曲春鶴，何付麗,，劉培福，紀明山，趙長山*，高黎力

（1.東北農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學院，哈爾濱 150030；2.沈陽農(nóng)業(yè)大學植物保護學院，沈陽 110161；3.黑龍江省農(nóng)藥管理檢定站 哈爾濱 150090）

由于蔬菜栽培面積不斷增加，加之高密度栽培、長期連作，致使土傳病害發(fā)生越來越嚴重。由 腐 皮 鐮 孢 菌（Fusarium.solani（Mart.）App.et Wollenw）侵染引起的辣椒根腐病是一種典型土傳病害，部分地區(qū)由于該病的危害，輕者辣椒減產(chǎn)20%～30%，重者達50%以上甚至絕產(chǎn)[1-2]。目前對土傳病害主要防治方法是殺菌譜廣、見效快的化學藥劑防治，但病原菌極易對其產(chǎn)生抗藥性，導致化學農(nóng)藥施用量不斷增加，造成農(nóng)藥殘留量增大、生態(tài)平衡易被破壞，威脅人類健康和安全[3-5]。因此，尋找新藥劑或更有效的途徑防治土傳病害尤為重要。篩選對病原菌有拮抗作用的細菌、真菌、放線菌等微生物，是采用生物防治手段控制土傳病害的有效途徑，國內外學者致力于生防微生物篩選[6-8]及其產(chǎn)物研究[9-11]。然而，不當?shù)姆蛛x篩選方法會帶來巨大的工作量[12]，且篩選菌株應用到田間防病效果差甚至無效[13-15]。

本文采用平板對峙試驗-胚根試驗-盆栽試驗系統(tǒng)篩選方法，以F.solani為指示菌，從辣椒根際土壤中篩選拮抗細菌，選取其中一株拮抗細菌研究其對多種病原真菌的抑菌效果及其對辣椒的促生作用，并研究其生物學特性及分類學地位。以期為快速、有效從土壤中篩選拮抗細菌提供研究方法，并為該菌株在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中推廣應用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌種

辣椒根腐病菌（F.solani），由東北農(nóng)業(yè)大學病理實驗室提供；大豆疫病菌（Phytophthora sojae）、大豆菌核病菌（Sclerotinia sclerotinorum），由東北農(nóng)業(yè)大學大豆研究所提供；黃瓜枯萎病菌（F.oxysporum）、黃瓜立枯病菌（Rhizoctonia solani）、小麥根腐病菌（Bipolaris sorokiniana）、棉花黃萎病菌（Verticillium dahliae），由沈陽農(nóng)業(yè)大學植物保護學院提供；水稻惡苗病菌（F.moniliforme），由黑龍江省八一農(nóng)墾大學提供。

1.1.2 供試土壤

辣椒根際土壤，采自黑龍江省哈爾濱、牡丹江、肇東辣椒主要種植區(qū)。

1.1.3 供試培養(yǎng)基及試劑

①PDA培養(yǎng)基：用于病原真菌培養(yǎng)、細菌分離。馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，蒸餾水1000mL，pH自然；

②NA培養(yǎng)基：用于細菌純化、培養(yǎng)。牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，NaCl5 g，瓊脂20 g，蒸餾水1000mL，pH 7.0～7.2；

③NB培養(yǎng)基：用于細菌培養(yǎng)。牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，NaCl5 g，蒸餾水1000mL，pH 7.0～7.2；

④LB培養(yǎng)基：用于細菌培養(yǎng)。胰蛋白胨10 g，酵母粉5 g。NaCl 10 g，瓊脂20 g，蒸餾水1000 mL，pH 7.0～7.2。

⑤谷子：在胚根試驗、盆栽試驗中用于培養(yǎng)病原真菌。

⑥Ringer's溶液：用于配置拮抗細菌懸浮液。NaCl 6.5 g，NaHCO30.2 g，KCl 0.14 g，NaH2PO40.01 g，CaCl20.12 g，蒸餾水1000mL。

