王 維，高繼國(guó)，朱 莉，彭 琦，束長(zhǎng)龍，張 杰，黃大昉，宋福平

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，哈爾濱 150030；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，植物病蟲害生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100193；3.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所，北京 100081）

γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）是一種四碳非蛋白質(zhì)類氨基酸，廣泛存在于原核生物和真核生物中，在不同的生物體中具有不同的生理功能。GABA代謝是通過γ-氨基丁酸旁路（GABA shunt）來完成的[1]。關(guān)于GABA shunt相關(guān)研究在動(dòng)植物中一直非?；钴S，而在微生物中研究較少，尤其是對(duì)芽胞桿菌中GABA shunt研究。研究發(fā)現(xiàn)，在細(xì)菌中參與GABA shunt的基因有形成基因簇的特點(diǎn)，在大腸桿菌中參與GABA shunt的基因組成csiD-ygaF-gabDTP基因簇，受σs因子調(diào)控，而σs因子又受pH和氮碳源營(yíng)養(yǎng)等環(huán)境壓力影響[2]。而在枯草芽胞桿菌（Bacillus subtilis）中，編碼γ-氨基丁酸轉(zhuǎn)氨酶的gabT基因與編碼琥珀酸半醛脫氫酶的gabD基因組成一個(gè)操縱子，同時(shí)發(fā)現(xiàn)一個(gè)編碼轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白GabR的反向基因gabR[3]。Bt中的gab基因簇有兩個(gè)轉(zhuǎn)錄單元，其中g(shù)abT基因單獨(dú)轉(zhuǎn)錄，而gabR和gabD基因組成一個(gè)轉(zhuǎn)錄單元，它們都受到σ54因子的調(diào)控，而gabR基因編碼的GabR蛋白是依賴于σ54因子的轉(zhuǎn)錄激活因子，并也正調(diào)控gab基因簇[4]。

在微生物中，對(duì)GABA旁路的功能研究相對(duì)較少。在啤酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）中，GABA對(duì)細(xì)胞中氧化還原反應(yīng)的影響起緩沖作用[5]。在芽胞桿菌中，GABA shunt可能與芽胞萌發(fā)有一定關(guān)系，一些芽胞桿菌在芽胞萌發(fā)過程中必須有GABA參加，對(duì)GABA有高度的特異性[6]。GABA還可以操控根癌農(nóng)桿菌群體信號(hào)級(jí)別，GABA是作為一種分子信號(hào)介導(dǎo)根癌農(nóng)桿菌與植物愈傷組織之間的聯(lián)系[7-8]。

蘇云金芽胞桿菌（Bacillus thuringiensis， Bt）以其安全、高效的殺蟲特點(diǎn)成為應(yīng)用最為廣泛的殺蟲微生物，并被應(yīng)用于重要的轉(zhuǎn)基因作物，蘇云金芽胞桿菌與其他芽胞桿菌最顯著的差別在于其能在形成芽胞的同時(shí)產(chǎn)生具有殺蟲活性的晶體蛋白（δ-內(nèi)毒素）[9-12]。研究發(fā)現(xiàn)，在蘇云金芽胞桿菌與伴胞晶體合成的過程中，γ-氨基丁酸代謝途徑相關(guān)酶活性有所變化，推測(cè)該代謝途徑可能參與芽胞和晶體形成[12]，但之后并未見相關(guān)研究報(bào)道。

本研究利用gab基因簇突變體分析GABA shunt阻斷對(duì)菌株生長(zhǎng)、產(chǎn)芽胞能力和晶體蛋白產(chǎn)量影響。通過關(guān)鍵基因缺失阻斷代謝途徑來研究代謝與蘇云金芽胞桿菌晶體形成的關(guān)系，為研究該領(lǐng)域提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和培養(yǎng)基

所用菌株見表1，蘇云金芽胞桿菌培養(yǎng)采用芽胞形成培養(yǎng)基（Schaeffer's sporulation medium，SSM：營(yíng)養(yǎng)肉湯8 g,12%MgSO410 mL，10%KCl 10 mL，1 mol·L-1NaOH 1 mL，定容至997 mL，1×105Pa 滅菌30 min,補(bǔ)加過濾除菌的1 mmol·L-1FeSO41 mL，1mol·L-1Ca（NO3）21mL，10mmol·L-1MnCl21mL）[14]和Luria-Bertani（LB）培養(yǎng)基。

