徐永杰，吳海港，姚 瑾，3，劉 英，梁小娟，馬 云＊

（1.信陽(yáng)師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，河南 信陽(yáng) 464000；2.信陽(yáng)農(nóng)業(yè)高等專(zhuān)科學(xué)校，河南 信陽(yáng) 464000；3.江蘇大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，江蘇 鎮(zhèn)江 212013；）

信陽(yáng)水牛GHRH基因第二外顯子的SNPs檢測(cè)

徐永杰1，吳海港2，姚 瑾1，3，劉 英1，梁小娟1，馬 云＊1

（1.信陽(yáng)師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，河南 信陽(yáng) 464000；2.信陽(yáng)農(nóng)業(yè)高等專(zhuān)科學(xué)校，河南 信陽(yáng) 464000；3.江蘇大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，江蘇 鎮(zhèn)江 212013；）

［目的］檢測(cè)信陽(yáng)水牛群體GHRH基因的SNP多態(tài)性。［方法］以56頭信陽(yáng)水牛為材料，采集血樣，提取基因組DNA，以GenBank公布的牛GHRH 基因（gi：194719389）序列作為參照序列，設(shè)計(jì)PCR引物，采用PCR－SSCP和DNA測(cè)序方法對(duì)該基因第二外顯子的進(jìn)行突變檢測(cè)。［結(jié)果］經(jīng)SSCP分析發(fā)現(xiàn)，這些個(gè)體總共出現(xiàn)六種不同的帶型。測(cè)序結(jié)果表明：位于GHRH基因的4461bp、4529bp、4845bp、5053bp和5058bp處分別存在C→T、T→G、G→A、G→A和G→T五個(gè)單核苷酸突變。［結(jié)論］表明該基因在信陽(yáng)水牛群體中單核苷酸多態(tài)較為豐富。

信陽(yáng)水牛；GHRH 基因；SNPs；PCR－SSCP

引言

信陽(yáng)水牛主產(chǎn)于河南省信陽(yáng)市，中心產(chǎn)區(qū)為信陽(yáng)市的光山、羅山、固始、商城、新縣等縣區(qū)［1］。信陽(yáng)水牛屬牛科、水牛屬，于1983年被列入《河南省地方優(yōu)良畜禽品種志》，2003年被列入《中國(guó)畜禽遺傳資源名錄》，體型較大、體質(zhì)結(jié)實(shí)、結(jié)構(gòu)勻稱(chēng)，胸寬深，肋骨開(kāi)張良好，背平直而寬，尻寬廣而傾斜，而且性情溫馴、喜水、繁殖性能、適應(yīng)性強(qiáng)，耐粗飼［2］，這些優(yōu)點(diǎn)使得信陽(yáng)水牛在役用方面?zhèn)涫芡茖?。隨著農(nóng)業(yè)機(jī)械化水平的不斷提高和農(nóng)業(yè)現(xiàn)代化的逐步實(shí)現(xiàn)，信陽(yáng)水牛的經(jīng)濟(jì)用途已逐步從單純的役用向乳、肉方向轉(zhuǎn)化。信陽(yáng)水牛肉質(zhì)較好，在營(yíng)養(yǎng)價(jià)值很高的牛肉中占有很大的比例；其水牛奶濃稠、清香，沒(méi)有膻味，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值很高，總固形物達(dá)20%，是普通牛奶1.7倍，蛋白質(zhì)達(dá)4.5%，比普通牛奶高出1.3個(gè)百分點(diǎn)，而且水牛奶中鈣、鐵、磷、維生素A、維生素E等含量非常豐富 ，是老幼皆宜營(yíng)養(yǎng)食品，水牛奶將成為消費(fèi)新寵［3］。由此可見(jiàn)，信陽(yáng)水牛有著舉足輕重的價(jià)值性和極好的發(fā)展?jié)摿Α?/p>

