殷幼平， 吳瑜佳， 于 紅， 李 蒙， 王中康

（重慶大學生物工程學院基因研究中心，重慶 400030）

柑橘潰瘍?。–itr us bacterial canker disease，CBCD）是一種由柑橘黃單胞菌（Xanthomonas citri pv．citri，Xcc）所引起的，危害全世界柑橘種植業(yè)最嚴重的檢疫性細菌病害［1］。該病能侵染多種蕓香科植物，包括柑橘屬的絕大多數(shù)商品化栽培品種。此病主要隨罹病種苗等繁殖材料遠距離傳播，發(fā)病嚴重時往往導致樹勢衰退，枯枝落葉、果實上布滿病斑、品質(zhì)變劣甚至未熟先落，嚴重影響柑橘的產(chǎn)量和質(zhì)量。由于抗病品種和特效藥劑的匱乏，對于感病植株仍然沿用挖除病樹集中燒毀的鏟除方法。目前對該病的防控主要依靠加強植物檢疫檢測，早期診斷病害，切斷傳播途徑。目前，常用的針對柑橘潰瘍病的檢測方法主要包括免疫檢測和分子檢測，免疫檢測主要有酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）和斑點免疫結(jié)合法（DIA），分子檢測主要包括常規(guī)PCR檢測和熒光定量 PCR檢測［2－3］，其中 ELISA 檢測和 DIA檢測操作步驟繁瑣、檢測時間較長，常規(guī)PCR檢測和熒光定量PCR檢測雖然靈敏度較高，但需要專門的儀器設備，這幾種檢測方法都無法適應基層檢驗檢疫部門的需要。隨著我國經(jīng)濟快速發(fā)展，柑橘產(chǎn)品的調(diào)運和交換更加頻繁，人為傳播的危險性急劇加大，在這樣的形勢下迫切需要更加快速簡便的病害現(xiàn)場診斷方法。膠體金免疫技術(shù)（ICG）是以膠體金作為示蹤標記物［4－6］，應用于抗原抗體反應的一種新型免疫標記技術(shù)。膠體金溶液是指分散相粒子直徑在1～150 n m之間的金溶膠顆粒，依據(jù)顆粒大小的不同顏色呈橘紅色到紫紅色。膠體金顆粒能迅速而穩(wěn)定地吸附生物大分子，而不改變其生物活性，它可以作為探針進行細胞表面和細胞內(nèi)精確定位；也可以用于日常的免疫診斷。其優(yōu)點是快速、靈敏、特異性強、穩(wěn)定性好，且操作簡便、無需任何儀器設備，結(jié)果判斷直觀可靠、易被基層人員掌握等。因而在電鏡［7－8］、免疫印跡［9－10］、體外診斷 試 劑 盒［11－13］的 制 造、藥 物 殘 留［14－16］、臨 床 診斷［17－18］等領域都得到了廣泛應用。膠體金免疫層析技術(shù)應用于植物病害檢測起步雖晚，但作為一種新型的免疫研究技術(shù)發(fā)展很快，具有極大的發(fā)展?jié)摿蛻们熬?。利用膠體金示蹤結(jié)合電鏡技術(shù)探討植物病害感病致病機理方面：利用該方法研究過水稻內(nèi)生細菌、玉米矮花葉病毒、甜菜壞死黃脈病毒的侵染部位、葡萄扇葉病毒移動蛋白、稻瘟病附著胞的形成和穿透過程［19－21］。在植物病害檢測方面，出現(xiàn)了黃龍病菌膠體金快速診斷試劑盒［22］；魏梅生［23－24］利用膠體金免疫層析法檢測馬鈴薯X病毒和馬鈴薯Y病毒以及煙草環(huán)斑病毒，隨后又進一步開發(fā)銀加強法。本研究針對現(xiàn)有檢測技術(shù)難以應用于基層、田間柑橘潰瘍病菌診斷的缺陷，利用重慶大學基因工程研究中心前期篩選的多克隆抗體、重組抗體，制備并比較單抗與它們實際應用特性，在前期建立潰瘍病菌的膠體金快速診斷方法基礎上［25］，首次研發(fā)了具有自主知識產(chǎn)權(quán)的柑橘潰瘍病菌快速診斷膠體金速測卡，為柑橘潰瘍病菌的診斷提供一種簡便、快速、特異、實用的檢測方法。

