吳建慧，郭 瑤，趙倩竹，崔艷桃，岳莉然，周蘊(yùn)薇

(1.東北林業(yè)大學(xué)園林學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150040； 2.東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150040)

絹毛委陵菜(Potentillasericea)是薔薇科委陵菜屬多年生草本植物，是一種良好的早春及初夏時(shí)節(jié)的觀花地被植物，能夠適應(yīng)北方寒冷、干旱的氣候環(huán)境，有良好的涵養(yǎng)水源、保持水土及護(hù)坡作用。目前，對(duì)委陵菜屬植物的研究主要集中在資源開(kāi)發(fā)利用、藥用、觀賞價(jià)值、引種馴化及花粉、葉表皮形態(tài)等方面[1-5]，而對(duì)其生理方面特別是干旱脅迫方面的研究極少。干旱是一個(gè)世界性的問(wèn)題，據(jù)統(tǒng)計(jì)，世界干旱、半干旱區(qū)占陸地面積的33%,我國(guó)的干旱、半干旱地區(qū)占國(guó)土面積的45%[6]。水分是影響植物分布、觀賞性狀和生長(zhǎng)發(fā)育的主要環(huán)境因子之一，水分短缺已成為干旱地區(qū)限制植物生產(chǎn)力的主要因素。植物的抗旱性及其對(duì)干旱脅迫的響應(yīng)和適應(yīng)過(guò)程與其自身的抗性緊密聯(lián)系，并以生化代謝、生理功能、形態(tài)適應(yīng)、生長(zhǎng)發(fā)育以及生物生產(chǎn)力等多種形式表現(xiàn)出來(lái)[7-9]。因此，系統(tǒng)地開(kāi)展干旱脅迫模擬試驗(yàn)，探討植物應(yīng)對(duì)干旱環(huán)境刺激或逆境的適應(yīng)及抵御機(jī)制，是把握植物對(duì)不同強(qiáng)度干旱脅迫響應(yīng)與適應(yīng)對(duì)策的有效手段，也是解答水分與植物關(guān)系的切入點(diǎn)[10]。本研究以絹毛委陵菜為試驗(yàn)材料，研究自然失水脅迫后植物葉片的丙二醛(MDA)含量、游離脯氨酸(Pro)含量和超氧化物歧化酶(SOD)活性等生理指標(biāo)的變化，了解其耐旱生理響應(yīng)狀況，同時(shí)通過(guò)制作石蠟切片，對(duì)不同程度干旱脅迫后的葉片解剖結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察，確定其耐旱能力，旨在一定程度上闡明其耐干旱機(jī)制，為抗性品種的篩選提供理論依據(jù)，也為干旱地區(qū)的城市綠化提供更多的植物材料。

1 材料與方法

1.1試驗(yàn)材料 研究對(duì)象為絹毛委陵菜1齡幼苗，所用幼苗采用當(dāng)年生走莖進(jìn)行繁殖，依據(jù)走莖的長(zhǎng)勢(shì)、株高分批栽培，于2010年6月從黑龍江省植物園移至東北林業(yè)大學(xué)苗圃中進(jìn)行培育和繁殖。

1.2試驗(yàn)處理 2011年6月選取生長(zhǎng)一致、發(fā)育正常的植株，用長(zhǎng)35 cm、寬20 cm、高12 cm的盆對(duì)其進(jìn)行自然失水脅迫的盆栽試驗(yàn)，栽培基質(zhì)為土∶草炭=3∶1。采用連續(xù)控水的方法，試驗(yàn)前對(duì)植株進(jìn)行正常的管理，給予充足的水分，保證植株的正常生長(zhǎng)。干旱脅迫試驗(yàn)設(shè)對(duì)照組和處理組，兩組植株的盆數(shù)分別為3和12盆，分成3小組，每小組為對(duì)照組1盆、處理組4盆，試驗(yàn)重復(fù)3次，從3小組各取樣一次。對(duì)照組每天正常澆水，通過(guò)稱重法澆水，使土壤含水量始終保持在35%～40%；處理組連續(xù)停水21 d，每3 d取樣一次，測(cè)定各項(xiàng)生理指標(biāo)；葉片解剖結(jié)構(gòu)觀察從處理組脅迫的第6天(土壤含水量25%～27%，輕度干旱脅迫)、第9天(土壤含水量15%～17%，中度干旱脅迫)、第18天(土壤含水量5%～7%，重度干旱脅迫)取樣制作石蠟切片，每次取樣均重復(fù)3次。