1.2 方法

采用直接分離法從辣椒根際土壤中分離細菌；平板對峙-胚根試驗-盆栽試驗系統(tǒng)篩選方法篩選拮抗細菌。

1.2.1 土壤中拮抗細菌的分離

采用直接分離法，將病原菌（F.solani）孢子懸浮液與土壤懸浮液各0.1mL涂布在PDA平板上，適溫培養(yǎng)。待細菌菌落與病原菌長出，觀察細菌菌落周圍是否產(chǎn)生抑菌圈，挑選產(chǎn)生抑菌圈的細菌分離、純化，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 拮抗細菌的篩選

采用平板對峙試驗初步篩選拮抗細菌[16]。

經(jīng)煮熟滅菌的谷子作為病原菌（F.solani）的培養(yǎng)基，接種培養(yǎng)后備用。

采用盆栽試驗篩選拮抗細菌，辣椒育苗至4對真葉，移栽。處理組：在蛭石中混拌接種病原菌（F.solani）的谷子，每盆加入20mL拮抗菌菌懸液（108cfu·mL-1）。對照組：（a）盆栽混入接種病原菌（F.solani）的谷子，（b）盆栽混入無菌谷子；對照每缽加入20mL釋釋4倍的無菌Ringer's溶液。每處理5次重復。4周后，調查辣椒發(fā)病情況。

根據(jù)0～9級分級標準計算辣椒根腐病病情指數(shù)[17]，評價病害嚴重度。0級-無??；1級-根系稍有變色；3級-根系明顯變褐；5級-變色根系占全部根系的30.1%～50%，植株萎蔫；7級-變色根系占全部根系的50.1%～80%，植株明顯萎蔫；9級-全株死亡。

1.2.3 拮抗細菌對病原真菌生長的影響

采用平板對峙法，以土傳病害病原真菌大豆疫病菌（Phytophthora sojae）、黃瓜枯萎病菌（Fusarium oxysporum）、黃瓜立枯病菌（Rhizoctonia solani）、小麥根腐病菌（Bipolaris sorokiniana）、大豆菌核病菌（Sclerotinia sclerotinorum）、棉花黃萎病菌（Verticillium dahliae）、水稻惡苗病菌（Fusarium moniliforme）、辣椒根腐病菌（Fusarium.solani）作為指示菌，接種至PDA平板中央，在病原菌周圍等距離三點接種拮抗細菌。測定拮抗細菌D221對以上病原真菌的抑菌作用。計算抑制率。

式中，r-病原菌菌落中心至拮抗細菌菌落方向的病原菌菌帶寬度（cm），R-反方向的病原菌菌帶最大寬度（cm）。

1.2.4 拮抗細菌對辣椒促生作用的研究

辣椒種子消毒、浸種，催芽至露白，擺放培養(yǎng)皿中，加入拮抗細菌懸浮液（108cfu·mL-1）。對照每皿加入等量稀釋4倍的無菌Ringer's溶液。每個處理5次重復。28℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)2 d，測量辣椒胚根長度，計算增長率。

我記得在那天的開學典禮上，時任北大副校長的岳素蘭教授發(fā)表了致辭，囑咐我們珍惜在北大的學習機會，努力提高自己，在工作中學以致用，更好地為北大、為社會服務。

1.2.5 拮抗細菌的鑒定

拮抗細菌菌株參照錢存柔等[18]，車秀珠等[19]方法進行革蘭氏染色、芽胞染色，在顯微鏡下作菌體形態(tài)觀察和描述；進行硝酸鹽還原試驗、V-P試驗、檸檬酸鹽利用試驗、葡萄糖氧化發(fā)酵、淀粉水解、明膠液化及甲基紅試驗等生理生化鑒定。

以拮抗細菌的LB培養(yǎng)液，采用天根公司細菌基因組DNA提取試劑盒（離心柱式DP302-02）提取基因組DNA。以引物（KO15'AGAGTTTGATCM TGGCTCAG 3'，KO25'TACGGYTACCTTGTTACG ACTT 3'）進行PCR擴增。16S rDNA測序工作由上?；瞪锛夹g有限公司完成，通過NCBI的BLAST程序進行比對（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）。采用Mega 4.1軟件建立系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.6 數(shù)據(jù)分析方法

