林世鋒，王仁剛，任學(xué)良，王東茂，張 拓，黃亞娟

（1.貴州省煙草科學(xué)研究所，貴陽(yáng) 550081；2.北京蛋白質(zhì)組研究中心/蛋白質(zhì)組學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 102206）

低溫、干旱和高鹽等非生物脅迫嚴(yán)重影響植物的生長(zhǎng)發(fā)育和產(chǎn)量。煙草作為一種特殊的葉用經(jīng)濟(jì)作物，不僅注重?zé)熑~的產(chǎn)量，更注重?zé)熑~的品質(zhì)和可用性。煙草和其他作物一樣易受低溫、干旱和高鹽等非生物脅迫的危害，不僅影響其生長(zhǎng)發(fā)育，更嚴(yán)重的是影響其質(zhì)量。

植物在受到低溫、干旱和高鹽等脅迫時(shí)，可以在體內(nèi)積累一些可溶性小分子，如脯氨酸、甘露醇、寡糖等，以增加植物細(xì)胞滲透壓，提高植物組織抵抗脅迫的能力[1-2]。棉子糖家族寡糖（Raffinose family oligosaccharides，RFOs，主要為棉子糖和水蘇糖）是上述可溶性小分子中的一類(lèi)。研究表明，一些體內(nèi)不含RFOs或含量極低的植物，受到低溫、干旱和高鹽等逆境脅迫后RFOs迅速積累，植株抗逆性也隨之增強(qiáng)。肌醇半乳糖苷合成酶（Galactinol synthase，GolS）是植物體內(nèi)合成RFOs的關(guān)鍵酶。目前有一些關(guān)于該酶受逆境脅迫表達(dá)上升的報(bào)道，如低溫處理后辣椒葉片中GolS的mRNA表達(dá)量持續(xù)增加[3]；小果咖啡經(jīng)干旱和高鹽脅迫后體內(nèi)會(huì)積累大量GolS[4]；對(duì)甘藍(lán)型油菜種子進(jìn)行脫水處理，可造成該酶mRNA的積累[5]；在小鹽芥[6]、日本黃連[7]和旋蒴苣苔[8]等植物中也存在類(lèi)似的生理現(xiàn)象。本研究以煙草與辣椒同屬茄科植物，物種間同源基因序列相對(duì)保守為切入點(diǎn)，以辣椒GolS基因cDNA序列為探針，通過(guò)電子克隆法獲得1個(gè)新的煙草GolS基因，并進(jìn)行生物信息學(xué)分析，以期為煙草抗逆相關(guān)研究提供基礎(chǔ)材料。

1 材料與方法

1.1 煙草肌醇半乳糖苷合成酶基因的電子克隆

以辣椒肌醇半乳糖苷合成酶CaGolS基因的全長(zhǎng)cDNA序列（GenBank登陸號(hào)：EF566470）[2]為信息探針，對(duì)GenBank中EST_others數(shù)據(jù)庫(kù)指定物種煙草（Nicotiana tabacum）進(jìn)行BLAST檢索，將檢索到來(lái)自于煙草栽培品種K326的全部EST序列利用DNAMAN 6.0軟件進(jìn)行拼接，形成重疊群（Contig）。然后用此重疊群再次進(jìn)行同源檢索、拼接，重復(fù)以上過(guò)程直至沒(méi)有更多煙草栽培品種K326的重疊EST檢出，最終獲得煙草栽培品種K326肌醇半乳糖苷合成酶cDNA序列片段。再以此片段在GenBank中進(jìn)行Blastx同源搜索，與其他物種肌醇半乳糖苷合成酶同源蛋白進(jìn)行序列比較，進(jìn)而判斷拼接得到的煙草肌醇半乳糖苷合成酶基因cDNA的正確性及其ORF序列的完整性。

1.2 煙草肌醇半乳糖苷合成酶基因的生物信息學(xué)分析

利用NCBI網(wǎng)站（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）提供的ORF finder軟件對(duì)開(kāi)放閱讀框進(jìn)行分析并翻譯成蛋白質(zhì)，通過(guò)BlastP程序進(jìn)行序列相似性分析和氨基酸保守性預(yù)測(cè)；運(yùn)用DNAMAN 6.0軟件進(jìn)行氨基酸序列多重比對(duì)；利用瑞士生物信息研究所網(wǎng)站（http://www.expasy.org/tools/）提供的ProtParam軟件、SignalP軟件、NetNGlyc軟件和NetPhos軟件進(jìn)行蛋白基本特性、信號(hào)肽、糖基化和磷酸化位點(diǎn)分析，通過(guò)SOPMA軟件[9]和WISS-MODEL軟件[10-11]對(duì)蛋白質(zhì)二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 煙草肌醇半乳糖苷合成酶基因的電子克隆結(jié)果

