朱宏芳， 韓 宇， 孟衛(wèi)衛(wèi)， 王榮富， 靳光遠(yuǎn)， 曹樹青

（1.合肥工業(yè)大學(xué) 生 物與食品工程學(xué)院，安徽 合 肥230009；2.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué) 生 物技術(shù)中心，安徽 合 肥 230036）

0 引 言

水稻是全球重要的糧食作物，環(huán)境中的氧化脅迫所造成的活性氧代謝紊亂對細(xì)胞的毒害使得全球水稻在產(chǎn)量、品質(zhì)上的下降及其經(jīng)濟(jì)損失是驚人的。如何有效地清除過多的活性氧，調(diào)節(jié)活性氧的產(chǎn)生與清除平衡，最大限度地降低活性氧的毒害作用，已成為當(dāng)今植物抗性機(jī)理研究的一個熱點(diǎn)［1－3］。

本文以鎮(zhèn)江農(nóng)科所選育優(yōu)質(zhì)品種鎮(zhèn)稻11號為對照，研究本實(shí)驗(yàn)室特有高光效水稻品種楊育粳1號在甲基紫精脅迫下的響應(yīng)，試圖闡明水稻對氧化脅迫的響應(yīng)調(diào)節(jié)機(jī)理。本研究不僅有助于揭示植物對活性氧的解毒機(jī)理，而且可以獲得抗氧化脅迫高產(chǎn)水稻品種［4－5］，為水稻高光效生理育種提供理論依據(jù)和技術(shù)途徑。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料及培養(yǎng)

實(shí)驗(yàn)材料為楊育粳1號（高光效水稻）和鎮(zhèn)稻11號（由江蘇鎮(zhèn)江農(nóng)科所提供）。

采用土培法，營養(yǎng)土配方為：V（蛭石）∶V（黑土）∶V（珍珠巖）＝9∶3∶0.5。播種于裝有營養(yǎng)土的花盆中，置于光周期為光照16h、黑暗8h，溫度為26～30℃、光照強(qiáng)度為800μmol／（m2·s）的條件下培養(yǎng)。

1.2 主要儀器

GN1152型電子天平由上海民橋精密科學(xué)儀器有限公司生產(chǎn)；752型紫外可見分光光度計由上海光譜儀器有限公司生產(chǎn)；臺式高速冷凍離心機(jī)由美國貝克曼庫爾特有限公司生產(chǎn)；BCD－186SY海爾可變溫冰箱由青島海爾集團(tuán)有限公司生產(chǎn)。

1.3 試劑

Revert AidTM First Strand cDNA Synthesis Kit K1621購于Fermentas公司；TakaRa Taq Polymerase（5U／μL），10×PCR buffer，dNTPs，PCR引物；其余均為國產(chǎn)試劑，分析純。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

本實(shí)驗(yàn)設(shè)0、1、5、20μmol／L 4個濃度的甲基紫精溶液，分別處理實(shí)驗(yàn)組和對照組，然后統(tǒng)計表型指標(biāo)株高和鮮重；測定生化指標(biāo)葉綠素質(zhì)量比、丙二醛含量；分析氧化脅迫相關(guān)基因的表達(dá)。

1.4.1 甲基紫精處理下植株表型統(tǒng)計

其中，Xi為植株主干高度；S2為根長方差。鮮重統(tǒng)計方法類似株高。

1.4.2 葉綠素質(zhì)量比的測定

w（葉綠素a）＝13.95A665－6.88A649；

w（葉綠素b）＝24.96A649－7.32A665，

w（葉綠素a、b）＝6.63A665－18.08A649。

1.4.3 丙二醛含量的測定

測定每g樣品鮮重中的丙二醛（MDA）的量（μmol），公式為：

MDA含量 ＝ ［6.452（A532－A600）－0.559A450］VtVs／Fw。

其中，Vt為提取液總體積；Vs為測定用提取液體積；Fw為樣品鮮重。

1.5 相關(guān)基因表達(dá)分析

Trizol法抽提水稻總RNA，合成全基因組cDNA，設(shè)計引物，RT－PCR擴(kuò)增目標(biāo)基因，瓊脂糖凝膠電泳檢測相關(guān)基因，分析電泳圖譜。

2 結(jié)果與分析

2.1 氧化脅迫對水稻幼苗的表型影響

甲基紫精是觸滅殺生性除草劑百草枯的主要成分［6］，具有強(qiáng)氧化性。不同處理下水稻的表型比較如圖1所示，由圖1可知，2種水稻材料的生長均受到氧化劑甲基紫精抑制，抑制作用隨甲基紫精濃度升高呈梯度增強(qiáng)。不同處理下幼苗株高和鮮重的比較如圖2所示。

圖1 不同處理下水稻的表型比較

圖2 不同處理下幼苗株高和鮮重比較

由圖2可以得出，鎮(zhèn)稻11號所受抑制作用要比楊育粳1號更為明顯。結(jié)果表明，經(jīng)甲基紫精處理的水稻幼苗，由于氧化劑所造成的氧化脅迫，使得植株體內(nèi)正常的活性氧代謝系統(tǒng)失衡，水稻幼苗積累了過多的活性氧（ROS），結(jié)果造成細(xì)胞損傷［7］，并且楊育粳1號對氧化脅迫的耐受性強(qiáng)于鎮(zhèn)稻11號。

