邢寶玲，張東生，王 麗，林 梅，余慧萍

(1.東南大學(xué)醫(yī)學(xué)院病理與病理生理學(xué)系，南京210009;2.常州市婦幼保健醫(yī)院，江蘇 常州213003)

磁性微載體是一種獨(dú)特的靶向藥物運(yùn)載系統(tǒng)，包括納米脂質(zhì)體、納米球和納米囊等，目前此類藥物磁性載體已可達(dá)納米水平。磁性粒子不僅可以被用作藥物載體，還可在交變磁場下發(fā)揮其居里溫度的特性升溫恒溫，從而對腫瘤進(jìn)行熱療及化療。近幾十年來，砒霜(三氧化二砷，As2O3)治療白血病取得了良好的臨床效果，對實(shí)體腫瘤的治療研究也顯示出良好的應(yīng)用前景。本研究小組已成功制備了在交變磁場下控溫恒溫的As2O3磁性納米脂質(zhì)體［1］，其熱化療雙重作用可強(qiáng)烈抑制人卵巢癌HO－8910細(xì)胞的生長并誘導(dǎo)凋亡［2］。本文通過 nm23H1和c-myc表達(dá)的研究從分子水平進(jìn)一步揭示As2O3磁性納米脂質(zhì)體熱化療治療卵巢癌的機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 主要材料和儀器

空白脂質(zhì)體、As2O3溶液、納米As2O3脂質(zhì)體以及以 Mn0.4Zn0.6Fe2O4為載體的 NML 和 NMLA 由本實(shí)驗(yàn)室自行制備［1］;人漿液性卵巢癌HO－8910細(xì)胞株，中國科學(xué)院上海細(xì)胞研究所;β-actin、nm23H1、c-myc上下游引物，申能博彩公司合成;RT-PCR試劑盒，Takara公司;能譜儀，EDAX，美國;基因擴(kuò)增儀，基因公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

HO－8910細(xì)胞接種于含有10%小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液中，在37℃、飽和濕度、體積分?jǐn)?shù)為5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)時(shí)取對數(shù)生長期細(xì)胞。

1.2.2 工作液的制備

以含10%小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基將前述5種制劑分別配成工作液，使 As2O3的濃度為6 μmol·L－1，磁性材料的濃度為 15 mg·mL－1，對照組選用含10%小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液。

1.2.3 細(xì)胞處理、形態(tài)學(xué)觀察及能譜分析

制備濃度為3×105mL－1的細(xì)胞懸液，以每瓶4 mL種于6個(gè)培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)48 h后，分別加入以上5種工作液及培養(yǎng)液，并將NMLA熱療組和NML熱療組細(xì)胞置于200 kHz、4 kW的AMF中加熱40 min，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后取出，收集細(xì)胞。制備超薄切片。

1.2.4 RT-PCR 分析 nm23H1、c-myc 的 mRNA表達(dá)

提取并純化總RNA。RT反應(yīng)條件:42℃ 60 min，99 ℃ 5 min，0 ℃ 5 min.PCR 引物:nm23H1 F 5'GTGAAAAGCAATGTGGT 3'，R 5'TTGCCATGGTCTGGGAG 3'，267 bp;c-myc F 5'AAGTCCTGCGCCTCGCAA 3'，R 5'GCTGTGGCCTCCAGCAGA 3'，248 bp;β-actin F 5'GTGGGGCGCCCCAGGCACCA 3'，R 5'TTGCCATGGTCTGGGAG 3'，513 bp。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

透射電子顯微鏡下觀察，As2O3化療和熱療后，均可見凋亡的HO8910細(xì)胞，染色質(zhì)濃聚深染，邊集于核膜，形成致密的環(huán)狀或半月形結(jié)構(gòu)，部分線粒體腫脹空化，細(xì)胞質(zhì)膜有內(nèi)折及泡狀外凸。在納米磁性脂質(zhì)體組和磁性納米As2O3脂質(zhì)體熱療組細(xì)胞漿中明顯可見散在或片狀聚集的電子密度高的物質(zhì)(見圖1)，掃描電子顯微鏡下，任選一個(gè)納米As2O3磁性脂質(zhì)體處理的細(xì)胞，能譜分析發(fā)現(xiàn)含有錳、鋅、鐵和砷等組分(見圖2)。