表1 菌株來源及特性Table 1 Characterization and source of strains

1.2 細(xì)菌的培養(yǎng)條件

蘇云金芽胞桿菌在30℃培養(yǎng)，搖床轉(zhuǎn)速為220 r·min-1。

1.3 不同營(yíng)養(yǎng)條件下生長(zhǎng)曲線的測(cè)定

將出發(fā)菌株HD-73和突變菌株HD（ΔgabT）、HD（ΔgabR）和HD（ΔgabD）按1%分別接種于營(yíng)養(yǎng)相對(duì)貧瘠的SSM培養(yǎng)基、加入2%GABA的SSM培養(yǎng)基和營(yíng)養(yǎng)相對(duì)豐富的LB培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)，搖床轉(zhuǎn)速為220 r·min-1，每隔1 h取樣，測(cè)OD600值，取菌體在兩種培養(yǎng)基中的OD600最大值，重復(fù)3次。

1.4 顯微鏡觀察

利用光學(xué)顯微鏡觀察Bt菌株產(chǎn)芽胞和晶體形成的能力。將胞晶混合液滴于載玻片上，涂抹均勻，烘干固定，石炭酸復(fù)紅染液染色3 min，清水沖洗，100×油鏡進(jìn)行鏡檢，石炭酸復(fù)紅染液配制方法參照文獻(xiàn)[16]。

1.5 活芽胞計(jì)數(shù)分析

取已完全釋放芽胞的Bt培養(yǎng)液進(jìn)行適度稀釋，80℃熱處理15 min后涂營(yíng)養(yǎng)平板，24 h后記數(shù)平板上長(zhǎng)出的單克隆，即為活芽胞數(shù)。

1.6 菌株表達(dá)殺蟲晶體蛋白能力分析

將各菌株分別接種于SSM液體培養(yǎng)基和LB液體培養(yǎng)基中220 r·min-1、30℃培養(yǎng)，SSM中培養(yǎng)到T12和T24取樣（T0代表生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期終止的時(shí)間點(diǎn)，Tn為此時(shí)間點(diǎn)后n小時(shí)），LB中培養(yǎng)到T20和T40取樣，12000 r·min-1離心1 min，取適量50 mmol·L-1Na2CO3重懸至OD600值一致，取相同量菌液，經(jīng)破碎后，利用SDS-PAGE檢測(cè)菌株產(chǎn)生的殺蟲晶體蛋白，方法參照文獻(xiàn)[17]。

2 結(jié)果與分析

2.1 gab基因簇基因缺失對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響

生長(zhǎng)曲線的結(jié)果表明，SSM液體培養(yǎng)基培養(yǎng)至12 h與LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)至18 h，HD-73與各突變菌株的OD600值相差不大。在SSM液體培養(yǎng)基中，出發(fā)菌株和各突變株在4 h左右結(jié)束對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，進(jìn)入平穩(wěn)期；SSM液體培養(yǎng)基中加入2%GABA時(shí)，各菌株的生長(zhǎng)情況也未發(fā)現(xiàn)受到影響（見圖1-A、B）。LB液體培養(yǎng)基中，出發(fā)菌株和各突變株6 h左右結(jié)束對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，進(jìn)入平穩(wěn)期（見圖1-C）。說明gab基因簇的缺失沒有影響菌株生長(zhǎng)。

2.2 gab基因簇基因缺失對(duì)菌株產(chǎn)生活芽胞數(shù)的影響

將HD-73和各突變株在SSM液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至芽胞完全釋放，各取1 mL菌液進(jìn)行活芽胞計(jì)數(shù)（見圖2）。

圖2 出發(fā)菌株和突變菌株的活芽胞計(jì)數(shù)分析Fig.2 Numeration of live spore in wild-type and mutant strains

出發(fā)菌株HD-73每毫升菌液可產(chǎn)生1.97×107個(gè)活芽胞，而HD（ΔgabT）每毫升僅產(chǎn)生4.9×106個(gè)活芽胞，HD（ΔgabD）每毫升僅產(chǎn)生4.6×106個(gè)活芽胞。這說明gabT基因和gabD的缺失，導(dǎo)致菌體芽胞產(chǎn)量下降。HD（ΔgabR）每毫升產(chǎn)生1.2×107個(gè)活芽胞，芽胞產(chǎn)量比HD-73有所下降，比HD（ΔgabT）和HD（ΔgabD）產(chǎn)量有所提高。