不同處理下丙二醛含量比較如圖3所示，由圖3可知，植株中MDA含量隨甲基紫精濃度升高而遞增，并且相對光合速率較低的鎮(zhèn)稻11號植株體內(nèi)的丙二醛含量顯著升高。在甲基紫精溶液濃度為0、1、5、20μmol／L的條件下，與鎮(zhèn)稻11號相比，楊育粳1號的丙二醛含量分別減少了0.13%、8.13%、13.57%、22.94%。表明高光效水稻楊育粳1號對氧化脅迫具有較強(qiáng)的耐受性。

圖3 不同處理下丙二醛含量比較

2.2 甲基紫精對水稻葉綠素質(zhì)量比的影響

不同處理下葉綠素的質(zhì)量比如圖4所示。

圖4 不同處理下葉綠素質(zhì)量比的比較

從圖4可以看出，甲基紫精會使得葉綠素a和葉綠素b的質(zhì)量比減少，使得其光合速率降低，生產(chǎn)力降低，進(jìn)而會影響水稻的產(chǎn)量。而且，甲基紫精對鎮(zhèn)稻11號的抑制作用比楊育粳1號要強(qiáng)得多。在甲基紫精溶液為0、1、5、20μmol／L的條件下，葉綠素a的質(zhì)量比在楊育粳1號中分別是鎮(zhèn)稻11號的1.05、1.20、1.78、2.01倍；葉綠素b的質(zhì)量比是鎮(zhèn)稻11號的1.11、1.34、2.33、2.89倍。由此可見，高光效水稻楊育粳1號對氧化脅迫的耐受性較高。

2.3 植株幼苗中氧化脅迫相關(guān)基因的表達(dá)

活性氧解毒酶是活性氧解毒系統(tǒng)中具有高效專一性解毒作用的一類蛋白質(zhì)。主要包括超氧化物歧化酶（SOD）、抗壞血酸過氧化物酶（APX）、過氧化氫酶（CAT）等［8］。SOD的活性升高或降低，表現(xiàn)為植株對環(huán)境抗性的強(qiáng)弱。可以通過植物體內(nèi)SOD活性水平判斷其抗逆性及受脅迫的程度。同樣，若能夠使APX、CAT酶活性顯著升高，則可使超氧陰離子自由基（O2－）產(chǎn)生的速率顯著下降，脂質(zhì)過氧化作用極大地減弱。分別選擇SOD、APX及CAT家族的SODA1、APX2及CATB做相關(guān)基因分析，如圖5所示，圖5中，1為楊育粳1號，2為鎮(zhèn)稻11號。

由圖5可看出，三者mRNA表達(dá)量均隨甲基紫精濃度遞增呈梯度增加。且同一誘導(dǎo)濃度下SODA1的mRNA在楊育粳1號中的增加量明顯高于對照中的；5μmol／L甲基紫精誘導(dǎo)下楊育粳1號中APX2的mRNA表達(dá)量也高于鎮(zhèn)稻11號，CATB則差異不大。由此可見在甲基紫精梯度誘導(dǎo)下，2個品種中的SOD、APX、CAT活性不斷增強(qiáng)，并且高光效水稻中SOD的活性較對照呈現(xiàn)明顯的特異性增強(qiáng)，APX次之。據(jù)此推斷楊育粳1號的高光效與其體內(nèi)活性氧解毒酶的活性增強(qiáng)，清除體內(nèi)氧自由基及過氧化氫能力增加，對氧化脅迫耐受性提高有關(guān)。

圖5 相關(guān)基因表達(dá)分析

3 結(jié) 論

在濃度為20μmol／L甲基紫精下，楊育粳1號的表型特征與生化指標(biāo)明顯優(yōu)于鎮(zhèn)稻11號，并且凝膠成像分析表明，前者氧化脅迫相關(guān)基因SODA1、APX2的表達(dá)量明顯高于后者，說明其高光合效率與編碼自身活性氧平衡系統(tǒng)中抗氧化酶的基因活性增加有關(guān)。

［1］ Inze D，Montagu M V.Oxidative stress in plants curr opin［J］.Plant Biotech，1995，6：153－158.

［2］ Blokina O，Virolainen E，F(xiàn)agerstedt K V.Antioxidants，oxidative damage and oxygen deprivation stress：a review［J］.Anna Bot，2003，91：179－194.

［3］ Dat J，Vandenabeele S，Vranova E，et al.Dual action of the active oxygen species during plant stress responses［J］.Cell Mol Life Sci，2000，57：779－795.

［4］ Winicov I.New molecular approaches to improving salt tolerance in crop plants［J］.Anna Bot，1988，82：703－710.

［5］ 梁麗君，劉福田，朱思成，等.紫精自由基締合行為的ESR研究［J］.山東師范大學(xué)學(xué)報：自然科學(xué)版，1997，12（4）：460－462.

［6］ Mittler R.Oxidative stress antioxidants and stress tolerance trends［J］.Plant Sci，2002（7）：405－410.

［7］ Catolluceio C，Paganga G，Melikian N.Antioxidant potential of intermediates in phenylpropanoid metabolism in higher plants［J］.FEBS Lefft，1995，368：188－192.

［8］ Hsieh T H，Lee J T，Yang P T，et al.Heterology expression of the arabidopsis C－repeat／dehydration response element binding factor 1gene confers elevated tolerance to chilling and oxidative stresses in transgenic tomato［J］.Plant Physiol，2002，129：1086－1094.