楊 菲， 吳茂森， 陳華民， 田 芳， 曲 玲， 曹雅忠， 何晨陽＊

（1．中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，植物病蟲害生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100193；2．寧夏農(nóng)林科學(xué)院，國家枸杞工程技術(shù)研究中心，銀川 750002）

麥類黃矮病是一種分布廣泛、危害嚴(yán)重的禾谷類病毒病，由蚜蟲攜帶大麥黃矮病毒進(jìn)行傳播。國外于1951年首次報(bào)道，發(fā)生在美國加利福尼亞州大麥上［1］。1960年在我國陜西、甘肅的小麥上發(fā)現(xiàn)。1966－1999年間，由于蚜蟲介體的猖獗，在我國北方冬春麥產(chǎn)區(qū)多次造成病毒病流行，損失極大［2－5］。

我國小麥黃矮病以減少蚜蟲數(shù)量和選育推廣抗性品種為主要防治途徑［6］，因此對蚜蟲進(jìn)行預(yù)測預(yù)報(bào)十分重要。成卓敏等于1992年報(bào)道了在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)對蚜蟲飼毒，成功進(jìn)行單頭蚜蟲帶毒檢測的試驗(yàn)［7］，但目前還沒有對田間蚜蟲帶毒情況進(jìn)行檢測研究的報(bào)道。本研究以我國小麥黃矮病重病區(qū)和非重病區(qū)小麥抽穗期的麥蚜為研究對象，運(yùn)用RTPCR方法檢測單頭蚜蟲攜帶大麥黃矮病毒的情況，明確我國不同地區(qū)田間蚜蟲帶毒率的差異，為闡明田間蚜蟲帶毒率與小麥黃矮病發(fā)病情況的關(guān)系提供依據(jù)。

1 材料與方法

1．1 材料

蚜蟲樣本分別采自我國小麥主產(chǎn)地山西、甘肅、青海、陜西、河南和河北等地區(qū)黃矮病重病區(qū)和非重病區(qū)小麥田間植株。PCR引物由Invitr ogen公司合成。RNA提取試劑Trizol、Super Script?Ⅲ反轉(zhuǎn)錄酶購自北京Invitrogen公司，RNase抑制劑、d NTPs購自Ta Ka Ra公司，其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1．2 方法

1．2．1 RNA提取

離心管中放入單頭蚜蟲，在液氮冷凍條件下用玻璃棒研碎，加入400μL Trizol試劑進(jìn)行萃取，80μL氯仿用于抽提，加入大于上清體積60% 的異丙醇沉淀RNA，沉淀經(jīng)75%乙醇洗滌風(fēng)干后，溶于適量DEPC水，立即進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄或置于－80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1．2．2 引物設(shè)計(jì)

根據(jù)GenBank中BYDV－GAV外殼蛋白基因序列比較設(shè)計(jì)合成一對特異引物，GAVCP 1：5′－AGTTCGGAGAATGGTTGTGG－3′；GAVCP 2：5′－TTGTAACGGTGGTAGGACTTG－3′。

1．2．3 RT－PCR

參照Super Script?反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行總RNA反轉(zhuǎn)錄，獲得c DNA。

以2μL c DNA為模板，依次加入10×緩沖液2．5μL，d NTPs（2．5 mmol／L）1．0μL，上下游引物（10μmol／L）各0．5μL，Taq酶（2．5 U／μL）0．5μL，dd H2O補(bǔ)足反應(yīng)體積至25μL。擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃，3 min；（94℃30 s，61℃30 s，72℃1 min）×32個(gè)循環(huán)。

1．2．4 RT－PCR靈敏度測定

為確保檢測結(jié)果的靈敏度和可靠性，選擇已知的單頭帶毒蚜蟲c DNA樣品系列稀釋后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，電泳檢測體系的靈敏度與特異性。

1．2．5 RT－PCR檢測蚜蟲帶毒率

于小麥抽穗期分別從山西、甘肅、青海、陜西、河南和河北等地麥田采集BYDV－GAV介體蚜蟲麥二叉蚜及麥長管蚜，每個(gè)采樣點(diǎn)取蚜蟲200頭，分別提取RNA，參照1．2．3的方法進(jìn)行 RT－PCR分析，計(jì)算蚜蟲帶毒率。

2 結(jié)果與分析

2．1 檢測體系靈敏度測定

對單頭帶毒蚜蟲c DNA樣品系列稀釋后的PCR結(jié)果進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析，結(jié)果表明（圖1），c DNA模板稀釋200倍時(shí)，仍可見清晰的特異擴(kuò)增條帶，并且為唯一擴(kuò)增產(chǎn)物，經(jīng)序列測定，確定與GAV外殼蛋白基因序列一致。表明所建立的檢測體系具有較高的靈敏度和特異性，測定樣本用量可少至1／200頭蚜蟲。

