劉東明， 束長龍， 宋福平， 高繼國， 張 杰

（1．東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)院，哈爾濱 150030；2．中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，植物病蟲害生物學(xué)國家重點實驗室，北京 100193）

蘇云金芽胞桿菌（Bacill us thuringiensis，簡稱Bt）是一種革蘭氏陽性細(xì)菌，在形成芽胞的同時能產(chǎn)生由cr y與cyt基因編碼的、對多種害蟲具有高毒力的殺蟲晶體蛋白（insecticidal cr ystal pr otein，簡稱ICP）。由于其對害蟲特異的殺蟲活性，對人畜無害且不污染環(huán)境等優(yōu)點，Bt已經(jīng)成為最為有效的微生物殺蟲劑，廣泛應(yīng)用于害蟲的生物防治［1］。分離新型高效的Bt菌株與殺蟲基因?qū)M(jìn)一步開發(fā)Bt殺蟲劑與轉(zhuǎn)基因作物有重要的意義。

Bt廣泛存在于自 然界中，從 土壤［2－3］、水源［4－6］、昆蟲尸體［7］、野生動物［8－11］、植物表面［12］等都可以分離出Bt。其中，土壤作為微生物生存的最佳介質(zhì)，是Bt菌株最直接的來源，并且樣品采集地的氣候、植被也會影響到Bt菌株分布［13］。因此，從不同氣候、地域特征的生態(tài)環(huán)境中采集土壤樣品，有利于篩選到類型多樣的Bt菌株。

蘇云金芽胞桿菌休眠的芽胞在75℃的亞致死溫度下處理15 min，活化效果最好［14］，依據(jù)這一特性采用溫度篩選分離Bt具有分離范圍廣，不易漏篩等優(yōu)點。獲得的大量Bt野生菌株根據(jù)大質(zhì)粒圖譜進(jìn)行分型，質(zhì)粒圖譜是菌株含有的質(zhì)粒的瓊脂糖凝膠電泳條帶，與菌株含有的質(zhì)粒數(shù)量、大小以及拷貝數(shù)都有關(guān)，可以作為區(qū)分不同菌株的證據(jù)［15］。采用PCR－RFLP方法鑒定Bt的殺蟲基因，不但具有快速、簡便的優(yōu)點，而且既可鑒定出已知的基因又可檢測出未知的新基因，因此PCR－RFLP鑒定體系獲得了廣泛的應(yīng)用［16－18］。

北京植物園位于北京西山風(fēng)景區(qū)，占地400 h m2，收集展示各類植物10 000余種（含品種）150余萬株，在園內(nèi)形成以植物類型劃分?jǐn)?shù)十種小園區(qū)，形成了特殊的小型生態(tài)環(huán)境。本文從北京植物園不同園區(qū)收集了149份土壤樣本，進(jìn)一步通過Bt菌株的分離、基因型鑒定以及殺蟲活性測定等工作，研究了這種特殊的小型生態(tài)環(huán)境中Bt菌株的多樣性與殺蟲活性。

1 材料與方法

1．1 土樣采集與菌株分離

從北京植物園的不同園區(qū)距表層5～10 c m之間的土層采集土壤樣品，采用溫度法［14］篩選Bt菌株，鏡檢觀察后畫線培養(yǎng)、分離保存。Bt標(biāo)準(zhǔn)菌株庫斯塔克亞種（B．thuringiensis subsp．kurstaki）HD－1基因類型為cr y1Ac、cr y2Aa、cr y2Ab，庫斯塔克亞種HD－73基因類型cry1 Ac，2株菌株均由實驗室保存。

1．2 蘇云金芽胞桿菌晶體類型觀察

顯微鏡樣品制備：將胞晶混合液滴于載玻片上，涂抹均勻，烘干固定，石炭酸復(fù)紅染液染色3 min，清水沖洗，100×油鏡進(jìn)行鏡檢，石炭酸復(fù)紅染液配制方法參見文獻(xiàn)［19］。

掃描電鏡樣品制備：將Bt菌株在1／2 LB平板上畫線培養(yǎng)，30℃培養(yǎng)36 h，產(chǎn)生晶體。刮菌，滅菌水洗3次，12 000 r／min，10 min離心收集芽胞和晶體。用1 mL滅菌水懸浮。將菌液均勻涂于1 c m2薄玻璃片上，晾干。離子濺射噴金（2 n m），掃描電鏡觀察。