然而，近年來(lái)信陽(yáng)水牛的存欄數(shù)呈現(xiàn)快速、持續(xù)下降趨勢(shì)，加之信陽(yáng)水牛飼養(yǎng)業(yè)得不到應(yīng)有的重視，科技普及力度不夠，飼養(yǎng)周期長(zhǎng)、經(jīng)濟(jì)效益低，群眾的養(yǎng)牛積極性不高；而且信陽(yáng)水牛品種分布不合理，對(duì)于一些引進(jìn)的品種在分布上也不能形成規(guī)模，原始的放牧式養(yǎng)牛方法還普遍存在；品種結(jié)構(gòu)不合理，缺乏龍頭企業(yè)帶動(dòng)，沒(méi)有形成產(chǎn)業(yè)化經(jīng)營(yíng)，這些禁錮著水牛業(yè)發(fā)展的諸多問(wèn)題亟待解決［4］。因此，在分子水平上運(yùn)用現(xiàn)代技術(shù)對(duì)信陽(yáng)水牛進(jìn)行遺傳育種改良以促進(jìn)水牛業(yè)的發(fā)展，具有極其重要的意義。生長(zhǎng)激素釋放激素（growth hormone releasing hormone，GHRH）是下丘腦合成和分泌的小分子蛋白，是一種直接或間接的免疫功能狀態(tài)下維持生理和病理的下丘腦激素［5］，是促進(jìn)生長(zhǎng)激素分泌的重要的一種正性調(diào)控因子。牛的下丘腦分泌的GHRH有3種形式，分別由44、40、37個(gè)氨基酸組成。研究證明這3種GHRH均具有生物活性，其中以44肽的活性最高，Barendse［6］利用基因連鎖分析法把牛的GHRH基因定位于13號(hào)染色體上，并證明牛的GHRH基因由5個(gè)外顯子和4個(gè)內(nèi)含子組成［7］，對(duì)普通牛GHRH全基因測(cè)序得到的基因全長(zhǎng)為9356 bp［8］。GHRH 基因具有多種極其重要的作用，其主要功能是誘導(dǎo)并刺激垂體促生長(zhǎng)區(qū)的細(xì)胞合成和釋放生長(zhǎng)激素。通過(guò)注射GHRH 刺激牛、羊、豬、猴和犬的研究表明，GHRH 的促GH釋放活性較高［9－11］。此外，GHRH 在其他方面也有不可或缺的作用，例如：GHRH 有助于 HIV患者骨骼的增強(qiáng)［12］；GHRH 還具有免疫調(diào)節(jié)的功能［13］。

近年來(lái)有關(guān)黃牛、牦牛等的GHRH 基因的多態(tài)性及與生產(chǎn)性能的關(guān)聯(lián)分析等已有相關(guān)的研究報(bào)道［14－19］，但在信陽(yáng)水牛上，至今尚未見(jiàn)有關(guān)GHRH基因影響其生產(chǎn)性能的報(bào)道，本研究運(yùn)用PCR－SSCP結(jié)合測(cè)序的方法，對(duì)信陽(yáng)水牛的GHRH基因的第二外顯子進(jìn)行突變檢測(cè)，以期為進(jìn)一步進(jìn)行生產(chǎn)性狀的關(guān)聯(lián)分析，發(fā)現(xiàn)與重要經(jīng)濟(jì)性狀相關(guān)的DNA分子遺傳標(biāo)記，對(duì)信陽(yáng)水牛的遺傳育種改良以促進(jìn)水牛業(yè)的發(fā)展具有極其重要的意義。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 樣本 采集共計(jì)56頭均無(wú)血緣關(guān)系的信陽(yáng)水牛（♀）的靜脈血液，加入抗凝劑ACD搖勻（血液：ACD＝6∶1），用加冰塊的泡沫箱帶回試驗(yàn)室，－20℃低溫冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 主要試劑 Golden DNA 聚合酶（Polymerase）、2×Reaction Mix、dNTP、Marker DL2000、瓊脂糖、Tris飽和酚、蛋白酶K等購(gòu)自鄭州久是生物技術(shù)有限責(zé)任公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純；引物合成和測(cè)序由南京金斯瑞生物科技有限公司。