2.3 gab基因簇基因缺失對(duì)晶體蛋白產(chǎn)量的影響

將HD-73和各突變株分別在SSM和LB液體培養(yǎng)基中30℃，220 r·min-1培養(yǎng)，每2 h取樣，在光學(xué)顯微鏡下觀察芽胞裂解情況。SSM液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)到T24時(shí)芽胞完全裂解，分別在T12和T24取樣，LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)到T40時(shí)芽胞完全裂解，分別在T20和 T40取樣。

SDS-PAGE結(jié)果表明，無論在SSM液體培養(yǎng)基中還是在營(yíng)養(yǎng)豐富的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，HD-73和突變菌株都可以產(chǎn)生130 ku的晶體蛋白，蛋白表達(dá)量沒有明顯差異（見圖3-A、B）。在SSM液體培養(yǎng)基中加入2%GABA，分別在T12和T24取樣，SDS-PAGE結(jié)果表明，GABA的加入對(duì)各菌株產(chǎn)生晶體蛋白量無顯著影響（見圖3-C、D）。以上結(jié)果表明，GABA代謝旁路的阻斷并沒有顯著影響晶體蛋白產(chǎn)量。

圖3 出發(fā)菌株和突變菌株晶體蛋白SDS-PAGE分析Fig.3 SDS-PAGE analysis for crystal protein of wild-type and mutant strains

3 討論

Aronson等通過酶活分析推測(cè)蘇云金芽胞桿菌GABA shunt與晶體形成有關(guān)[13]。本實(shí)驗(yàn)室前期對(duì)蘇云金芽胞桿菌GABA shunt相關(guān)基因簇的表達(dá)調(diào)控方式進(jìn)行研究，獲得該基因簇的相關(guān)基因突變體HD（ΔgabT）、HD（ΔgabR）和 HD（ΔgabD）。發(fā)現(xiàn) HD（ΔgabT）完全阻斷GABA shunt，而且HD（ΔgabD）并未阻斷該代謝途徑，Bt中有分別依賴于NADP+和NAD+的兩種琥珀酸半醛脫氫酶，其中g(shù)abD所編碼的琥珀酸半醛脫氫酶是依賴于NADP+的[4]，而依賴于NAD+的琥珀酸半醛脫氫酶可以部分互補(bǔ)該代謝途徑。本研究利用三種突變體研究GABA shunt對(duì)晶體蛋白產(chǎn)量的影響。發(fā)現(xiàn)無論是否阻斷該途徑，還是在加入2%GABA情況下，晶體蛋白產(chǎn)量均無明顯差異，首次明確GABA shunt對(duì)蘇云金芽胞桿菌的晶體蛋白產(chǎn)量無影響。

研究表明，Bt的一些代謝途徑參與芽胞形成過程，例如在葡萄糖培養(yǎng)基中，Bt的代謝產(chǎn)物乙酸可以在芽胞形成初期被利用，并且乙酸水合酶活性也顯著提高[18]。Bt中90%脂肪酸存在于芽胞中，脂肪酸代謝途徑對(duì)其芽胞萌發(fā)也有很大影響[18]。以上研究都是從酶學(xué)水平研究代謝途徑與芽胞形成的關(guān)系，而本研究通過分子水平阻斷相關(guān)代謝途徑研究二者的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)Bt突變菌株HD（ΔgabT）、HD（ΔgabR）和HD（ΔgabD）的產(chǎn)芽胞量與出發(fā)菌株相比均有不同程度下降，說明該代謝途徑是芽胞形成過程所必需的。而突變菌株HD（ΔgabR）的芽胞產(chǎn)量雖然下降卻要高于另兩個(gè)突變菌株，由于gabR基因是調(diào)節(jié)基因，它的缺失只是降低而不是喪失gabT和gabD基因表達(dá)。但是GABA shunt如何影響芽胞產(chǎn)生效率需要更深入分析。

4 結(jié)論

a.蘇云金芽胞桿菌GABA shunt阻斷對(duì)菌株生長(zhǎng)沒有造成明顯影響。

b.首次證明GABA shunt對(duì)蘇云金芽胞桿菌晶體蛋白產(chǎn)量無明顯影響。

c.蘇云金芽胞桿菌GABA shunt阻斷降低菌株產(chǎn)芽胞量，并且不同突變菌株之間產(chǎn)芽胞量也有所不同，證明該代謝旁路對(duì)蘇云金芽胞桿菌芽胞產(chǎn)量有影響。

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