馬曉磊,張 琳,楊官品,朱葆華,潘克厚

(1.中國(guó)海洋大學(xué) 海水養(yǎng)殖教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 應(yīng)用微藻生物學(xué)研究室,山東 青島 266003;2.中國(guó)海洋大學(xué) 海洋生命學(xué)院,山東 青島 266003)

隨著陸地資源的日益匱乏,開(kāi)發(fā)和利用海洋,從海洋生物資源中索要食品、藥品和能源已成為人們的共識(shí),也是研究者的研究重點(diǎn)和熱點(diǎn)。海洋微藻是海洋生態(tài)系統(tǒng)中重要的初級(jí)生產(chǎn)者,種類(lèi)繁多,數(shù)量龐大,尤其是一些經(jīng)濟(jì)微藻已經(jīng)成功地為人類(lèi)提供了豐富的資源。但是,自然資源的開(kāi)發(fā)在一些研究和應(yīng)用領(lǐng)域已經(jīng)不能滿(mǎn)足人類(lèi)的需求,隨著基因工程技術(shù)與手段的成熟與開(kāi)發(fā),通過(guò)對(duì)海洋微藻進(jìn)行基因工程操作來(lái)研究和開(kāi)發(fā)微藻已成為生產(chǎn)高附加值產(chǎn)品和選育藻種的重要手段。但相對(duì)于高等植物和大型藻,微藻基因工程改造才剛剛起步,其中微藻原生質(zhì)體的制備是基礎(chǔ)。本文旨在尋求一種高效簡(jiǎn)便的海洋微藻原生質(zhì)體制備和觀察方法,從而為在微藻中進(jìn)行基因工程操作奠定基礎(chǔ)。

微擬球藻(Nannochloropsis oculata)是單細(xì)胞真胞藻,屬真眼點(diǎn)藻綱,長(zhǎng)2～5 μm[1-3],廣泛分布于海水、淡水中。它不僅被廣泛用于水產(chǎn)動(dòng)物的餌料[4],還是許多高附加值產(chǎn)品的重要來(lái)源,如蛋白、色素、多不飽和脂肪酸等[5],是一個(gè)具有較高經(jīng)濟(jì)價(jià)值的海洋藻種,也是進(jìn)行遺傳育種改造的良好材料。本研究在 Chen等[8]方法的基礎(chǔ)上,綜合考慮酶處理時(shí)間和初始細(xì)胞密度兩個(gè)因子,選取半纖維素酶(Hemicellulase)和崩潰酶(Driselase)混合液制備原生質(zhì)體。同時(shí)將原生質(zhì)體細(xì)胞染色后于熒光顯微鏡下觀察拍照,并進(jìn)行了原生質(zhì)體細(xì)胞的再生實(shí)驗(yàn)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑及儀器

微擬球藻培養(yǎng)基母液配制使用的生化試劑均由國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn)。光照培養(yǎng)箱購(gòu)自南京金恒實(shí)驗(yàn)儀器廠。

制備原生質(zhì)體所用半纖維素酶(Hemicellulase)和崩潰酶(Driselase)以及原生質(zhì)體染料 Calcofluor White均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。

再生培養(yǎng)基：在新鮮 f/2海水培養(yǎng)基中添加滲透壓穩(wěn)定劑(0.2M KCl溶液)和原生質(zhì)體膜穩(wěn)定劑(0.1% CaC12),固體培養(yǎng)基另加 1.0%～1.2% 瓊脂制備。

1.2 藻種培養(yǎng)

微擬球藻(Nannochloropsis oculata)購(gòu)于澳大利亞微藻種質(zhì)庫(kù)(Australian CSIRO Collection of Living Microalgae,http：//www.cmar.csiro.au/microalgae),編號(hào)為CS-179。

培養(yǎng)條件：選用青島近海海水,經(jīng)0.4 μm 濾膜過(guò)濾后高壓蒸汽滅菌。培養(yǎng)基為新鮮f/2海水培養(yǎng)基[6-7],pH 為 7.8,培養(yǎng)溫度 25°C±1℃,鹽度 30‰,70 μmol/(s·m2)光照連續(xù)培養(yǎng),光暗比為 12h：12h。培養(yǎng)容器為三角燒瓶,置于光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3 原生質(zhì)體的制備