1 材料與方法

1．1 主要試驗材料

重組抗體Xcc－dsf v工程菌株由本實驗室前期構(gòu)建［26－28］。堿性磷酸酶標記羊抗鼠抗體、牛血清白蛋白BSA、聚乙二醇PEG20000購于北京鼎國生物技術(shù)有限公司。硝酸纖維素膜AE99、玻璃纖維膜Ahlstrom8964、純棉墊Rapid27及CF6均購自上海捷寧生物科技有限公司。

1．2 抗體制備

單克隆抗體制備工作主要由上海吉爾生化公司完成；重組抗體 Xcc－sc－dsfv為本實驗室前期構(gòu)建［22］；多克隆抗體采用Xcc菌懸液免疫家兔的抗血清提純所得。

1．3 抗體特性評價及篩選

對獲得的3類4株抗體：單克隆抗體Xcc－2D6、Xcc－2D8；多克隆抗體 Xcc－pab2；重組抗體 Xcc－scdsf v，通過間接ELISA方法進行特異性、靈敏度和穩(wěn)定性評價。最終篩選兩株最優(yōu)抗體進行膠體金速測卡的研發(fā)。

1．3．1 特異性測試

采用抗原菌Xcc及10株供試菌種，均稀釋成A600＝0．5的菌懸液，采用間接ELISA方法分別包被96孔酶聯(lián)板上，1%BSA－PBS封閉后每孔加入100μL PBS稀釋的純化抗體，濃度10 ng／μL，37℃孵育1 h。洗脫后加入用PBS 1∶1000倍稀釋的堿性磷酸酶標記的二抗抗體，37℃孵育1 h［29］。p NPP顯色，酶標儀405 n m讀數(shù)。分別測試幾種抗體與各個菌種的結(jié)合能力。該試驗重復3次以保證結(jié)果的真實可靠。

1．3．2 靈敏度測試

將抗原菌Xcc菌懸液稀釋成A600＝0．5，分別將4株抗體用PBS按照1∶1000倍開始等比例稀釋到1∶256 000倍，采用上述相同的間接ELISA方法，分別測試4株抗體與抗原菌Xcc特異性結(jié)合的靈敏度。該試驗重復3次以保證結(jié)果的真實可靠。

1．3．3 穩(wěn)定性測試

將分裝好的4株抗體（用PBS 1∶1000倍稀釋）于4℃冰箱中分別放置30、60、90、120、150、180 d后取出，間接ELISA方法測試各個時間段下4株抗體與抗原菌Xcc的結(jié)合能力。該試驗重復3次以保證結(jié)果的真實可靠。

1．4 膠體金的制備

吸取濃度為1．67 mg／mL氯金酸原液6．11μL，加入100 mL超純水中配制成0．01%的氯金酸，在磁力攪拌器上加熱直至煮沸；迅速加入1．8 mL 1%檸檬酸三鈉，繼續(xù)加熱3～5 min，溶液變?yōu)轷r亮的酒紅色，停止加熱，冷卻至室溫全波長掃描鑒定金顆粒大小及均一度。定容到100 mL，置4℃密封保存?zhèn)溆谩?/p>

1．5 金標抗體的制備

1．5．1 膠體金顆粒與抗體結(jié)合最適p H范圍

用0．l mol／L的 K2CO3溶液和0．5 moL／L的HCl調(diào)節(jié)膠體金溶液的p H 分別為5．0、5．5、6．0、7．0、7．5、8．0、8．5、9．0、9．5；分別加入20μg的標記抗體混勻制成金標抗體穩(wěn)定30 min后分別加入0．l mL 10%的NaCl，1500 g離心，測上清在520 nm處的光密度。

1．5．2 膠體金顆粒最適加入抗體標記量

0．1 mol／L K2CO3或0．1 mol／L HCl調(diào)節(jié)膠體金溶液p H至標記最適結(jié)合p H。將調(diào)好p H的膠體金溶液分裝10管，每管1 mL。加入標記抗體使每管濃度依次為5、10、15、20、25、30、35、40、45、50 mg／mL。對照管加1 mL稀釋液（不含抗體蛋白），混勻。靜置穩(wěn)定30 min后，在上述各管中加入0．1 mL 10%的Na Cl溶液，混勻后靜置2 h，測上清在520 n m處的光密度。

