著低于其他組(P＜0.05);60 min后,活細(xì)胞比例分別為 92.5%、92.2%、86.6%和62.0%,100 μmol/L 組顯著低于其他組(P＜0.05)。

3 討論

對(duì)于不同的細(xì)胞,可能由于細(xì)胞表面積、染料的細(xì)胞膜透過(guò)性和細(xì)胞的活性氧含量等因素的不同,其適宜的染料濃度會(huì)有所不同。在人類嗜中性粒細(xì)胞的研究中,常用的濃度為10 μmol/L[8-9],大鼠巨噬細(xì)胞使用 500 μmol/L[10],小鼠成纖維細(xì)胞使用 20 μmol/L[11],在一些海洋無(wú)脊椎動(dòng)物的研究中也較常用 10 μmol/L[4,6-7,12],也有的研究使用 5 μmol/L[5],在酵母研究中只使用了10-4μmol/L[13]。理想的染料濃度和孵育時(shí)間應(yīng)符合以下的條件：應(yīng)在最短的孵育時(shí)間內(nèi)與活性氧較充分地反應(yīng)并發(fā)出熒光;避免對(duì)細(xì)胞的形態(tài)和活性產(chǎn)生影響。因此,染料濃度必須足夠,但不能過(guò)高,以免對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒性影響;孵育時(shí)間應(yīng)盡量縮短,盡量減少血細(xì)胞因離體時(shí)間過(guò)長(zhǎng)而導(dǎo)致的各種變化。

圖3 斑節(jié)對(duì)蝦血細(xì)胞FSC-SSC散點(diǎn)Fig.3 FSC-SSC dot plot of Penaeus monodon haemocytes

圖4 不同DCFH-DA濃度下斑節(jié)對(duì)蝦血細(xì)胞的存活率Fig.4 Cell viability of Penaeus monodon haemocytes incubated with different concentration of DCFH-DA

根據(jù)以往其他動(dòng)物細(xì)胞的研究,本研究選取了0.1～100 μmol/L中的4個(gè)梯度濃度進(jìn)行檢測(cè)分析。從細(xì)胞熒光量的變化情況看,0.1和1 μmol/L組一直顯著低于10 μmol/L組,表明0.1和1 μmol/L染料不足,不能與細(xì)胞內(nèi)的活性氧充分反應(yīng);100 μmol/L組雖然一直顯著高于0.1和1 μmol/L組,在前15 min也顯著高于10 μmol/L組,但30 min后開始顯著低于10 μmol/L組,出現(xiàn)這種染料濃度高反而細(xì)胞熒光量低的情況,可能是染料濃度過(guò)高而對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生了毒性。因此10 μmol/L的染料濃度較適宜。

形態(tài)和活性的檢測(cè)結(jié)果也證實(shí)100 μmol/L的染料對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生了毒性影響,它導(dǎo)致了細(xì)胞的固縮和死亡率的上升。死亡細(xì)胞的 DCF熒光量下降,可能有以下的原因：細(xì)胞膜破裂而導(dǎo)致活性氧流失到胞外;細(xì)胞膜破裂而導(dǎo)致 DCFH和 DCF流失到胞外;細(xì)胞因受毒性傷害而酯酶活力下降,DCFH-DA在進(jìn)入細(xì)胞后不能完全被酯酶分解;細(xì)胞毒性致死的過(guò)程中可能有活性氧參與反應(yīng)而被消耗。

形態(tài)和活性的檢測(cè)結(jié)果顯示,染料濃度為 10 μmol/L,孵育 60 min時(shí)才使細(xì)胞活性有所下降,但不顯著,因此表明10 μmol/L DCFH-DA在60 min內(nèi)對(duì)蝦血細(xì)胞是安全的。但是,蝦血細(xì)胞在離體后極容易受到刺激而產(chǎn)生各種變化,如脫顆粒、黏連和死亡等[2],因此,對(duì)于蝦血細(xì)胞的 FCM 檢測(cè),更應(yīng)盡量縮短染料的孵育時(shí)間。研究結(jié)果顯示,10 μmol/L組在前30 min細(xì)胞的熒光量上升很快,后30 min上升緩慢,表明 30 min的孵育時(shí)間已使胞內(nèi)絕大部分ROS與染料反應(yīng),因此綜合考慮認(rèn)為孵育時(shí)間在 30 min為宜。

除染料濃度和孵育時(shí)間影響細(xì)胞的熒光量外,細(xì)胞密度也是需要注意的問(wèn)題。如果細(xì)胞密度過(guò)大,在相同染料濃度下,每個(gè)細(xì)胞所分得的熒光探針必然減少,可能達(dá)不到飽和狀態(tài);另外,如果在染色前各組間沒(méi)有較統(tǒng)一的細(xì)胞密度,這將可能導(dǎo)致染色過(guò)程中存在較大的誤差。流式細(xì)胞儀檢測(cè)常用的細(xì)胞密度為 1×106個(gè)/mL,本研究中在染色前已先把細(xì)胞密度調(diào)整約為 1×106個(gè)/mL,因此所測(cè)得的適宜染料濃度和孵育時(shí)間是這一細(xì)胞密度下的適宜值。

此外,本研究中使用的染料溶劑為 DMSO。DMSO是熒光染料的常用溶劑,染料溶解于 DMSO中在-20℃的條件下能較好地保存一段時(shí)間。以往的研究已表明微量的DMSO對(duì)細(xì)胞沒(méi)有顯著的毒性影響[14],因此DMSO可作為安全的溶劑進(jìn)行使用。

通過(guò)本研究確立了利用FCM檢測(cè)蝦血細(xì)胞ROS的適宜染料濃度和孵育時(shí)間,為FCM在蝦類研究中的應(yīng)用推廣打下了一定的基礎(chǔ)。FCM可以通過(guò)分析細(xì)胞的前向角散射光和側(cè)向角散射光特征來(lái)區(qū)分不同的細(xì)胞亞群,因此應(yīng)用FCM還可以分析不同細(xì)胞亞群的 ROS產(chǎn)生量,對(duì)于研究不同細(xì)胞的功能提供了很好的技術(shù)平臺(tái),這是其他 ROS檢測(cè)方法無(wú)法做到的。FCM現(xiàn)已應(yīng)用于多種蝦類的血細(xì)胞分類[15-16]和倍性分析[17-19]中,可以相信,隨著 FCM 技術(shù)的不斷推廣和發(fā)展,它在甲殼動(dòng)物以及其他水生動(dòng)物研究中的應(yīng)用也將越來(lái)越廣泛和深入。

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