1.3.1 藻細(xì)胞的預(yù)處理

取培養(yǎng)至指數(shù)生長(zhǎng)期的藻細(xì)胞培養(yǎng)液進(jìn)行計(jì)數(shù),在8 000 r/min下離心10 min收集藻細(xì)胞,用500 μL新鮮的f/2海水培養(yǎng)基沖洗細(xì)胞2～5次,保證細(xì)胞表面無(wú)營(yíng)養(yǎng)鹽和其他雜質(zhì)以減少對(duì)原生質(zhì)體制備的影響,再重懸于500 μL新鮮的f/2培養(yǎng)基中。

1.3.2 原生質(zhì)體的制備方法

微擬球藻原生質(zhì)體的制備在酶處理液的選擇上參照Chen等[8]文獻(xiàn)。實(shí)驗(yàn)選取處于指數(shù)生長(zhǎng)期的藻細(xì)胞,在500 μL 密度為 1×107cells/mL,2×107cells/mL,3×107cells/mL 的藻細(xì)胞液中加入終濃度為4%半纖維素酶和2%崩潰酶溶液,調(diào)pH為5.0,用錫箔紙包被,保證嚴(yán)格避光,于搖床上進(jìn)行80 r/min,37℃ 孵育,分別在酶處理0.5,1,2,3,3.5,4,4.5 h 7個(gè)時(shí)間點(diǎn)取樣,用Calcofluor White染料進(jìn)行染色后觀察原生質(zhì)體制備情況。對(duì)同一視野分別在可見(jiàn)光和熒光激發(fā)下進(jìn)行觀察拍照,每次取樣至少拍攝三個(gè)視野,計(jì)算酶處理不同時(shí)間不同密度藻細(xì)胞原生質(zhì)體的制備率。計(jì)算公式如下：

1.3.3 原生質(zhì)體的顯微觀察

按照Calcofluor White染料的使用說(shuō)明[9]進(jìn)行原生質(zhì)體顯微觀察樣品的制備：取 20 μL制備的原生質(zhì)體細(xì)胞于250 μL PCR管中,加入10 μL Calcofluor White染料和10 μL 10% KOH溶液,室溫孵育 1 min以上,然后置于熒光顯微鏡在藍(lán)光(波長(zhǎng)范圍為300～400 nm)激發(fā)下觀察。

1.3.4 原生質(zhì)體細(xì)胞的再生

分別取7個(gè)時(shí)間點(diǎn)酶處理樣品100 μL原生質(zhì)體細(xì)胞以1 000 r/min轉(zhuǎn)速離心5 min收集,用500 μL新鮮的 f/2海水培養(yǎng)基輕輕重懸沖洗兩次,再加入5 mL新鮮的f/2海水培養(yǎng)基,在200 r/min,28℃培養(yǎng)3～5 d。離心收集后重懸于20 μL新鮮的f/2海水培養(yǎng)基中,均勻涂布于再生培養(yǎng)基平板上,于 25℃光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)重復(fù)。

1.3.5 原生質(zhì)體再生率的計(jì)算

取100 μL酶處理后的原生質(zhì)體懸液,分別使用低滲溶液(無(wú)菌水)和高滲溶液(0.2 mol/L KCl溶液)進(jìn)行重懸處理,靜置60 min后混勻取樣用血球計(jì)數(shù)板進(jìn)行計(jì)數(shù)。同時(shí),將無(wú)菌水和高滲溶液稀釋后的懸液分別接入低滲平板和再生平板,置于 28℃光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng),長(zhǎng)出藻落后計(jì)數(shù),計(jì)數(shù)方法參照王明茲等[10]的方法。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論

2.1 不同酶處理時(shí)間和細(xì)胞密度對(duì)原生質(zhì)體制備率的影響

對(duì)不同密度藻細(xì)胞(1×107,2×107,3×107cells/mL)進(jìn)行不同酶處理時(shí)間,統(tǒng)計(jì) 7個(gè)時(shí)間點(diǎn)取樣的原生質(zhì)體細(xì)胞制備率如圖1所示。發(fā)現(xiàn)對(duì)同一密度藻細(xì)胞處理1～3 h內(nèi)原生質(zhì)體制備率較高,并且在這3個(gè)時(shí)間點(diǎn)上相差不大。但是酶處理時(shí)間小于0.5 h或者大于3 h制備率都會(huì)下降。酶處理時(shí)間是影響原生質(zhì)體制備率的一個(gè)重要因子?？紤]到酶處理時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)對(duì)原生質(zhì)的復(fù)壁產(chǎn)生影響,因此本實(shí)驗(yàn)認(rèn)為適宜選用的酶處理時(shí)間為1 h。