利用已知的辣椒肌醇半乳糖苷合成酶基因的核苷酸序列對(duì)GenBank中煙草EST數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLAST檢索分析，發(fā)現(xiàn)5條相似性高的EST序列來(lái)自煙草品種K326，通過(guò)DNAMAN 6.0軟件將它們進(jìn)行重疊群的裝配后，獲得contig成分及各個(gè)序列的拼接位置，如圖1所示。在組成的contig中，各條EST序列的拼接順序?yàn)椋篍B448354，EB430670，EB432401，EB431033，EB430244。通過(guò)拼接獲得一條長(zhǎng)為1423 bp的一致性序列。ORF finder和Blastx分析結(jié)果表明，獲得一個(gè)煙草GolS基因，命名為NtGolS1。NtGolS1的cDNA全長(zhǎng)1423 bp，包含一個(gè)完整的開(kāi)放閱讀框架，起始密碼子位子在102位，終止密碼子位子在1133位，共編碼343個(gè)氨基酸（見(jiàn)圖2）。

圖1 煙草GolS1基因cDNA序列的拼接Fig.1 Joint map of Nicotiana tabacum GolS1 cDNA sequence

圖2 煙草GolS1的cDNA序列及推導(dǎo)的氨基酸序列Fig.2 Nucleotide acid sequence and deduced amino acid sequence of Nicotiana tabacum GolS1

2.2 NtGolS1蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)分析

利用ProtParam軟件對(duì)NtGolS1氨基酸序列進(jìn)行基本特性分析，結(jié)果顯示NtGolS1蛋白的分子式為C1803H2756N448O505S15，分子質(zhì)量為39.2693 ku，理論等電點(diǎn)pI 5.78。該蛋白含Val（V）最多，占9.6%；其次為Ala（A），占8.7%?？偟膸д姎埢ˋrg+Lys）為37，負(fù)電殘基（Asp+Glu）為42。總的親水性平均系數(shù)（Grand average of hydropathicity，GRAVY）為-0.191，預(yù)測(cè)該蛋白屬于親水性蛋白。該蛋白預(yù)測(cè)不穩(wěn)定指數(shù)是35.47，屬于穩(wěn)定蛋白。NCBI保守結(jié)構(gòu)域搜索表明，NtGolS1屬于一個(gè)糖基轉(zhuǎn)移酶家族，該家族與脂多糖合成和糖原的合成相關(guān)，包含脂多糖糖基轉(zhuǎn)移酶、半乳糖糖基轉(zhuǎn)移酶等。

采用NetNGlyc 1.0預(yù)測(cè)NtGolS1蛋白有2個(gè)潛在N-糖基化位點(diǎn)，但糖基化一般發(fā)生在信號(hào)受體蛋白分子上，而SignalP 4.0預(yù)測(cè)NtGolS1蛋白無(wú)信號(hào)肽，說(shuō)明在體內(nèi)這些預(yù)測(cè)的潛在N-糖基化位點(diǎn)可能不能真正被糖基化。NetPhos2.0預(yù)測(cè)NtGolS1蛋白存在16個(gè)磷酸化位點(diǎn)，其潛在Ser、Thr和Tyr活性位點(diǎn)數(shù)分別為2、3和11個(gè)，NtGolS1蛋白存在豐富的磷酸化位點(diǎn)，說(shuō)明磷酸化位點(diǎn)修飾對(duì)GolS蛋白的功能可能非常重要，也可能是這些磷酸化參與GolS蛋白活性的調(diào)控。

2.3 NtGolS1蛋白質(zhì)的高級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果

運(yùn)用SOPMA軟件分析NtGolS1的二級(jí)結(jié)構(gòu)，結(jié)果如圖3所示，α螺旋約占45%，延伸直鏈約占12%，β轉(zhuǎn)角約占4%，無(wú)規(guī)則卷曲約占39%，其中α螺旋為主要結(jié)構(gòu)。以兔肌肉糖原蛋白晶體結(jié)構(gòu)作為NtGolS1結(jié)構(gòu)建模的參考蛋白，用同源建模服務(wù)器SWISS-MODEL進(jìn)行蛋白三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)。結(jié)果如圖4所示，說(shuō)明NtGolS1三維空間結(jié)構(gòu)主要由6個(gè)α螺旋和9個(gè)延伸直鏈圍繞形成1個(gè)球狀結(jié)構(gòu)。

圖3 NtGolS1的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果Fig.3 Secondary structure prediction of NtGolS1

圖4 NtGolS1的三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果Fig.4 Tertiary structure prediction of NtGolS1

2.4 不同物種間肌醇半乳糖苷合成酶蛋白同源性比較

通過(guò)NCBI網(wǎng)站BLAST結(jié)果發(fā)現(xiàn)該基因的氨基酸序列與肌醇半乳糖苷合成酶基因有非常高的相似度。其中與甘藍(lán)型油菜中的GolS基因（Brassicanapus；ACJ15472、HM003640）[4]具有最高相似度，一致性達(dá)80%，相似性為88%。其次與維柯薩中的GolS基因（Xerophyta viscosa；ABK27907）[12]在蛋白質(zhì)水平上一致性和相似性分別為76%和83%，與辣椒中的GolS基因（Capsicum annuum；ABQ44212）[2]在蛋白質(zhì)水平上一致性和相似性分別為75%和84%（見(jiàn)圖5）。