圖1 As2O3納米磁性脂質(zhì)體熱療組:HO8910細(xì)胞胞漿內(nèi)可見顆粒狀、片塊狀電子密度高的物質(zhì)聚集，細(xì)胞核內(nèi)異染色質(zhì)濃染，邊集于核膜

圖2 納米As2O3磁性脂質(zhì)體熱療處理細(xì)胞48 h的切片能譜圖(P元素為PBS緩沖液及磷脂中含有)

用Total Lab分析軟件對PCR電泳條帶進(jìn)行掃描分析，目的片段和β-actin的比值作為實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，用 SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析，nm23H1mRNA在HO8910細(xì)胞(培養(yǎng)液組，空白脂質(zhì)體組)中有表達(dá)，As2O3溶液、As2O3脂質(zhì)體及As2O3磁性脂質(zhì)體可使其表達(dá)升高(P＜0.05)，磁性脂質(zhì)體單純熱療不改變其表達(dá)量(P＞0.05)(見圖3(a))。c-mycmRNA在HO8910細(xì)胞中有表達(dá)，As2O3溶液、As2O3脂質(zhì)體和磁性脂質(zhì)體單純熱療均使其表達(dá)下降(P＜0.05)，As2O3磁性脂質(zhì)體的熱療及化療作用對其表達(dá)量的下調(diào)更為明顯(P＜0.05)(見圖3(b))。

圖3 1納米As2O3磁性脂質(zhì)體熱療組，2納米磁性脂質(zhì)體熱療組，3納米As2O3脂質(zhì)體組，4As2O3溶液組，5空白脂質(zhì)體組，6培養(yǎng)液組，N陰性對照組(cDNA)

3 討論

納米脂質(zhì)體是一種定向藥物載體，NMLA將Mn0.4Zn0.6Fe2O4磁感應(yīng)粒子與 As2O3包裹于脂質(zhì)體內(nèi)，利用納米粒子載藥量高、細(xì)胞親和力強(qiáng)的特點(diǎn)，在高頻AMF中將熱療和化療的作用協(xié)同放大，對人漿液性卵巢癌HO－8910細(xì)胞具有明顯的生長抑制和促凋亡作用。

在治療惡性腫瘤方面，As2O3誘導(dǎo)凋亡及對抗腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)基因的研究進(jìn)行得較為廣泛而且深入［3－4］，而對于熱療治療腫瘤的機(jī)制研究較少，但也有文獻(xiàn)認(rèn)為熱療也可誘導(dǎo)凋亡、對抗轉(zhuǎn)移，還可以逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞耐藥［5－6］。熱療與化療作用不僅可以相加，而且可以產(chǎn)生協(xié)同放大的效應(yīng)，同時(shí)或化療以后進(jìn)行熱療，可以對化療制劑發(fā)揮增敏作用［7］。

nm23H1基因?qū)δ[瘤轉(zhuǎn)移有抑制作用［8］，在正常卵巢和卵巢良性腫瘤中均有nm23H1表達(dá)，但卵巢癌中的nm23表達(dá)率明顯高于正常卵巢組織、良性和交界性腫瘤，提示nm23H1表達(dá)與卵巢癌發(fā)生有關(guān)。淋巴結(jié)陰性的腫瘤nm23H1表達(dá)水平顯著高于淋巴結(jié)陽性的腫瘤，說明nm23H1基因是在卵巢癌發(fā)生早期被激活，對卵巢癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移起抑制作用。黃守國［9］研究As2O3對黏液性卵巢癌3AO的作用，體外實(shí)驗(yàn)的結(jié)果是，As2O3誘導(dǎo)3AO細(xì)胞表面Fas基因的過量表達(dá)導(dǎo)致凋亡，誘導(dǎo)nm23基因的上調(diào)，抑制惡性卵巢腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力。本實(shí)驗(yàn)顯示，nm23H1在卵巢癌細(xì)胞HO8910中有明顯的表達(dá)，As2O3上調(diào)nm23H1的表達(dá)，磁性脂質(zhì)體單純熱療對它的表達(dá)無明顯影響。本實(shí)驗(yàn)的熱療與水浴、微波等加熱方式不同，是納米磁性粒子進(jìn)入細(xì)胞介導(dǎo)的反應(yīng)，更為直接快速，對癌細(xì)胞的殺傷力度更強(qiáng)，而熱療本身是否能夠抑制腫瘤轉(zhuǎn)移及其途徑，還需要進(jìn)一步研究。