圖1 RT－PCR靈敏度檢測結(jié)果

2．2 蚜蟲帶毒率測定

對采自不同麥區(qū)的蚜蟲樣本進(jìn)行RT－PCR檢測，從圖2的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果可見，蚜蟲樣本PCR擴(kuò)增條帶清晰特異，與陽性對照大小一致。蚜蟲帶毒率測定的統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，不同地區(qū)麥田蚜蟲帶毒率存在明顯差異（表1），采集自重病區(qū)小麥田的蚜蟲具有較高的帶毒率，山西汾陽和甘肅渭源的發(fā)病麥田蚜蟲的帶毒率達(dá)到了90%以上；發(fā)病稍輕的陜西楊凌麥田蚜蟲帶毒率也達(dá)到了56%；其他重病區(qū)麥田蚜蟲帶毒率均在70%以上。對非重病區(qū)的河南和河北小麥田蚜蟲檢測結(jié)果，帶毒率顯著較低，表明小麥田間蚜蟲帶毒率與小麥黃矮病發(fā)生嚴(yán)重度具有直接的相關(guān)性。

圖2 各地區(qū)蚜蟲帶毒情況檢測結(jié)果

表1 各地區(qū)蚜蟲帶毒率統(tǒng)計(jì)結(jié)果

3 結(jié)論與討論

本研究通過設(shè)計(jì)BYDV－GAV特異引物，建立了田間單頭蚜蟲攜帶小麥黃矮病病毒的RT－PCR檢測方法。該方法具有較高的靈敏度和特異性，測定樣本用量可少至1／200頭蚜蟲。與成卓敏等人測定樣本用量少至1／20頭蚜蟲［7］相比，本方法具有更高的靈敏度。

為明確我國不同地區(qū)麥蚜攜帶BYDV－GAV比率的差異，本研究利用上述方法對采自不同麥區(qū)的小麥蚜蟲攜帶小麥黃矮病病毒的情況進(jìn)行了檢測。發(fā)現(xiàn)采自重病區(qū)的麥蚜帶毒率高，而非重病區(qū)則帶毒率低。因此，蚜蟲帶毒率的高低與當(dāng)?shù)匦←滭S矮病發(fā)生嚴(yán)重度呈正相關(guān)性。此檢測體系可成功應(yīng)用于田間蚜蟲攜帶小麥黃矮病病毒的檢測，并可進(jìn)一步用于田間蚜蟲群體帶毒率與黃矮病發(fā)病率關(guān)系的定量分析。由于除氣象因素外，越冬和早春蚜蟲數(shù)量及有蚜株率也都是黃矮病流行與否的關(guān)鍵因素［8］，因此可將此體系應(yīng)用于對越冬和早春田間蚜蟲樣本攜帶大麥黃矮病毒的檢測，從而為小麥黃矮病的預(yù)測預(yù)報(bào)提供科學(xué)依據(jù)。

在本研究工作的基礎(chǔ)上，后續(xù)試驗(yàn)正在利用RT－Q－PCR技術(shù)，定量檢測單頭蚜蟲攜帶的病毒量、不同飼毒時(shí)間蚜蟲帶毒量的變化，闡明單頭蚜蟲帶毒量與成功傳毒的關(guān)系。

［1］ Oswald J W，Houston B R．A new virus disease of cereals trans mitted by aphid［J］．Plant Disease Report，1951，35：471－475．

［2］ 周廣和，成卓敏，張向才，等．麥類病毒病及其防治［M］．上海：上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，1987：8．

［3］ 張鴻杰，徐建兵．1999年小麥黃矮病流行原因及其防治對策［J］．小麥研究，2000，21（3）：33－35．

［4］ 趙多長．天水市1999年小麥黃矮病流行原因分析與綜防對策［J］．甘肅農(nóng)業(yè)科技，2000（4）：38－39．

［5］ 王小明．秦安縣1999年小麥黃矮病發(fā)生情況調(diào)查［J］．甘肅農(nóng)業(yè)科技，2000（5）：35－36．

［6］ 謝皓，陳孝．我國抗黃矮病小麥研究進(jìn)展［J］．北京農(nóng)學(xué)院學(xué)報(bào)，1999，14（2）：55－57．

［7］ 成卓敏，Waterhouse P M，王立陽，等．應(yīng)用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法檢測攜帶大麥黃矮病毒的單頭蚜蟲［J］．病毒學(xué)報(bào)，1992，8（1）：80－84．

［8］ 相建業(yè)，馮崇川．小麥黃矮病預(yù)測預(yù)報(bào)［J］．植物保護(hù)學(xué)報(bào)，1994，21（1）：73－78．