1．5．3 金標抗體的制備及純化

用0．1 mol／L K2CO3調(diào)節(jié)30 mL膠體金溶液至最適合p H 10．0～10．5，磁力攪拌器勻速攪拌，緩慢滴加標記抗體Xcc－2D8，繼續(xù)攪拌40 min；加入10%BSA溶液，使終濃度為1%，靜置1 h；加入1%PEG20000，使終濃度為0．1%，靜置40 min；金標抗體4℃15 000 r／min離心30 min；收集管靜置底可流動的暗紅色沉淀于保存液［30］中，4℃保存。

1．6 速測卡的組裝及結(jié)果判定

依次將硝酸纖維素膜、金標墊、吸水墊、樣品墊粘貼在底板上，裁剪成0．4 c m×5．5 c m的速測卡，包被塑料卡套，放入鋁箔袋中，加入干燥劑，密封4℃保存。

檢測滴加待測樣液60～80μL到加樣區(qū)，5 min后觀察結(jié)果。若僅出現(xiàn)質(zhì)控C線未見檢測T線則說明樣品為陰性；若同時出現(xiàn)質(zhì)控C線和檢測T線則說明樣品為陽性；若無條帶或僅出現(xiàn)檢測T線未見質(zhì)控C線則說明檢測結(jié)果無效。顯色過程應該在5～10 min中內(nèi)完成，超過規(guī)定時間所得結(jié)果不具有參考價值。

1．7 速測卡性能分析及評價

1．7．1 速測卡特異性分析

采用抗原菌Xcc以及其他植物病原菌、柑橘伴生菌及常見細菌共10株供試菌種，分別稀釋成高濃度菌懸液（A600＝0．5，約1×108cf u／mL），滴管吸取60～80μL分別滴加到加樣區(qū)，5 min后觀察并記錄結(jié)果，驗證膠體金速測卡的特異性效果。該試驗重復3次保證結(jié)果的真實可靠。

1．7．2 速測卡靈敏度分析

將抗原菌Xcc稀釋成10倍梯度，即1×108、1×107、1×106、1×105、1×104、1×103、1×102、1×101cf u／mL的菌懸液。滴管吸取60～80μL分別滴加到加樣區(qū)，5 min后觀察并記錄結(jié)果，測試膠體金速測卡的菌懸液最低檢測下限。該試驗重復3次。

1．7．3 速測卡穩(wěn)定性分析

將同批制作的膠體金速測卡分若干份，密封干燥儲存在4℃冰箱中。于7、15、30、60、90、180 d時取出，檢測抗原菌Xcc菌懸液 （A600＝0．5，約1×108cf u／mL），驗證膠體金速測卡的保存穩(wěn)定性。該試驗重復3次。

1．7．4 速測卡批間重復性檢測

隨機抽取5個批次的膠體金速測卡，分別測試Xcc菌懸液（陽性對照）、樣品稀釋液（陰性對照）、顯癥葉片浸出液，每個樣本重復3次，判斷速測卡是否存在批次間差異。

1．7．5 與q PCR法結(jié)果一致性分析

q PCR與速測卡檢測模板均為柑橘樣品無菌水浸泡液。本實驗室前期建立qPCR方法檢測來自重慶忠縣、巫山、渝北、江津等地區(qū)的206份柑橘送檢樣本，每個樣本重復3次。對該206份送檢樣品的浸泡液分別滴加60～80μL到加樣區(qū)，5 min后觀察并記錄結(jié)果，每個樣本重復3次。統(tǒng)計兩種方法所得結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2．1 抗體特性評價及篩選

2．1．1 抗體特異性測試

采用ELISA方法驗證單克隆抗體、多克隆抗體及重組抗體的特異性，以植物病原細菌、柑橘組織內(nèi)生菌、常見細菌作對照。結(jié)果顯示單克隆抗體（Xcc－2D6和Xcc－2D8）與抗原菌Xcc有很好的結(jié)合活性，對其余10種對照細菌無結(jié)合能力，特異性最好。多克隆抗體（Xcc－Pab2）、重組抗體（Xcc－sc－dsf v）與抗原菌Xcc有很好的結(jié)合活性，對其余10種對照細菌無明顯結(jié)合能力，特異性較好。

