左之才，崔恒敏，甘 夢，彭 西，鄧俊良

（1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，環(huán)境公害與動物疾病四川省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 雅安 625014；2.動物疫病與人類健康四川省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川農(nóng)業(yè)大學(xué)，四川雅安625014）

紅細(xì)胞不僅具有黏附、殺傷抗原的作用[1]，而且參與機(jī)體免疫，對機(jī)體免疫性疾病尤其是免疫復(fù)合物的清除發(fā)揮著重要作用[2]。1981年，Siegel等設(shè)計(jì)出檢測紅細(xì)胞免疫黏附受體活性的“標(biāo)準(zhǔn)的紅細(xì)胞免疫黏附試驗(yàn)”[3]。1982年，郭峰等在Siegel標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，建立了紅細(xì)胞C3b受體（C3bR）花環(huán)（Erythrocyte C3b receptor rosette，E-C3bRR）試驗(yàn)和紅細(xì)胞免疫復(fù)合物（IC）花環(huán)（Ecthrocyte immune complex rosette，E-ICR）試驗(yàn)，分別測定紅細(xì)胞C3b受體活性和紅細(xì)胞膜上吸附免疫復(fù)合物的情況[4]。近年來，國外紅細(xì)胞免疫研究不多[5]；而在國內(nèi)，紅細(xì)胞免疫功能在疾病發(fā)生、發(fā)展中的作用則受到普遍關(guān)注，動物疾病方面的研究報道則主要集中在家禽[6-11]，家畜研究較少[12-15]。本研究通過人工感染豬放線桿菌（Ⅰ型）病例模型研究細(xì)菌感染對豬紅細(xì)胞免疫功能的影響，為進(jìn)一步研究感染與機(jī)體天然免疫關(guān)系及感染性疾病的防治提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌種

豬APP（血清I型），由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)生物技術(shù)中心提供。經(jīng)胰胨大豆瓊脂培養(yǎng)基純化、無菌檢查及染色特性觀察后，接種胰胨大豆肉湯培養(yǎng)基，37℃恒溫培養(yǎng)6～8 h，用TSA瓊脂平版培養(yǎng)計(jì)數(shù)法計(jì)算每毫升含有的菌落形成單位（cfu·mL-1），在此條件下菌液生長濁度可達(dá)108～109cfu·mL-1。攻毒前用無菌生理鹽水稀釋成3.5～4×107cfu·mL-1。

1.2 飼糧組成與飼養(yǎng)管理

試驗(yàn)飼糧參照NRC（1998）推薦和NY-T 65-2004豬飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)10～20 kg仔豬的營養(yǎng)需要配制。豬自由飲水，飼喂無抗生素添加劑的常規(guī)飼料，并在試驗(yàn)前飼養(yǎng)l周，使豬適應(yīng)環(huán)境。

1.3 動物分組及處理

選取相同日齡、體重相近（15～20 kg）、經(jīng)臨床及血清學(xué)檢查排除APP感染，處于健康狀態(tài)的DLY（杜洛克×長白×約克夏）仔豬24頭；按♂、♀，來源及體重兩兩配對，隨機(jī)分為兩組，接種無菌生理鹽水（對照組，CG）和APP稀釋液（試驗(yàn)組，TG）。采用鼻腔噴霧法，按每kg體重0.25 mL，TG仔豬一次性接種上述APP稀釋液；CG采用無菌生理鹽水。

1.4 樣本采集與血常規(guī)指標(biāo)檢測

于接種后48 h每組隨機(jī)選擇8頭仔豬，無菌采集前腔靜脈血15 mL，1 mL枸櫞酸納抗凝（放于4℃冰箱保存作紅細(xì)胞免疫試驗(yàn)），2 mL EDTA-K2抗凝（檢測血常規(guī)0.5 mL），剩余血分離血清，備用（制備致敏酵母多糖等）。

1.5 血液常規(guī)檢測

BC-2000血細(xì)胞自動分析儀檢測白細(xì)胞總數(shù)（WBC）、淋巴細(xì)胞數(shù)（LYM）、中間細(xì)胞計(jì)數(shù)（MID）、中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)（GRA）、紅細(xì)胞總數(shù)（RBC）、平均紅細(xì)胞體積（MCV）、血紅蛋白（HGB）、平均紅細(xì)胞血紅蛋白（MCH）、平均血紅蛋白濃度（MCHC）等。

1.6 紅細(xì)胞免疫功能測定

1.6.1 紅細(xì)胞懸液的制備

將CG、TG紅細(xì)胞（枸櫞酸納抗凝）懸液（靜脈血）經(jīng)生理鹽水洗滌離心3次（每2000 r·min-1，3～5 min），按紅細(xì)胞計(jì)數(shù)方法配成1.25×107個·mL-1使用液備用。