c-myc基因與惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，有學(xué)者［10］研究了Myc的相關(guān)蛋白Max和Mad，發(fā)現(xiàn)在正常細(xì)胞和癌細(xì)胞中c-myc都表達(dá)，其正常表達(dá)是細(xì)胞完成周期過程所必須的，但正常細(xì)胞中高表達(dá)Mad，而癌細(xì)胞中高表達(dá)Max，c-myc的表達(dá)產(chǎn)物與Mad的表達(dá)產(chǎn)物競爭結(jié)合Max蛋白，癌細(xì)胞中Myc-Max蛋白二聚體促進(jìn)了人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(hTERT)基因的轉(zhuǎn)錄，正常細(xì)胞中hTERT的低表達(dá)與Myc-Max蛋白二聚體轉(zhuǎn)錄活性的丟失有關(guān)。Shen等［11］實(shí)驗(yàn)證實(shí)，經(jīng) As2O3誘導(dǎo)后，細(xì)胞的 Bcl－2和c-myc基因表達(dá)均下調(diào)，一方面促進(jìn)細(xì)胞凋亡的發(fā)生，另一方面通過下調(diào)hTERT的表達(dá)來下調(diào)端粒酶活性。Trieb［12］發(fā)現(xiàn)高溫(42.5 ℃，90 min)可逆性下調(diào)骨肉瘤細(xì)胞的端粒酶活性，抑制骨肉瘤細(xì)胞的增生。但熱療與c-myc的關(guān)系不清楚。

33% ～37%的卵巢上皮性癌有c-myc基因的擴(kuò)增或過表達(dá)，c-myc過表達(dá)更常見于漿液性腺癌，與腫瘤分期有關(guān)，提示在腫瘤進(jìn)展期中起作用。HO8910細(xì)胞來自于漿液性卵巢癌患者的腹水中，經(jīng)As2O3或熱療的作用后，它的表達(dá)量均下降，As2O3和熱療的聯(lián)合處理使其表達(dá)進(jìn)一步降低，推測As2O3和熱療都可通過降低c-myc基因的表達(dá)來誘導(dǎo)HO8910細(xì)胞凋亡，二者聯(lián)合可以增強(qiáng)這一途徑誘導(dǎo)凋亡，但本實(shí)驗(yàn)中是否c-myc的下降通過抑制hTERT基因轉(zhuǎn)錄最終下調(diào)端粒酶的活性來誘導(dǎo)凋亡，還需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)加以證實(shí)。

研究表明nm23基因與c-myc基因在許多腫瘤中有陽性表達(dá)，c-myc的陽性率隨著卵巢癌浸潤程度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移而增高，說明c-myc蛋白過度表達(dá)對癌細(xì)胞的浸潤轉(zhuǎn)移起促進(jìn)作用。nm23H1的過度表達(dá)可促使基底膜的形成，抑制腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移，還能部分抑制腫瘤形成［8］。c-myc與nm23之間雖無明確的內(nèi)在相關(guān)性，但對二者的再深入研究，對于進(jìn)一步了解腫瘤細(xì)胞增殖、分化和轉(zhuǎn)移的機(jī)制，抗轉(zhuǎn)移藥物的篩選將產(chǎn)生不可估量的作用。本研究通過新納米藥物劑型－NMLA對HO8910細(xì)胞的作用，表明了As2O3和熱療對漿液性卵巢癌的治療作用與cmyc和nm23 H1相關(guān)，NMLA的熱化療作用還可協(xié)同增強(qiáng)下調(diào)c-myc的表達(dá)。

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