1.3試驗(yàn)方法

1.3.1植物生理指標(biāo)測(cè)定方法 葉綠素含量采用乙醇浸提法測(cè)定，丙二醛含量采用硫代巴比妥酸顯色法測(cè)定，游離脯氨酸含量采用磺基水楊酸顯色法測(cè)定，超氧化物歧化酶含量采用氮藍(lán)四唑法測(cè)定[11]。

1.3.2石蠟切片的制備方法 取對(duì)照組和處理組相同部位、大小一致的葉片，取葉片中心部位長(zhǎng)0.5 cm、寬0.3 cm的樣塊。采樣后立刻用FAA固定液固定24 h以上，參照李正理[12]的石蠟切片法，在濃度遞增的酒精中脫水，用二甲苯透明，之后浸蠟、包埋、切片、粘片、脫蠟、染色、封片。試驗(yàn)采用Leica石蠟切片機(jī)制片，樣片使用顯微鏡(Leica DM 2500)進(jìn)行觀察，所得數(shù)據(jù)為不同樣片上30個(gè)視野的平均值。

1.4數(shù)據(jù)處理 測(cè)定的數(shù)據(jù)采用Excel軟件制表，用SAS 17.0軟件進(jìn)行相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1干旱脅迫對(duì)絹毛委陵菜葉片解剖結(jié)構(gòu)特征的影響 絹毛委陵菜葉片的解剖結(jié)構(gòu)包括上下表皮、柵欄組織、海綿組織等(圖1)。上下表皮均為單層細(xì)胞，細(xì)胞呈長(zhǎng)卵形、近圓形或近長(zhǎng)方形等不規(guī)則形狀，細(xì)胞彼此排列緊密，沒(méi)有細(xì)胞間隙。上表皮細(xì)胞體積大于下表皮的，近上表皮的一層排列整齊且緊密的柱狀細(xì)胞為柵欄組織，少數(shù)有兩層，柵欄組織與下表皮之間排列著多層散亂不規(guī)則且細(xì)胞間隙較大的部分為海綿組織。

選擇上表皮細(xì)胞厚度、下表皮細(xì)胞厚度、柵欄組織厚度、海綿組織厚度、柵欄組織同海綿組織的比值5項(xiàng)指標(biāo)來(lái)觀察和分析葉片解剖結(jié)構(gòu)受干旱脅迫后的變化。隨著干旱脅迫程度的加重葉片厚度出現(xiàn)顯著差異(P<0.05)，并呈逐漸減小的趨勢(shì)；不同脅迫后上表皮厚度差異不顯著，但處理組均顯著小于對(duì)照組，且隨脅迫加重厚度逐漸減??；重度脅迫時(shí)下表皮厚度顯著小于輕度與中度脅迫，中度脅迫時(shí)小于輕度脅迫但差異不顯著；柵欄組織和海綿組織的厚度均隨脅迫程度加重而減小，除輕度和中度脅迫柵欄組織厚度差異不顯著外其他均差異顯著；受到干旱脅迫后處理組葉片的柵欄組織同海綿組織的比值均大于對(duì)照組，但不同脅迫程度間差異不顯著，大小變化為中度脅迫>重度脅迫>輕度脅迫(表1、圖1)。

圖1 干旱脅迫對(duì)葉片解剖結(jié)構(gòu)的影響Fig.1 Effects of drought stress on anatomical structure of leaves

表1 不同干旱脅迫條件下絹毛委陵菜葉片解剖結(jié)構(gòu)變化Table 1 Anatomical structures of Potentilla sericea leaves under drought stress

2.2干旱脅迫對(duì)絹毛委陵菜葉綠素含量的影響 干旱脅迫下，絹毛委陵菜葉綠素含量隨著干旱脅迫的加重持續(xù)下降。脅迫前9 d葉綠素含量下降幅度較大，脅迫第9天時(shí)葉綠素含量明顯低于脅迫初期，降幅達(dá)27.32%，之后下降幅度有所減緩，脅迫第15天同第9天相比下降10.49%，但從脅迫第15天開(kāi)始葉綠素含量下降幅度又開(kāi)始小幅變大，脅迫第21天較第15天下降幅度達(dá)16.86%。對(duì)照組葉綠素含量較穩(wěn)定，變化范圍在5.47～6.22 mg·g-1，且對(duì)照組含量均高于脅迫組(圖2)。