1．3 蘇云金芽胞桿菌質(zhì)粒圖譜制備

提取Bt分離株的質(zhì)粒DNA，質(zhì)粒DNA提取方法、電泳方法參見文獻(xiàn)［20］。

1．4 蘇云金芽胞桿菌基因型的鑒定

采用PCR－RFLP的方法對cr y基因型進(jìn)行鑒定。其中cr y1 基因鑒定方法參照文獻(xiàn)［21－22］；cr y2、cr y3、cr y4／cr y10 基因 鑒定方法參見文 獻(xiàn)［23］；cr y5～9基因鑒定方法參見文獻(xiàn)［24］；cry11～cr y40基因鑒定引物參見文獻(xiàn)［25］。

1．5 蘇云金芽胞桿菌晶體蛋白的分析

SDS－PAGE分析方法參見文獻(xiàn)［26］。

1．6 室內(nèi)殺蟲活性測定

1．6．1 大猿葉甲

將菌株樣品培養(yǎng)，鏡檢發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生晶體后，取Bt原培養(yǎng)液10 mL離心去上清，用10 mL滅菌水重懸，另取10 mL滅菌水作為對照，樣品均勻涂布在新鮮的油菜葉上，晾干，放入生測瓶中，每瓶接初孵幼蟲20頭，每個處理重復(fù)3次，25℃生化培養(yǎng)箱中保溫，培養(yǎng)48 h后調(diào)查死、活蟲數(shù)，并觀察幼蟲取食情況，計算校正死亡率。試蟲的選取參見文獻(xiàn)［27］。

1．6．2 小菜蛾

菌株樣品培養(yǎng)與處理同1．6．1，另取10 mL滅菌水作為對照，樣品均勻涂布在新鮮的甘藍(lán)菜葉上，晾干，放入生測瓶中，每瓶接2～3齡幼蟲20頭，每個處理重復(fù)3次，25℃生化培養(yǎng)箱中保溫，培養(yǎng)48 h后調(diào)查死、活蟲數(shù)，并觀察幼蟲取食情況，計算校正死亡率。

2 結(jié)果與分析

2．1 菌株分離與晶體形態(tài)

利用溫度篩選法，共篩選出542株芽胞桿菌，進(jìn)一步染色鏡檢顯示，其中147株含有晶體，為Bt菌株，各園區(qū)土樣分離菌株信息見圖1。這些菌株含有的晶體類型包括大菱形、小菱形、球形、方形和不規(guī)則形等。進(jìn)一步挑選代表性菌株進(jìn)行掃描電鏡拍照觀察，結(jié)果見圖2。

2．2 蘇云金芽胞桿菌質(zhì)粒圖譜分析

通過分析北京植物園中所分離出的147株Bt菌株的質(zhì)粒圖譜，對其結(jié)果進(jìn)行比對，把帶型相同的菌株進(jìn)行歸類，最后得到12種類型的Bt菌株（圖3），將其代表菌株命名為Z WY－1～Z WY－12。12株分離株與2株標(biāo)準(zhǔn)菌株的質(zhì)粒圖譜比對，發(fā)現(xiàn)北京植物園篩選的Bt菌株帶型豐富多樣。

圖3 Bt菌株質(zhì)粒圖譜分析

2．3 Bt菌株的cry基因型鑒定

采用PCR－RFLP方法，對12株Bt進(jìn)行了cry基因的鑒定，結(jié)果見表2。結(jié)果表明：有6種類型的Bt菌株鑒定出了已知基因類型，而其他6種不含有已知基因型；鑒定出的基因型有cr y1Aa、cr y1Ab、cr y1Ac、cry1Ah、cry1Ba、cr y1Be、cry1Ia、cry1La、cry2Ab、cr y7Aa；沒有檢測出cr y3～cr y6、cr y8～cr y40等基因。

2．4 殺蟲晶體蛋白的SDS－PAGE分析

通過SDS－PAGE分析了12株Bt所表達(dá)的Cry蛋白分子量，結(jié)果見圖4，列于表2。其中Z WY－5表達(dá)約70 ku的蛋白，Z WY－11、12表達(dá)約150 ku的蛋白，其余都表達(dá)約130 ku的蛋白，ZWY－1、3、8還表達(dá)了60 ku的蛋白。