對(duì)不同密度藻細(xì)胞進(jìn)行酶處理相同時(shí)間比較發(fā)現(xiàn),高密度的藻細(xì)胞要比低密度的藻細(xì)胞制備率較高,見(jiàn)圖1。顯微鏡下觀察不同密度藻細(xì)胞原生質(zhì)體細(xì)胞酶處理1 h后發(fā)現(xiàn)細(xì)胞比較完整,且視野內(nèi)沒(méi)有出現(xiàn)藻細(xì)胞碎片。本實(shí)驗(yàn)選細(xì)胞密度為可能對(duì)2×107cells/mL進(jìn)行原生質(zhì)體制備。

不同的藻細(xì)胞密度和不同的酶處理時(shí)間都是制約原生質(zhì)體制備率的關(guān)鍵因子。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)對(duì)同一細(xì)胞密度的藻細(xì)胞,酶處理時(shí)間過(guò)短或者過(guò)長(zhǎng)都會(huì)降低原生質(zhì)體的制備率,因此制備原生質(zhì)體時(shí)必須選取合適的處理時(shí)間。酶處理時(shí)間短制備率低可能是因?yàn)槊阜磻?yīng)時(shí)間不夠充分,來(lái)不及將更多的藻細(xì)胞制備成原生質(zhì)體;而延長(zhǎng)處理時(shí)間可能使已經(jīng)制備出的原生質(zhì)體發(fā)生破裂導(dǎo)致原生質(zhì)體制備率降低。因此,本實(shí)驗(yàn)建議選取的酶處理時(shí)間為1 h。

圖1 不同細(xì)胞密度藻細(xì)胞進(jìn)行酶處理不同時(shí)間原生質(zhì)體的制備率Fig.1 Treatment time and different densities on the efficiency of protoplast preparation by enzym digestion

與 Chen等[8]的實(shí)驗(yàn)相比較,本研究進(jìn)行了藻細(xì)胞密度對(duì)原生質(zhì)體制備率的影響的實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)證明不同密度藻細(xì)胞原生質(zhì)體制備率也不同,在一定范圍內(nèi),原生質(zhì)體的制備率隨著細(xì)胞密度的增加而增加。當(dāng)初始藻細(xì)胞密度達(dá)為2×107cells/mL,原生質(zhì)體的制備率接近 90%。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果與橢圓小球藻(Chlorella ellipsoidea)原生質(zhì)體制備率相一致[11],推測(cè)可能是藻細(xì)胞密度高,相互之間接觸比較頻繁,有利于酶混合液的消化作用或者是酶混合液在細(xì)胞密度高的反應(yīng)體系中能充分發(fā)揮出其活性。因此,為提高原生質(zhì)體制備率,保持較高的初始藻細(xì)胞密度是十分必要的。

對(duì)原生質(zhì)體制備后進(jìn)行Calcofluor White染料染色,該染料綁定到細(xì)胞壁上的纖維素和幾丁質(zhì),在顯微鏡下能在300～440 nm波長(zhǎng)光激發(fā)下發(fā)出熒光,圖2為原生質(zhì)體制備后于熒光顯微鏡下拍攝照片,熒光顯示的是細(xì)胞壁纖維素移除情況。

2.2 原生質(zhì)體細(xì)胞的再生

綜合考慮酶處理時(shí)間和初始細(xì)胞密度兩個(gè)影響因子,選取初始密度為2×107cells/mL的藻細(xì)胞進(jìn)行酶處理1 h后進(jìn)行原生質(zhì)體平板再生實(shí)驗(yàn),以觀察原生質(zhì)體再生情況。取復(fù)蘇3～5 d的原生質(zhì)體細(xì)胞和稀釋10倍后的細(xì)胞分別同時(shí)進(jìn)行高滲和低滲平板培養(yǎng)再生。培養(yǎng)至第12 d原生質(zhì)體在再生培養(yǎng)基上生長(zhǎng)情況如圖3所示,再生平板培養(yǎng)基上能觀察到單個(gè)的藻落,這說(shuō)明酶處理法制備的原生質(zhì)體是可以再生的,取再生細(xì)胞在顯微鏡下鏡檢發(fā)現(xiàn)與未處理的藻細(xì)胞從形態(tài)上面未觀察到差異。但是在低滲平板上培養(yǎng)的原生質(zhì)體在培養(yǎng)至第4個(gè)周后仍然觀察不到單藻落,這也說(shuō)明酶處理法獲得的原生質(zhì)體制備率高。