2.3干旱脅迫對(duì)絹毛委陵菜丙二醛含量的影響 隨著干旱脅迫程度的加重，MDA的含量逐漸增加。脅迫到第6天時(shí)MDA含量沒(méi)有明顯變化，但當(dāng)脅迫達(dá)到第9天時(shí)MDA的含量開(kāi)始明顯升高，之后變化趨于平緩，沒(méi)有大幅度的升降。對(duì)照組MDA含量在整個(gè)試驗(yàn)期間變化較平穩(wěn)，沒(méi)有明顯的升降，但均低于脅迫組(圖3)。

2.4干旱脅迫對(duì)絹毛委陵菜游離脯氨酸含量的影響 當(dāng)植株受到干旱脅迫后Pro含量總體呈上升的趨勢(shì)。在干旱脅迫前9 d Pro含量沒(méi)有明顯的變化，但從脅迫第9天開(kāi)始直到第18天Pro含量急劇的上升，在第18天時(shí)Pro含量達(dá)到最大值，之后開(kāi)始下降，但脅迫第21天時(shí)Pro含量仍顯著大于脅迫初期。對(duì)照組Pro含量變化不大(圖4)。

圖2 自然失水脅迫對(duì)絹毛委陵菜葉片葉綠素含量的影響Fig.2 Effects of drought stress on chlorophyll content of Potentilla sericea leaves

2.5干旱脅迫對(duì)絹毛委陵菜超氧化物歧化酶活性的影響 在整個(gè)脅迫期間，SOD活性基本呈先上升后下降的趨勢(shì)，脅迫前15 d SOD活性基本隨脅迫天數(shù)的增加而增加，在脅迫第15天時(shí)SOD活性達(dá)到最大，隨后開(kāi)始下降。對(duì)照組SOD活性變化范圍不大，走勢(shì)較穩(wěn)定，脅迫組SOD活性基本上都高于對(duì)照組(圖5)。

圖3 自然失水脅迫對(duì)絹毛委陵菜葉片MDA含量的影響Fig.3 Effects of drought stress on MDA content ofPotentilla sericea leaves

圖4 自然失水脅迫對(duì)絹毛委陵菜葉片Pro含量的影響Fig.4 Effects of drought stress on Pro content of Potentilla sericea leaves

圖5 自然失水脅迫對(duì)絹毛委陵菜葉片SOD活性的影響Fig.5 Effects of drought stress on SOD activity of Potentilla sericea leaves

3 討論

葉片是植物體暴露在環(huán)境中面積最大的器官，在復(fù)雜的外界環(huán)境中反應(yīng)最為敏感，最容易因適應(yīng)環(huán)境而改變它的形態(tài)和結(jié)構(gòu)[13-15]。植物的水分代謝一旦失去平衡，就會(huì)打亂植物體的正常生理活動(dòng)，嚴(yán)重時(shí)能使植物體死亡[16]。

植株受到不同程度干旱脅迫后葉片解剖結(jié)構(gòu)會(huì)產(chǎn)生相應(yīng)的變化。隨著干旱脅迫程度的加重，除柵欄組織與海綿組織厚度比外，其他幾項(xiàng)指標(biāo)均逐漸減小，但有的呈顯著性差異，有的差異不顯著，表明干旱脅迫的加劇在葉片解剖結(jié)構(gòu)上主要表現(xiàn)為細(xì)胞逐漸變小，細(xì)胞間隙變小，排列逐漸緊密，葉片解剖結(jié)構(gòu)各部分均逐漸變小。干旱脅迫下，葉片變薄、柵欄組織與海綿組織厚度比值增大，是為了以最大限度減少植物對(duì)輻射的直接接觸和水分的蒸騰，保存有限水分并充分加以利用，是典型的節(jié)約型適應(yīng)[17]。絹毛委陵菜受到脅迫后柵欄組織與海綿組織厚度比值大于對(duì)照組，表明絹毛委陵菜具有較強(qiáng)的抗旱能力。

葉綠素的合成與水分關(guān)系密切，植物受到逆境脅迫時(shí)葉綠素結(jié)構(gòu)會(huì)變得不穩(wěn)定，極易發(fā)生變化。一般認(rèn)為，干旱脅迫可導(dǎo)致植物葉片缺水影響葉綠素的生物合成，而且促進(jìn)已形成的葉綠素的降解，造成葉片發(fā)黃[18]。聶華堂[19]認(rèn)為，抗旱性越強(qiáng)的樹(shù)種，隨著干旱脅迫程度的加深，葉綠素含量的變化幅度越小，這同本研究結(jié)果基本一致。隨著脅迫天數(shù)的增加葉綠素含量下降幅度逐漸變小，在脅迫后期下降幅度雖然又有所升高，但變化幅度仍小于脅迫初期，說(shuō)明絹毛委陵菜具備一定的抗旱性。