1.1.3 主要實(shí)驗(yàn)儀器 PCR儀（型號(hào)：Gene Amp PCR System9600）；電泳儀（型號(hào)：DYY－6C型）；水平電泳槽（型號(hào)：DYCP－31B）；垂直板電泳槽（型號(hào)：DYCZ－20A）；凝膠成像系統(tǒng)（型 號(hào)：UVP GDS－8000）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 DNA提取與檢測(cè) 采用傳統(tǒng)的氯仿提取法［20－21］提取信陽(yáng)牛血樣基因組DNA，提取后 的DNA用TE緩沖液溶解后，采用0.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)和紫外分光光度計(jì)測(cè)定濃度后，－80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 PCR引物的設(shè)計(jì)與合成 參照NCBI（National Center for Biotechnology Information）數(shù)據(jù)庫(kù)中公布的GHRH 基因序列（gi：194719389）以及外顯子序列，利用Primer 5.0軟件自行設(shè)計(jì)GHRH基因的第二外顯子序列的PCR擴(kuò)增引物，由上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行引物合成，序列信息見(jiàn)表1。

表1 引物序列信息

在PCR反應(yīng)為15μL體系，具體如下：2×Reaction Mix 7.5μL、Golden Taq DNA聚合酶（5U／μL）0.1μL、引物GHRH2S（上游引物，10μmol／L）0.1μL、引物GHRH2A（下游引物，10μmol／L）0.1μL、無(wú)菌水6.2μL、DNA 模板（1μg／μL）1.0 μL。按照如下條件進(jìn)行擴(kuò)增：95℃預(yù)變性10min；94℃變性30s，63.4℃退火40s，72℃延伸30s，循環(huán)32次。

1.2.3 PCR結(jié)果的瓊脂糖電泳檢測(cè) 取2.0μL PCR產(chǎn)物，點(diǎn)樣于1.5%瓊脂糖（0.21g瓊脂糖，16 mL 1×TBE緩沖液）凝膠膠孔中，120V電壓，電泳約35min，EB（溴化乙啶）染色，紫外燈下觀察電泳結(jié)果，并用凝膠成像系統(tǒng)拍照保存。

1.2.4 PCR產(chǎn)物的SSCP檢測(cè) 洗凈烘干玻璃板，兩板側(cè)邊用夾子夾緊，底部用1%的瓊脂糖封住，放置5min；將現(xiàn)配的、混勻的8%的PAGE凝膠迅速倒入玻璃板內(nèi)，插入梳子；室溫下凝膠約30min后，小心拔出梳子，立即用蒸餾水立刻沖洗點(diǎn)樣孔，取出橡膠條，將注有膠的玻璃板放到垂直電泳槽內(nèi)，加入電泳緩沖液；取4μL PCR產(chǎn)物，加6μL變性緩沖液，瞬時(shí)離心后PCR儀中98℃變性10min；取出變性后的PCR產(chǎn)物立即埋入冰中，冰浴5min后迅速上樣，并作好點(diǎn)樣順序記錄，冰浴條件下250 V電壓電泳20min，而后160V電壓電泳20h；取凝膠：電泳結(jié)束后切斷電源，卸下膠板，將凝膠從玻璃板中小心取出，用蒸餾水漂洗2次（每次20s）；銀染凝膠：將染色液（0.1%AgNO3）倒入塑料盤(pán)中浸沒(méi)凝膠，放在搖床上避光輕輕搖30min，凝膠用蒸餾水漂洗2次；凝膠顯色：加入顯色液至浸沒(méi)凝膠，邊搖邊觀察，直到凝膠上顯現(xiàn)出清晰的電泳帶；終止顯色：倒出顯色液，用蒸餾水漂洗兩次；凝膠照相：將凝膠用凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行拍照，并作好記錄。