圖4 分離菌株殺蟲晶體蛋白SDS－PAGE電泳分析

2．5 小菜蛾、大猿葉甲的生物活性測定

小菜蛾和大猿葉甲的測定結(jié)果見表2，其中Z WY－1、3、4、6、8、9對鱗翅目菜蛾科小菜蛾的校正死亡率達(dá)到了100%，ZWY－4、7對鞘翅目葉甲科大猿葉甲有較好活性。

表2 分離菌株cr y基因型鑒定及殺蟲生測結(jié)果1）

3 討論

近幾年來，國內(nèi)很多學(xué)者從我國不同地域的土壤中分離到高毒力的Bt菌株，如束長龍等人在北京、海南、福建、甘肅等地的土壤樣品中分離到對小地老虎有高活力的菌株［28］；胡曉婷等人在河北、山東等地的土壤樣品中分離到對銅綠麗金龜幼蟲有活性的Bt菌株［29］；張靈玲等人在武夷山自然保護(hù)區(qū)的土壤樣品中分離到對白紋伊蚊有很高活性的Bt菌株［30］。

北京植物園具有多種高度人工化的小型生態(tài)環(huán)境，在這種環(huán)境下分析Bt菌株的多樣性與分布特點的研究工作尚屬首次。本文從北京植物園分離得到147株Bt菌株，分離率很高，進(jìn)一步的質(zhì)粒圖譜分析顯示這些菌株屬于12種不同的類型，并且其表達(dá)蛋白、基因類型以及晶體形態(tài)都有較好的多樣性。值得注意的是，菌株類型在植物園的各園區(qū)分布上有較強(qiáng)的園區(qū)特異性：宿根園、芍藥園、月季園、碉樓中有多種類型Bt菌株分布；而Z WY－9只在棧道入口有分布，Z WY－10只在臥佛山莊中分布。這種現(xiàn)象可能與植被類型及人類活動有關(guān)：宿根園、芍藥園和月季園的植物花朵艷麗、氣味芬芳，有利于吸引昆蟲，而碉樓處于植物園較偏僻的區(qū)域，附近缺乏觀賞性強(qiáng)的植物種類，人為的活動較少，適合昆蟲棲息繁殖，因而這幾個區(qū)域昆蟲種類、數(shù)量較多，有利于Bt菌株的擴(kuò)繁，進(jìn)而有較好的多樣性。由此可見，為了分離到多樣性較好Bt菌株，采集樣品時，不僅要考慮生態(tài)環(huán)境、人為活動的影響，植被類型的多樣性也是非常重要的決定因素。

本研究中檢測到的基因類型有cry1Aa、cr y1Ab、cr y1 Ac、cr y1 Ah、cr y1 Ba、cr y1Be、cr y1Ia、cr y1La、cr y2Ab與cr y7Aa等，SDS－PAGE結(jié)果顯示含有上述基因類型的菌株有60 ku與130 ku的蛋白條帶，其中130 ku的蛋白條帶屬于cr y1A、cr y1B、cr y1L 以及cr y7等基因的編碼產(chǎn)物，60 ku屬于cry2類基因的編碼產(chǎn)物，但是沒有檢測到81 ku的cr y1I類基因編碼的蛋白，說明這些菌株中的cr y1I類基因與其他已報道的基因相同，是沉默基因［20］。

在鑒定過程中有6種類型的Bt菌株沒有檢測到常見的cr y基因型，而掃描電鏡檢測可以確定其產(chǎn)生規(guī)則的晶體，SDS－PAGE分析其大量表達(dá)70、130、150 ku的蛋白，說明這些菌株含有的基因類型與目前常見的高毒基因不同。而其中的Bt菌株Z WY－7和Z WY－9分別對鞘翅目大猿葉甲和鱗翅目小菜蛾具有較好的殺蟲活性，說明這兩株菌株中可能含有新型高效的殺蟲基因。目前這兩株菌正在進(jìn)行全基因組測序，這對分離新型高效的殺蟲基因有重要的意義。

本研究通過對北京植物園各園區(qū)分離的菌株進(jìn)行分型、基因鑒定、殺蟲蛋白類型分析、活性分析，不僅得到新型高效的Bt菌株，還系統(tǒng)地分析了菌株分布與園區(qū)植被類型的關(guān)系。研究成果不僅為新型殺蟲基因的發(fā)掘提供了優(yōu)質(zhì)材料，而且為進(jìn)一步的樣品采集提供了參考依據(jù)。

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