丙二醛是細(xì)胞膜質(zhì)過(guò)氧化作用的主要產(chǎn)物之一，其含量可以表示膜質(zhì)過(guò)氧化作用的程度[20]。因此，丙二醛的含量可以反映植物抗干旱脅迫的能力，了解植物膜結(jié)構(gòu)受傷害的程度。本試驗(yàn)中，隨著干旱脅迫程度的加重丙二醛含量有所增加，說(shuō)明干旱加速了膜質(zhì)過(guò)氧化作用，但丙二醛含量并非持續(xù)增加，當(dāng)脅迫到第9天丙二醛含量開(kāi)始趨于平穩(wěn)，說(shuō)明絹毛委陵菜有一定的抗旱能力。

游離脯氨酸是細(xì)胞質(zhì)中重要的滲透劑和防脫水劑[21]。在正常情況下，植物體內(nèi)游離脯氨酸含量很低；在干旱脅迫下，它的增加有助于細(xì)胞或組織持水，減少脫水，維持各器官較強(qiáng)的滲透，從而提高植株對(duì)干旱的適應(yīng)能力[22]。本試驗(yàn)中，脅迫第9天時(shí)游離脯氨酸含量急劇升高，之后持續(xù)增加，在脅迫第18天時(shí)含量達(dá)到最大值，直到脅迫第21天時(shí)含量有所下降。游離脯氨酸含量的增加能夠減輕干旱脅迫對(duì)植株造成的傷害，植物體內(nèi)游離脯氨酸含量積累持續(xù)時(shí)間的長(zhǎng)短同積累量的多少也是植物抵抗干旱脅迫能力的體現(xiàn)。絹毛委陵菜受到干旱脅迫后游離脯氨酸含量達(dá)到如此大量的積累，且持續(xù)時(shí)間較長(zhǎng)，說(shuō)明絹毛委陵菜抵抗干旱脅迫的能力較強(qiáng)。

超氧化物歧化酶是植物體內(nèi)清除活性氧的保護(hù)酶類，能催化超氧自由基的歧化作用，形成O2和H2O2，消除超氧陰離子自由基，減輕膜脂過(guò)氧化作用，維持活性氧代謝的平衡，從而對(duì)機(jī)體起保護(hù)作用[23]。植物體內(nèi)超氧化物歧化酶活性的強(qiáng)弱往往與植物抵抗逆境的能力有關(guān)，它在抗氧化酶類中處在核心地位。本試驗(yàn)中，超氧化物歧化酶活性的變化基本表現(xiàn)為先升高后下降的趨勢(shì)，脅迫15 d時(shí)是超氧化物歧化酶活性變化趨勢(shì)的轉(zhuǎn)折點(diǎn)，脅迫15 d后超氧化物歧化酶的活性開(kāi)始下降?；钚陨仙侵参飳?duì)于遭受干旱脅迫而產(chǎn)生的超氧自由基做出的保護(hù)性應(yīng)激反應(yīng)，之后活性的下降可能是植物在重度干旱脅迫下受到較嚴(yán)重的傷害，酶保護(hù)系統(tǒng)也遭到了一定的破壞，從而導(dǎo)致超氧化物歧化酶活性下降，但下降后超氧化物歧化酶活性仍高于脅迫初期，并沒(méi)有失去活性，說(shuō)明絹毛委陵菜具有較強(qiáng)的抗旱適應(yīng)能力。

綜上所述，通過(guò)對(duì)植物葉片解剖結(jié)構(gòu)和幾個(gè)較重要生理指標(biāo)的研究發(fā)現(xiàn)，絹毛委陵菜受到干旱脅迫后植物葉片解剖結(jié)構(gòu)同體內(nèi)的生理生化活動(dòng)都受到了影響，發(fā)生了相應(yīng)的變化。依據(jù)植物在這兩個(gè)方面的變化情況以及通過(guò)以上對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的分析表明絹毛委陵菜對(duì)于干旱脅迫具有一定的抵抗能力，能夠適應(yīng)較干旱的環(huán)境條件。

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