1.6.2 致敏酵母多糖的制備

凍干補(bǔ)體未致敏酵母多糖（購于上海長海醫(yī)院免疫室）。用EP管取酵母多糖溶液5 mL，離心2000 r·min-1，3～5 min，棄一半上清液，加入健康豬血清2.5 mL混勻，37℃作用20 min，即為致敏酵母多糖。

1.6.3 紅細(xì)胞C3b受體花環(huán)試驗(yàn)

取致敏酵母多糖及紅細(xì)胞懸液各50 μL，混勻，37℃水浴30 min；再加入0.25%的戊二醛25 μL，混勻，固定5 min；滴加25 μL左右樣品于玻片上推片，立即烤干，滴加瑞士染液30 s～1 min，滴加緩沖液5 min，用清水清洗后，用濾紙吸干水，烤干，滴加香柏油后顯微鏡計(jì)數(shù)。一個紅細(xì)胞結(jié)合2個或2個以上酵母菌為一朵C3b受體花環(huán)（E-C3bRR），計(jì)數(shù)200個紅細(xì)胞，求出花環(huán)率。

1.6.4 紅細(xì)胞免疫復(fù)合物花環(huán)試驗(yàn)

除使用未致敏酵母多糖外，其余步驟均與紅細(xì)胞C3b受體花環(huán)試驗(yàn)相同。一個紅細(xì)胞結(jié)合2個或2個以上酵母菌為一朵IC花環(huán)（E-ICR），計(jì)數(shù)200個紅細(xì)胞，求出花環(huán)率。

1.7 數(shù)據(jù)處理方法

采用SPSS統(tǒng)計(jì)處理軟件進(jìn)行方差分析，比較組間差異顯著性?；ōh(huán)形成百分率(%)=(紅細(xì)胞花環(huán)數(shù)/200)×100%。試驗(yàn)數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±S）表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 感染APP豬血液常規(guī)指標(biāo)的變化

結(jié)果見表1。

表1 感染APP豬血液常規(guī)指標(biāo)的變化Table 1 Influence of infecion on the blood index of piglets with APP

由表1可知，感染APP后，豬血常規(guī)檢查指標(biāo)中除白細(xì)胞變化尤其顯著外，其他指標(biāo)變化均不顯著。TG豬血液中的白細(xì)胞總數(shù)計(jì)數(shù)（WBC）、中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)（GRA）、中間細(xì)胞計(jì)數(shù)（MID）均較CG極顯著升高（P＜0.01），但淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)（LYM）卻較CG組極顯著降低（P＜0.01）。白細(xì)胞分類計(jì)數(shù)：CG的GRA%、LYM%、MID%分別為27.1%、72.3%、0.6%，TG分別為79.2%、19.1%、2.14%；感染后傳染性膜肺炎放線桿菌I型36 h血液中的GRA%、MID%值極顯著增高（P＜0.01），LYM%值極顯著降低（P＜0.01），呈現(xiàn) GRA%與LYM%倒置。比較RBC，TG較CG略有增高，但其HGB、MCH及MCHC卻較CG略有減少，但差異均不顯著（P＞0.05）。

2.2 感染APP豬紅細(xì)胞免疫功能的變化

C3b受體花環(huán)和IC花環(huán)見圖1、圖2。由表2可見，感染放線桿菌豬的E-C3bRR率和E-ICR率（X±SE）分別為15.00±3.63和12.5±2.45；CG組分別為13.75±1.58和13.75±1.58；TG的E-C3bRR率極顯著高于CG組（P＜0.01），E-ICR率低于CG組，差異不顯著（P＞0.05）。

圖1 C3b受體花環(huán)Fig.1 E-C3bRR(×1000)

圖2 IC花環(huán)Fig.2 E-ICR(×1000)

表2 感染APP豬的E-C3bRR率和E-ICR率Table 2 Influence of infecion on E-C3bRR rate and E-ICR rate of piglets with APP （%）

3 討論與結(jié)論

3.1 感染放線桿菌豬的防御能力增強(qiáng)，但其免疫力下降

白細(xì)胞的主要功能是依靠其游走性、趨化性和吞噬作用等特性，來抵御和消滅入侵的病原微生物，實(shí)現(xiàn)對機(jī)體的保護(hù)作用[16]。一系列研究表明，機(jī)體發(fā)生急性感染時，白細(xì)胞總數(shù)往往升高[17-18]。本試驗(yàn)中豬感染放線桿菌I型后，白細(xì)胞總數(shù)、中性粒細(xì)胞（%）及中間細(xì)胞(%)也極顯著升高，淋巴細(xì)胞(%)極顯著降低，這與機(jī)體發(fā)揮其調(diào)節(jié)機(jī)能有關(guān)。感染后機(jī)體主要通過提高豬血液中性粒細(xì)胞及中間細(xì)胞（單核細(xì)胞等）的游走性、趨化性和吞噬（病原菌）功能，增強(qiáng)機(jī)體的整體防御機(jī)能實(shí)現(xiàn)對機(jī)體的保護(hù)作用；而不是通過參與機(jī)體免疫過程的淋巴細(xì)胞起主要作用，機(jī)體免疫機(jī)能下降。

