朱宏芳， 韓 宇， 孟衛(wèi)衛(wèi)， 王榮富， 靳光遠(yuǎn)， 曹樹青

（1.合肥工業(yè)大學(xué) 生 物與食品工程學(xué)院，安徽 合 肥230009；2.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué) 生 物技術(shù)中心，安徽 合 肥 230036）

0 引 言

水稻是全球重要的糧食作物，環(huán)境中的氧化脅迫所造成的活性氧代謝紊亂對細(xì)胞的毒害使得全球水稻在產(chǎn)量、品質(zhì)上的下降及其經(jīng)濟(jì)損失是驚人的。如何有效地清除過多的活性氧，調(diào)節(jié)活性氧的產(chǎn)生與清除平衡，最大限度地降低活性氧的毒害作用，已成為當(dāng)今植物抗性機(jī)理研究的一個(gè)熱點(diǎn)［1－3］。

本文以鎮(zhèn)江農(nóng)科所選育優(yōu)質(zhì)品種鎮(zhèn)稻11號(hào)為對照，研究本實(shí)驗(yàn)室特有高光效水稻品種楊育粳1號(hào)在甲基紫精脅迫下的響應(yīng)，試圖闡明水稻對氧化脅迫的響應(yīng)調(diào)節(jié)機(jī)理。本研究不僅有助于揭示植物對活性氧的解毒機(jī)理，而且可以獲得抗氧化脅迫高產(chǎn)水稻品種［4－5］，為水稻高光效生理育種提供理論依據(jù)和技術(shù)途徑。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料及培養(yǎng)

實(shí)驗(yàn)材料為楊育粳1號(hào)（高光效水稻）和鎮(zhèn)稻11號(hào)（由江蘇鎮(zhèn)江農(nóng)科所提供）。

采用土培法，營養(yǎng)土配方為：V（蛭石）∶V（黑土）∶V（珍珠巖）＝9∶3∶0.5。播種于裝有營養(yǎng)土的花盆中，置于光周期為光照16h、黑暗8h，溫度為26～30℃、光照強(qiáng)度為800μmol／（m2·s）的條件下培養(yǎng)。

1.2 主要儀器

GN1152型電子天平由上海民橋精密科學(xué)儀器有限公司生產(chǎn)；752型紫外可見分光光度計(jì)由上海光譜儀器有限公司生產(chǎn)；臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)由美國貝克曼庫爾特有限公司生產(chǎn)；BCD－186SY海爾可變溫冰箱由青島海爾集團(tuán)有限公司生產(chǎn)。

1.3 試劑

Revert AidTM First Strand cDNA Synthesis Kit K1621購于Fermentas公司；TakaRa Taq Polymerase（5U／μL），10×PCR buffer，dNTPs，PCR引物；其余均為國產(chǎn)試劑，分析純。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

本實(shí)驗(yàn)設(shè)0、1、5、20μmol／L 4個(gè)濃度的甲基紫精溶液，分別處理實(shí)驗(yàn)組和對照組，然后統(tǒng)計(jì)表型指標(biāo)株高和鮮重；測定生化指標(biāo)葉綠素質(zhì)量比、丙二醛含量；分析氧化脅迫相關(guān)基因的表達(dá)。

1.4.1 甲基紫精處理下植株表型統(tǒng)計(jì)

其中，Xi為植株主干高度；S2為根長方差。鮮重統(tǒng)計(jì)方法類似株高。

1.4.2 葉綠素質(zhì)量比的測定

w（葉綠素a）＝13.95A665－6.88A649；

w（葉綠素b）＝24.96A649－7.32A665，

w（葉綠素a、b）＝6.63A665－18.08A649。

1.4.3 丙二醛含量的測定

測定每g樣品鮮重中的丙二醛（MDA）的量（μmol），公式為：

MDA含量 ＝ ［6.452（A532－A600）－0.559A450］VtVs／Fw。

其中，Vt為提取液總體積；Vs為測定用提取液體積；Fw為樣品鮮重。

1.5 相關(guān)基因表達(dá)分析

Trizol法抽提水稻總RNA，合成全基因組cDNA，設(shè)計(jì)引物，RT－PCR擴(kuò)增目標(biāo)基因，瓊脂糖凝膠電泳檢測相關(guān)基因，分析電泳圖譜。

2 結(jié)果與分析

2.1 氧化脅迫對水稻幼苗的表型影響

甲基紫精是觸滅殺生性除草劑百草枯的主要成分［6］，具有強(qiáng)氧化性。不同處理下水稻的表型比較如圖1所示，由圖1可知，2種水稻材料的生長均受到氧化劑甲基紫精抑制，抑制作用隨甲基紫精濃度升高呈梯度增強(qiáng)。不同處理下幼苗株高和鮮重的比較如圖2所示。