圖1 各抗體特異性測試結(jié)果

2．1．2 抗體靈敏度測試

抗體的靈敏度直接影響膠體金速測卡的測試性能，為驗證抗體靈敏度，將單克隆抗體、多克隆抗體、重組抗體從1∶103倍開始等比例稀釋到1∶106倍，用ELISA方法驗證各稀釋度的抗體與抗原菌抗原菌Xcc的結(jié)合能力。結(jié)果顯示各種抗體在稀釋1∶16 000～1∶32 000范圍內(nèi)結(jié)合能力下降最快。單克隆抗體Xcc－2D6對抗原菌Xcc的結(jié)合能力達到1∶256 000倍；單克隆抗體Xcc－2D8對抗原菌Xcc的結(jié)合能力達到1∶128 000倍；多克隆抗體Xcc－Pab2對抗原菌Xcc的結(jié)合能力達到1∶128 000倍；重組抗體Xcc－sc－dsf v對抗原菌Xcc的結(jié)合能力達到1∶64 000倍。

圖2 各抗體靈敏度

2．1．3 抗體穩(wěn)定性測試

抗體的穩(wěn)定性是衡量膠體金速測卡成功與否的另一重要標準，間接ELISA方法分別測試30、60、90、120、150、180 d時單抗、多抗、重組抗體在低溫下長時間放置后與抗原菌Xcc結(jié)合能力的變化。結(jié)果顯示抗體在低溫下放置結(jié)合能力沒有出現(xiàn)陡然下降的現(xiàn)象；穩(wěn)定性從大到小依次為單克隆抗體Xcc－2D8＞單克隆抗體Xcc－2D6＞多克隆抗體Xcc－pab2＞重組抗體Xcc－sc－dsf v；放置180d后單克隆抗體Xcc－2D8的活性仍保持50%，單克隆抗體Xcc－2D6活性保持40%，多克隆抗體Xcc－pab2和重組抗體Xcc－sc－dsf v的活性僅存20%以下。

圖3 各抗體穩(wěn)定性

根據(jù)3項性能評價，雜交瘤細胞制備的單克隆抗體Xcc－2D8和Xcc－2D6性能相對較優(yōu)，為后續(xù)膠體金速測卡的研究提供一定參考。

2．2 膠體金顆粒的制備

制備好的膠體金顆粒呈鮮紅透亮狀態(tài)，在室溫下放置能穩(wěn)定保持該狀態(tài)。用全波長紫外分光光度計掃描測得它的最大吸收波長Amax＝520．324 n m，在該處的光密度為A520＝0．597 8。

2．3 金標抗體的制備及純化

2．3．1 膠體金顆粒與抗體結(jié)合最適p H范圍

p H值直接影響金標抗體的結(jié)合穩(wěn)定性。根據(jù)測試各p H梯度下金標抗體結(jié)合物的吸光值，結(jié)果顯示標記p H值與抗體相關，不同抗體的最適p H值不同，多克隆抗體Xcc－pab2的最適標記p H為8．0～8．5范圍內(nèi)，單克隆抗體 Xcc－2D8和Xcc－2D6的最適標記p H為10．0～10．5范圍內(nèi)，在此范圍p H值下金標抗體的光密度最大，說明抗體與膠體金顆粒的吸附最為穩(wěn)定。

圖4 不同p H下各抗體標記膠體金溶液的最大吸光度值

2．3．2 金標抗體最適標記量

抗體標記量是直接影響金標抗體的結(jié)合穩(wěn)定性的另一關鍵因素。測試各抗體濃度梯度下金標抗體結(jié)合物的吸光值，結(jié)果顯示20 mg／mL以上抗體加入量能保證與膠體金顆粒穩(wěn)定吸附，并抵抗高鹽離子的加入。

圖5 標記不同量抗體后膠體金溶液的最大吸光度值

2．4 速測卡性能評價

2．4．1 速測卡特異性測試

對照菌選取了植物病原菌水稻白葉枯病菌（Xanthomonas or yzae pv．or yzae）、番 茄 潰 瘍 病 菌（Clavibacter michiganensis subsp．michiganensis）、甘藍黑腐病菌（Xanthomonas campestris pv．campestris）及番茄青枯病菌（Ralstonia solanacear um），4種從柑橘組織分離的伴生菌（鑒定為黃單胞菌屬Xanthomonas）以及常見細菌蘇云金芽胞桿菌（Bacillus thuringiensis）、枯草芽胞桿菌（B．subtilis）、大腸桿菌（Escherichia coli）