圖5 不同植物GolS基因氨基酸序列同源性比較Fig.5 Alignment of deduced amino acid sequences of GolS genes of different plants

用Mega 3.1軟件將推導(dǎo)的氨基酸序列與GenBank中其他植物的26個(gè)GolS基因的氨基酸序列進(jìn)行聚類(lèi)分析。結(jié)果表明，GolS基因在小果咖啡[4]、蕎麥[13]、甘藍(lán)型油菜[5]、紫毛蕊花[14]等植物中均以多種形式存在，其中小果咖啡和蕎麥中不同形式的GolS序列差異較大，被歸入不同的聚類(lèi)組。

本文克隆的基因首先與維柯薩GolS聚在一起，再與甘藍(lán)型油菜等植物GolS聚在一起，而與同科的辣椒GolS親緣關(guān)系較遠(yuǎn)（見(jiàn)圖6）。

圖6 煙草GolS基因氨基酸序列與其他植物氨基酸序列聚類(lèi)分析Fig.6 Phylogenetic analysis of amino acid sequences of tobacco GolS gene with other reported genes

3 討 論

電子克?。↖n silico cloning）是近年來(lái)伴隨基因組計(jì)劃和EST計(jì)劃發(fā)展起來(lái)的基因克隆新方法[15-16]，它依賴(lài)于各種生物信息數(shù)據(jù)庫(kù)，利用生物軟件拼接延伸EST序列，獲得目的基因的部分乃至全長(zhǎng)的cDNA序列。本研究以煙草與辣椒同屬茄科植物，物種間同源基因序列相對(duì)保守為切入點(diǎn)，以辣椒GS基因cDNA序列作為探針，對(duì)煙草EST數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行檢索拼接，成功克隆到1個(gè)新的煙草GS基因。在電子克隆檢索過(guò)程中，目標(biāo)物種鎖定煙草（Nicotiana tabacum），全部EST序列來(lái)源于同一品種K326，避免品種間基因多態(tài)性造成序列拼接工作的復(fù)雜性，進(jìn)而增加電子克隆的準(zhǔn)確性。同時(shí)，K326是我國(guó)主栽煙草品種之一，對(duì)其抗逆相關(guān)基因的研究，勢(shì)必具有重要的理論及應(yīng)用價(jià)值。

GolS基因在植物體內(nèi)常以多種形式存在，如在小果咖啡基因組中就發(fā)現(xiàn)有3種形式的GolS基因（見(jiàn)圖5）。dos Santos等研究表明，小果咖啡GolS1在正常生長(zhǎng)和各種脅迫條件下持續(xù)表達(dá)，GolS2受?chē)?yán)重干旱和鹽脅迫誘導(dǎo)表達(dá)，而GolS3被中度和嚴(yán)重干旱誘導(dǎo)，但對(duì)鹽脅迫無(wú)反應(yīng)[4]。聚類(lèi)圖中與本文克隆的基因聚在一起的維柯薩GolS基因受干旱脅迫后表達(dá)[12]，同時(shí)與煙草GolS氨基酸序列最相似的甘藍(lán)型油菜GolS基因也受干旱脅迫誘導(dǎo)表達(dá)[5]，上述這些基因在其他脅迫下是否表達(dá)并不清楚?？婄氲劝l(fā)現(xiàn)辣椒葉片在低溫脅迫后GolS表達(dá)上升[3]，辣椒和煙草同屬茄科植物，但考慮到辣椒GolS基因序列與本文獲得的煙草GolS基因相似度不是最高，在聚類(lèi)圖中也比較分散，可以推測(cè)這兩個(gè)基因不屬于同一類(lèi)GolS基因。植物體內(nèi)的各種GolS基因?qū)Ω鞣N逆境脅迫的反應(yīng)相當(dāng)復(fù)雜，同一類(lèi)GolS基因可以對(duì)不同的逆境脅迫作出反應(yīng)，而不同的GolS基因也可以受同一種脅迫誘導(dǎo)表達(dá)。本文所獲得的基因會(huì)被何種逆境脅迫誘導(dǎo)表達(dá)，值得進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

本研究首次通過(guò)電子克隆法從煙草栽培品種K326中克隆到1個(gè)煙草GolS基因。通過(guò)生物信息學(xué)技術(shù)對(duì)其編碼蛋白的理化性質(zhì)、二級(jí)結(jié)構(gòu)以及高級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行生物信息學(xué)分析，并探究與其他物種的生物進(jìn)化關(guān)系。為進(jìn)一步研究該類(lèi)蛋白的性質(zhì)和功能及植物抗逆基因工程研究奠定理論基礎(chǔ)。

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