數(shù)據(jù)處理采用DPS 10.15企業(yè)版軟件進行處理。

2 結果與分析

2.1 拮抗細菌的篩選結果

從辣椒根際土壤直接分離得到105株能夠產(chǎn)生抑菌圈的細菌，純化后由平板對峙試驗篩選得到明顯抑制病原菌（F.solani）生長的23株細菌。進一步采用胚根試驗篩選得到11株細菌，經(jīng)處理的辣椒胚根發(fā)病程度均較低，最低發(fā)病率為25%，明顯低于病原菌處理的發(fā)病率（100%）。

11株拮抗細菌進一步進行盆栽試驗。結果表明，只接種病原菌（F.solani）的辣椒植株生長明顯受到抑制，且須根全部腐爛，莖基部及主根上也有明顯褐色病斑，發(fā)病嚴重的植株死亡。與只接種病原菌（F.solani）的對照比較，分別經(jīng)拮抗細菌D221、II621、15-1-1、19-2-3處理的辣椒植株在試驗中發(fā)病程度較低，植株根部未發(fā)病或發(fā)病較輕，生長并未受到明顯的抑制作用（見表1）。

表1 盆栽試驗篩選拮抗細菌Table1 Screening antagonistic bacteria with pot experiment

由表1可知，拮抗細菌D221、II621、15-1-1、19-2-3對辣椒根腐病的防治效果分別達到70.33%、69.19%、68.43%和76.01%，即該4株拮抗細菌均能明顯抑制辣椒根腐病菌對辣椒的侵染，并顯著降低病害發(fā)生程度。

2.2 拮抗細菌D221對病原真菌的抑制作用

從篩選結果中選取菌株D221進行研究。采用平板對峙法，測定其對多種病原真菌的抑菌作用，結果如表2所示，拮抗細菌D221對供試的病原真菌抑制率均在50%以上，并產(chǎn)生明顯的抑菌帶，其中對大豆疫病病原菌的抑制率達67.26%。

表2 拮抗細菌D221對病原真菌的抑菌作用Table 2 Inhibition of strain D221 against different pathogens

2.3 拮抗細菌D221對辣椒胚根的促生作用

結果如表3所示，經(jīng)過拮抗細菌D221處理的辣椒胚根顯著伸長，與對照比較，增長34.33%，表明拮抗細菌D221對辣椒胚根具有明顯促進伸長的作用。

表3 拮抗細菌D221對辣椒胚根的促生作用Table 3 Promotion of strain D221 to pepper radicle

2.4 拮抗細菌D221的鑒定

結果見表4。

表4 菌株D221的生理生化特征Table 4 Physiological and biochemical characters of strain D221

細菌D221菌落形態(tài)乳白色，不透明，表面不光滑，菌落上有褶皺、突起，不產(chǎn)生色素。芽胞橢圓形。經(jīng)生化鑒定為革蘭氏陽性菌。具體生理生化指標見表4。

根據(jù)文獻[19-20]綜合分析菌株D221形態(tài)特征及生理生化特征，初步鑒定菌株D221為芽胞桿菌屬的枯草芽胞桿菌（Bacillus subtilis）。

將菌株D221的16S rDNA全序列在NCBI上通過BLAST程序進行同源性分析，結果表明，與菌株D221核苷酸序列相似性較高的菌株主要是枯草芽胞桿菌（Bacillus stubtilis）、解淀粉芽胞桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）、Bacillus velezensis以及一些未確定的芽胞桿菌（Bacillus sp.）等。選取與菌株D221的16S rDNA序列相似性較大的菌株，通過Mega 4.1進行多序比對，建立系統(tǒng)發(fā)育樹（見圖1）。