正常動物每天有一定量的紅細(xì)胞衰老，同時也有相應(yīng)數(shù)量的紅細(xì)胞和血紅蛋白生成以維持動態(tài)平衡，使血液循環(huán)中的紅細(xì)胞和血紅蛋白數(shù)量保持相對恒定[19]。感染放線桿菌I型后，機(jī)體的RBC相對增高，但其HGB、MCH、MCHC卻較略有降低，這可能與機(jī)體有一定程度的脫水及發(fā)病后食欲下降，機(jī)體同化作用減弱，合成血紅蛋白減少有關(guān)。

3.2 感染放線桿菌后，豬的紅細(xì)胞免疫功能及清除循環(huán)血液中免疫復(fù)合物的作用增強(qiáng)

紅細(xì)胞是血液中數(shù)目最多的一類細(xì)胞，其主要功能是運(yùn)送氧氣和二氧化碳，保障機(jī)體組織和器官的正常供氧，其次是免疫功能[20]。紅細(xì)胞免疫功能包括結(jié)合和運(yùn)送循環(huán)免疫復(fù)合物至吞噬細(xì)胞進(jìn)行清除，調(diào)控和增強(qiáng)吞噬細(xì)胞的吞噬功能，識別存儲和提呈抗原，調(diào)控淋巴細(xì)胞應(yīng)答及細(xì)胞因子的釋放等，而最主要的免疫功能是清除循環(huán)免疫復(fù)合物[20]。感染放線桿菌豬的C3bRR率極顯著升高，表明感染后紅細(xì)胞的CR1被激活，紅細(xì)胞免疫功能增強(qiáng)；ICR率降低，這與感染放線桿菌豬通過紅細(xì)胞從循環(huán)中清除微生物、免疫復(fù)合物的作用增強(qiáng)，附著在紅細(xì)胞表面的免疫復(fù)合物減少有關(guān)。而感染放線桿菌豬RBC相對增加，而HGB、MCH、MCHC均有下降（見表1），是否導(dǎo)致CR1的暴露與激活，最終引起C3bRR率極顯著升高有關(guān)，有待進(jìn)一步研究。

3.3 關(guān)于豬感染放線桿菌后，紅細(xì)胞免疫功能增強(qiáng)的機(jī)理探討

紅細(xì)胞免疫是機(jī)體內(nèi)重要的天然免疫組成部分，對機(jī)體免疫性疾病尤其是免疫復(fù)合物的清除發(fā)揮著重要作用[2]。紅細(xì)胞與細(xì)菌、病毒等微生物免疫黏附后，不僅可通過過氧化物酶對它們產(chǎn)生直接的殺傷作用，而且還可以促進(jìn)吞噬細(xì)胞對它們的吞噬作用(可增強(qiáng)4～6倍)[21-23]。

正常情況下，大多數(shù)IC進(jìn)入體內(nèi)后會很快與紅細(xì)胞結(jié)合，并迅速被運(yùn)送到肝、脾等組織加以清除，從而減少IC在組織敏感部位沉積致病。紅細(xì)胞內(nèi)含有高濃度過氧化氫酶（CAT）及超氧化物歧化酶（SOD），能清除吞噬過程中產(chǎn)生的氧化代謝產(chǎn)物，從而促進(jìn)吞噬作用[24]。研究指出，紅細(xì)胞和血清中GSH-Px活力的下降會導(dǎo)致IC清除障礙[25]。此外，肝、脾內(nèi)過氧化物酶活性的改變同樣會影響巨噬細(xì)胞功能的正常發(fā)揮，使其不能將IC有效清除[8]。感染豬的ICR率降低，可能與感染后機(jī)體調(diào)節(jié)機(jī)能增強(qiáng)，血清的GSH-Px含量及脾臟的SOD含量顯著升高、CAT含量升高（另見報道）加速了IC的清除有關(guān)。

綜上可見，感染放線桿菌豬紅細(xì)胞的CR1被激活，紅細(xì)胞免疫功能增強(qiáng)，加速了循環(huán)免疫復(fù)合物的清除。因此，感染放線桿菌豬的C3bRR率極顯著升高，ICR下降。

感染放線桿菌后，豬的紅細(xì)胞免疫功能及清除循環(huán)血液中免疫復(fù)合物的作用增強(qiáng)；機(jī)體主要通過中性粒細(xì)胞及中間細(xì)胞（單核細(xì)胞等）增強(qiáng)機(jī)體的整體防御機(jī)能實(shí)現(xiàn)對機(jī)體的保護(hù)作用。

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