圖2 藻細(xì)胞制備原生質(zhì)體染色后熒光照片F(xiàn)ig.2 The fluorescence microscopy photos of the prepared protoplast

將再生平板上的單藻落轉(zhuǎn)入新鮮的f/2海水培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng),從細(xì)胞密度為2×107cells/mL開(kāi)始計(jì)數(shù),觀察藻細(xì)胞生長(zhǎng)速率,如圖4所示。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),原生質(zhì)體細(xì)胞生長(zhǎng)趨勢(shì)與非原生質(zhì)體生長(zhǎng)一致。

2.3 原生質(zhì)體平板再生率統(tǒng)計(jì)

原生質(zhì)體細(xì)胞經(jīng)過(guò)低滲溶液處理后將會(huì)破碎失去再生能力,只有未被制備成原生質(zhì)體的藻細(xì)胞才可以在低滲平板上進(jìn)行生長(zhǎng);而高滲溶液則能保持原生質(zhì)體的活力,繼續(xù)在高滲平板上培養(yǎng)可再生。對(duì)不同初始細(xì)胞密度藻細(xì)胞制備的原生質(zhì)體進(jìn)行再生率的統(tǒng)計(jì)。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)至第12 d后再生培養(yǎng)平板上可觀察到單個(gè)藻落,繼續(xù)培養(yǎng)至 4周后再生平板上長(zhǎng)出大量藻落,而低滲平板即使在培養(yǎng)至 4周之后依然觀察不到藻細(xì)胞。這說(shuō)明用酶處理的方法制備微擬球藻原生質(zhì)體再生率較高。

圖3 不同密度藻細(xì)胞原生質(zhì)體再生平板再生情況Fig.3 The regeneration of protoplasts with different densities

圖4 原生質(zhì)體與野生型藻細(xì)胞生長(zhǎng)Fig.4 The growth of protoplasts and wild algal cells

3 小結(jié)

海藻基因工程發(fā)展緩慢主要是因?yàn)槠湓|(zhì)體的制備不能通過(guò)高等植物標(biāo)準(zhǔn)的制備方法獲得[12]。近年來(lái),通過(guò)消化細(xì)胞壁混合酶液進(jìn)行微藻原生質(zhì)體的制備取得了較大的進(jìn)展。綠藻原生質(zhì)體的制備已經(jīng)通過(guò)商品化的纖維素酶和果膠酶獲得成功[12-13],紅藻和褐藻細(xì)胞壁中因?yàn)楹胁煌诰G藻的多糖,其原生質(zhì)體則是通過(guò)來(lái)自于海洋動(dòng)物和細(xì)菌的酶來(lái)處理[12,15]。微擬球藻在制備原生質(zhì)體時(shí)選取了四種酶,纖維素酶,半纖維素酶,果膠酶和崩潰酶,通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)終濃度為 4%半纖維素酶和 2%崩潰酶的酶混合液對(duì)微擬球藻原生質(zhì)體的制備率最高[8]。將制備的原生質(zhì)體和野生型藻細(xì)胞進(jìn)行生長(zhǎng)情況進(jìn)行觀察,發(fā)現(xiàn)兩者生長(zhǎng)趨勢(shì)一致。本實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果證明,4%半纖維素酶和 2%崩潰酶的酶混合液消化細(xì)胞密度為2×107cells/mL的微擬球藻1 h,原生質(zhì)體制備率和再生率都較高,生長(zhǎng)趨勢(shì)與野生型細(xì)胞一致,為制備該藻原生質(zhì)體的最優(yōu)條件。

本實(shí)驗(yàn)綜合考慮了酶混合液處理時(shí)間和原生質(zhì)體制備的初始細(xì)胞密度兩個(gè)因子進(jìn)行實(shí)驗(yàn),并進(jìn)行了微擬球藻原生質(zhì)體細(xì)胞的再生研究,證明采用商品化的酶混合液進(jìn)行微擬球藻原生質(zhì)體的制備是可行的,這為下一步對(duì)微擬球藻進(jìn)行基因工程操作奠定了基礎(chǔ),也為其他海洋微藻原生質(zhì)體的制備提供了理論依據(jù)。

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