2 結(jié)果與分析

2.1 GHRH基因第二外顯子PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖電泳檢測(cè)結(jié)果

圖1 GHRH基因第二外顯子PCR擴(kuò)增結(jié)果

圖1是信陽(yáng)水牛GHRH基因第2外顯子PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳圖譜。由圖1可以看出，PCR產(chǎn)物帶型明亮清晰，又根據(jù)Marker所示，產(chǎn)物與預(yù)期的目的條帶一致，可以作為SSCP分析的樣本。

2.2 GHRH 基因第二外顯子PCR產(chǎn)物的SSCP檢測(cè)結(jié)果

圖2 信陽(yáng)水牛GHRH＊exon2的PCR－SSCP分型比較

SSCP分型結(jié)果見(jiàn)圖2，信陽(yáng)水牛GHGH＊exon2基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在8%非變性聚丙烯酰胺凝膠上電泳后出現(xiàn)六種帶型，分別命名為AD、AB、CA、AC、AA、AC和BB，對(duì)SSCP檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)AA型個(gè)體有3個(gè)，BB型個(gè)體有1個(gè)，AB型個(gè)體有14個(gè)，AC型個(gè)體有36個(gè)，CA型個(gè)體有1個(gè)，AD型個(gè)體有1個(gè)，說(shuō)明信陽(yáng)水牛GHRH 基因存在較豐富的多態(tài)性。

2.3 GHRH基因第二外顯子的SNPs測(cè)序結(jié)果

圖3 GHRH基因＊exon2的SNPs檢測(cè)結(jié)果（a～e）分別表示牛GHRH＊exon2的4461bp、4529bp、4845bp、5053bp、5058bp處的SNP）

對(duì)SSCP結(jié)果中呈現(xiàn)不同帶型的PCR產(chǎn)物進(jìn)行直接測(cè)序，以進(jìn)一步驗(yàn)證其多態(tài)位點(diǎn)的存在。結(jié)果表明：GHRH 基因第2外顯子上共出現(xiàn)5個(gè)SNPs，4461bp處存在C→T突變，4529bp處T→G突變，4845bp處G→A突變，5053處G→A突變，5058bp處G→T突變。這些突變導(dǎo)致了SSCP檢測(cè)中多種帶型的出現(xiàn)。測(cè)序結(jié)果見(jiàn)圖3。

3 討論

生長(zhǎng)激素釋放激素（growth hormone releasing hormone，GHRH）是由下丘腦合成并分泌的，是GH軸的主要調(diào)控因子，能促進(jìn)腦垂體生長(zhǎng)激素的合成與釋放。除此之外，GHRH對(duì)刺激GH合成和促生長(zhǎng)細(xì)胞增殖具有重要作用。目前GHRH基因與生長(zhǎng)性狀相關(guān)的遺傳多態(tài)只有少量報(bào)道，劉凱等［22］利用PCR－SSCP和 PCR－RFLP技術(shù)研究波爾山羊和徐淮白山羊2個(gè)群體GHRH基因的單核苷酸多態(tài)性，并對(duì)山羊GHRH 基因座的不同基因型與2個(gè)山羊群體體尺性狀做相關(guān)分析，結(jié)果表明GHRH基因位點(diǎn)對(duì)波爾山羊的管?chē)笖?shù)和體軀指數(shù)有顯著影響（P＜0.05），對(duì)其他指標(biāo)影響不顯著（P＞0.05），該研究對(duì)山羊生長(zhǎng)性狀的標(biāo)記輔助選擇具有一定的參考價(jià)值。Meng等［23］對(duì)羔羊?qū)嵤┘∽愇槐磉_(dá)GHRH質(zhì)粒結(jié)合電轉(zhuǎn)染，促進(jìn)了羔羊的生長(zhǎng)。牛GHRH基因同樣是與生長(zhǎng)性狀相關(guān)的功能基因［24］?？傊?，GHRH 基因是一個(gè)動(dòng)物生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)的重要功能候選基因。