圖1 不同處理下水稻的表型比較

圖2 不同處理下幼苗株高和鮮重比較

由圖2可以得出，鎮(zhèn)稻11號(hào)所受抑制作用要比楊育粳1號(hào)更為明顯。結(jié)果表明，經(jīng)甲基紫精處理的水稻幼苗，由于氧化劑所造成的氧化脅迫，使得植株體內(nèi)正常的活性氧代謝系統(tǒng)失衡，水稻幼苗積累了過多的活性氧（ROS），結(jié)果造成細(xì)胞損傷［7］，并且楊育粳1號(hào)對氧化脅迫的耐受性強(qiáng)于鎮(zhèn)稻11號(hào)。

不同處理下丙二醛含量比較如圖3所示，由圖3可知，植株中MDA含量隨甲基紫精濃度升高而遞增，并且相對光合速率較低的鎮(zhèn)稻11號(hào)植株體內(nèi)的丙二醛含量顯著升高。在甲基紫精溶液濃度為0、1、5、20μmol／L的條件下，與鎮(zhèn)稻11號(hào)相比，楊育粳1號(hào)的丙二醛含量分別減少了0.13%、8.13%、13.57%、22.94%。表明高光效水稻楊育粳1號(hào)對氧化脅迫具有較強(qiáng)的耐受性。

圖3 不同處理下丙二醛含量比較

2.2 甲基紫精對水稻葉綠素質(zhì)量比的影響

不同處理下葉綠素的質(zhì)量比如圖4所示。

圖4 不同處理下葉綠素質(zhì)量比的比較

從圖4可以看出，甲基紫精會(huì)使得葉綠素a和葉綠素b的質(zhì)量比減少，使得其光合速率降低，生產(chǎn)力降低，進(jìn)而會(huì)影響水稻的產(chǎn)量。而且，甲基紫精對鎮(zhèn)稻11號(hào)的抑制作用比楊育粳1號(hào)要強(qiáng)得多。在甲基紫精溶液為0、1、5、20μmol／L的條件下，葉綠素a的質(zhì)量比在楊育粳1號(hào)中分別是鎮(zhèn)稻11號(hào)的1.05、1.20、1.78、2.01倍；葉綠素b的質(zhì)量比是鎮(zhèn)稻11號(hào)的1.11、1.34、2.33、2.89倍。由此可見，高光效水稻楊育粳1號(hào)對氧化脅迫的耐受性較高。

2.3 植株幼苗中氧化脅迫相關(guān)基因的表達(dá)

活性氧解毒酶是活性氧解毒系統(tǒng)中具有高效專一性解毒作用的一類蛋白質(zhì)。主要包括超氧化物歧化酶（SOD）、抗壞血酸過氧化物酶（APX）、過氧化氫酶（CAT）等［8］。SOD的活性升高或降低，表現(xiàn)為植株對環(huán)境抗性的強(qiáng)弱。可以通過植物體內(nèi)SOD活性水平判斷其抗逆性及受脅迫的程度。同樣，若能夠使APX、CAT酶活性顯著升高，則可使超氧陰離子自由基（O2－）產(chǎn)生的速率顯著下降，脂質(zhì)過氧化作用極大地減弱。分別選擇SOD、APX及CAT家族的SODA1、APX2及CATB做相關(guān)基因分析，如圖5所示，圖5中，1為楊育粳1號(hào)，2為鎮(zhèn)稻11號(hào)。

由圖5可看出，三者mRNA表達(dá)量均隨甲基紫精濃度遞增呈梯度增加。且同一誘導(dǎo)濃度下SODA1的mRNA在楊育粳1號(hào)中的增加量明顯高于對照中的；5μmol／L甲基紫精誘導(dǎo)下楊育粳1號(hào)中APX2的mRNA表達(dá)量也高于鎮(zhèn)稻11號(hào)，CATB則差異不大。由此可見在甲基紫精梯度誘導(dǎo)下，2個(gè)品種中的SOD、APX、CAT活性不斷增強(qiáng)，并且高光效水稻中SOD的活性較對照呈現(xiàn)明顯的特異性增強(qiáng)，APX次之。據(jù)此推斷楊育粳1號(hào)的高光效與其體內(nèi)活性氧解毒酶的活性增強(qiáng)，清除體內(nèi)氧自由基及過氧化氫能力增加，對氧化脅迫耐受性提高有關(guān)。

圖5 相關(guān)基因表達(dá)分析

3 結(jié) 論

在濃度為20μmol／L甲基紫精下，楊育粳1號(hào)的表型特征與生化指標(biāo)明顯優(yōu)于鎮(zhèn)稻11號(hào)，并且凝膠成像分析表明，前者氧化脅迫相關(guān)基因SODA1、APX2的表達(dá)量明顯高于后者，說明其高光合效率與編碼自身活性氧平衡系統(tǒng)中抗氧化酶的基因活性增加有關(guān)。

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