圖1 菌株D22116S rDNA序列的系統(tǒng)發(fā)育樹狀圖Fig.1 Phylogenetic tree of strain D221 by 16S rDNA sequence

進一步確定其分類學地位為枯草芽胞桿菌（Bacillus subtilis）。菌株D221的序列已在GenBank中注冊，序列號為JF495161。

3 討論與結論

通過直接分離方法從辣椒根際土壤中分離得到105株細菌，經(jīng)平板對峙試驗-胚根試驗-盆栽試驗系統(tǒng)篩選方法，篩選得到4株對病原菌（F.solani）生長有明顯抑制作用、能顯著降低辣椒根腐病發(fā)病程度的拮抗細菌，分別命名為菌株D221、II621、15-1-1、19-2-3。

菌株D221對供試病原真菌均有明顯的抑制作用；能夠顯著促進辣椒胚根伸長，胚根增長34.33%。經(jīng)形態(tài)、生理生化特征及16S rDNA同源性比較分析，將菌株D221鑒定為枯草芽胞桿菌（Bacillus subtilis）。

目前關于土壤中拮抗細菌的分離篩選多采用稀釋平板法[21]及平板對峙法。采用稀釋平板法分離細菌，由于土壤懸浮液涂布平板培養(yǎng)后挑取菌落時缺乏針對性，分離得到大量細菌菌株，為進一步篩選帶來巨大的工作量。平板對峙法是一種實驗室無菌操作的離體試驗，僅通過該方法篩選拮抗細菌，選取平板上抑菌作用最好的菌株作為篩選結果，由此得到的菌株在田間實際應用防病作用不明顯，甚至無效[14-15,22-23]，或漏篩某些防病效果穩(wěn)定、高效的菌株[24]。研究表明，環(huán)境條件（土壤類型、土壤質地、土壤溫度、土壤濕度、pH等理化性質，氣溫、光照及降雨量等）及土壤中微生物種群甚至作物種類等，均會影響拮抗細菌的定殖能力、生存繁殖能力、存活率、與病原菌競爭的能力或抗菌物質產(chǎn)生的能力而影響其防治效果。因此，分離篩選方法的選擇與建立應全面考慮寄主、拮抗細菌、病原菌及環(huán)境之間的相互作用，針對性強、相對簡化。本研究采用直接分離法從辣椒根際土壤中分離細菌，針對性強，減少了分離及進一步篩選的工作量。應用平板對峙試驗-胚根試驗-盆栽試驗系統(tǒng)篩選方法，首先由平板對峙試驗篩選對病原菌具有一定拮抗作用的23株細菌；將以上菌株進行胚根試驗，得到能夠顯著控制胚根發(fā)病的11株拮抗細菌，雖然辣椒胚根易感病，不易操作，但能夠初步指示待選菌株是否具有防病作用，為下階段的盆栽試驗節(jié)省工作量；進一步進行盆栽試驗，篩選得到4株拮抗細菌能夠有效防治辣椒根腐病，盆栽篩選試驗中防效最高的菌株19-2-3在平板對峙試驗中的抑菌測定結果并不是最好，表明平板對峙試驗僅能證明離體試驗條件下的抑菌作用，并不代表實際應用的防病效果；盆栽試驗處理與實際應用條件相近，篩選的菌株在田間應用效果更穩(wěn)定。該系統(tǒng)的篩選方法充分考慮了寄主植物、拮抗細菌、病原菌及環(huán)境之間的相互作用，逐步進行，能夠更加準確的篩選拮抗細菌，并使菌株更具有田間實際應用價值；菌株19-2-3在平板對峙試驗及盆栽試驗中表現(xiàn)不一致，其實際應用的適應性更強或產(chǎn)生更有效的抑菌物質提高其防病效果，此問題有待進一步研究。

為有效合理利用菌株D221控制病害，有必要深入研究其在田間實際應用效果、抑菌防病機理，以及與其他生防因子的復配，進一步提高抑菌效價，為其在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的推廣應用及對土傳病害的有效生物防治奠定研究基礎。

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