PCR－SSCP分析結(jié)果受多種因素的影響，如電泳溫度、電壓、離子強(qiáng)度（電泳緩沖液濃度）、凝膠濃度和交聯(lián)劑濃度及特異性好的PCR產(chǎn)物等［25－27］。不同的實(shí)驗(yàn)條件甚至可能導(dǎo)致完全不同的結(jié)果，因此在實(shí)驗(yàn)時(shí)要優(yōu)化好PCR－SSCP分析的條件。本研究中發(fā)現(xiàn)溫度對(duì)電泳條帶清晰度的影響很大，用冰浴電泳要比室溫下電泳效果好；合適的丙烯酰胺濃度在SSCP的分析中也是關(guān)鍵的，濃度太高，會(huì)分辨不出條帶，或者帶型很雜，難以對(duì)基因型進(jìn)行判斷；此外，染色和顯色對(duì)于SSCP的結(jié)果也有很大影響，在本研究中我們改進(jìn)了染色和顯色的步驟，使用0.1%AgNO3染色、2%NaOH顯色，效果較好而且步驟簡(jiǎn)單。在具體的實(shí)驗(yàn)操作中要根據(jù)不同的實(shí)驗(yàn)?zāi)康膬?yōu)化PCR－SSCP條件從而得到最佳的結(jié)果。

本研究對(duì)信陽(yáng)水牛GHRH基因第二外顯子進(jìn)行SSCP檢測(cè)，出現(xiàn)了不同的帶型，并結(jié)合測(cè)序的方法對(duì)GHRH 基因片段進(jìn)行遺傳變異檢測(cè)研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)了8個(gè)SNPs，表明在信陽(yáng)水牛群體中GHRH基因存在較為豐富的突變，這些突變可能對(duì)信陽(yáng)水牛的生長(zhǎng)發(fā)育有著重要影響，進(jìn)一步分析其與信陽(yáng)水牛重要經(jīng)濟(jì)性狀的相關(guān)性，可能會(huì)篩選到與經(jīng)濟(jì)狀相關(guān)的分子遺傳標(biāo)記，這些對(duì)信陽(yáng)水牛的遺傳育種改良以促進(jìn)水牛業(yè)的發(fā)展都將具有重要的意義。

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SNPs Detection of GHRHGene on the 2th Exon Region in Xinyang Buffalo

XU Yong－jie1，WU Hai－gang2，YAO Jin1，3，LIU Ying1，LIANG Xiao－juan1，MA Yun＊1

（1.College of Life Sciences，Xinyang Normal University，Xinyang，Henan，464000；2.Xinyang Agricultural College，Xinyang，Henan，464000；3.College of Life Sciences，Jiangsu University，Zhenjiang，Jiangsu，212023；）

【Objective】This study was aimed to detect the SNP of GHRHgene.【Method】The Genomic DNA was taken from 56Xinyang buffalo blood samples.PCR primers were designed according the sequence of GHRH gene（gi：194719389）.PCR－SSCP and DNA sequencing methods were used to detect the mutations.【Results】The results showed that there were six different band types in different individuals by PCR－SSCP analysis.8SNPs were detected，located at 4461bp （C→T mutation），4529bp （T→G mutation），4845bp（G→A mutation），5053bp（G→A mutation），5058bp（G→T mutation），respectively.【Conclusion】The results indicated that GHRHgene was polymorphic in Xinyang buffalo population.

Xinyang buffalo；GHRH gene；SNPs；PCR－SSCP

S823.2

A

1001－9111（2012）04－0001－05

2012－04－04

2012－04－16

河南省科技攻關(guān)項(xiàng)目（092300410010）；河南省高等學(xué)校骨干教師資助計(jì)劃

徐永杰（1980－），男，河南商城縣人，講師，主要從事動(dòng)物分子遺傳研究。

＊通訊作者：馬 云（1974－），男，寧夏平羅縣人，副教授，主要從事動(dòng)物分子遺傳育種研究。