速測卡測試結(jié)果顯示：測試Xcc速測卡為陽性，其余11種菌種的速測卡陰性，質(zhì)控線（C線）顯色證明結(jié)果可靠。特異性檢測時供試菌懸液濃度偏高（A600＝0．5），8、9號速測卡檢測伴生黃單胞菌時檢測線（T線）隱約顯色，但對照12號Xcc速測卡檢測線顏色明顯偏淡，該現(xiàn)象為細菌濃度過高出現(xiàn)的輕微堆積現(xiàn)象，而不是抗原抗體特異性反應的正常顯色。

圖6 速測卡測試Xcc以及其他11種常見菌種

2．4．2 速測卡靈敏度檢測

將Xcc菌懸液從1×108cfu／mL稀釋到1×101cfu／mL，用速測卡測試。根據(jù)結(jié)果，免疫金層析速測卡能夠檢測1×103～1×104濃度的Xcc菌懸液。

圖7 速測卡靈敏度檢測結(jié)果

2．4．3 速測卡批間重復性檢測

隨機5個批次速測卡測試Xcc菌懸液 （陽性對照）、樣品稀釋液（陰性對照）、病葉浸出液，每個樣本重復3次，觀察并統(tǒng)計結(jié)果。隨機5個批次速測卡對Xcc菌懸液（陽性對照）、樣品稀釋液（陰性對照）、顯癥葉片浸出液檢測結(jié)果經(jīng)統(tǒng)計：5個批次速測卡測試結(jié)果一致，無批間差異。

2．4．4 速測卡與q PCR方法檢測結(jié)果比較

對206份柑橘樣品的檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)：206份樣品中q PCR法檢出陽性樣本為66個，陰性樣本140個；膠體金速測卡法檢出陽性樣本為56個，陰性樣本150個。兩組方法測試結(jié)果差異存在于10份無病癥攜帶微量柑橘潰瘍病Xcc樣本，此種樣本q PCR法檢出為陽性，膠體金速測卡法檢出為陰性。對所有qPCR法檢出為陰性的樣本，膠體金速測卡法檢出亦為陰性，與q PCR法結(jié)果無差異。

經(jīng)計算兩種檢測方法結(jié)果如下。

符合率kap pa值＝（56＋140）／（56＋0＋10＋140）×100%＝95．15%；

速測卡陽性檢出率＝56／（56＋10）＝84．85%；

速測卡陰性檢出率＝140／（140＋0）＝100%。

表2 速測卡與qPCR實測柑橘送檢樣品匯總表

3 討論

3．1 膠體金顆粒的制備

在制備前必須對所有玻璃儀器進行清潔處理，并酸化硅化。因為金顆粒外層所帶的等量負電荷保證膠體的穩(wěn)定，也是它們能與抗體蛋白穩(wěn)定吸附的重要因素。任何微量的電解質(zhì)都可能破壞膠體金溶液的帶電環(huán)境，影響金標抗體的穩(wěn)定性，所以要特別注意避免微量污染，在每次使用前都要對玻璃儀器進行徹底的清洗，并用三蒸水沖洗數(shù)次。

本試驗采用的膠體金大小為30n m左右。不同大小的金顆粒應用到膠體金速測卡上產(chǎn)生的效果截然不同，根據(jù)免疫層析的原理，檢測線及質(zhì)控線的顯色是由于金顆粒的堆積形成的。金顆粒粒徑過大容易在檢測線處堆積；然而粒徑過小，大量的金不容易封閉完全，剩下的位點會吸附其他待測樣品，也容易產(chǎn)生假陽性結(jié)果，膠體金顆粒的大小直接影響顯色效果，因此在試驗中要對所制備膠體金顆粒的大小進行鑒定。均勻度不好的膠體金顆粒會出現(xiàn)聚集成黑色大顆粒沉淀的現(xiàn)象，在制備金標抗體時離心的過程中出現(xiàn)掛壁的現(xiàn)象。

3．2 金標抗體最適p H

新制備的膠體金溶液的p H在5．5左右，放置一段時間其p H不會發(fā)生變化。當標記抗體蛋白后，由于抗體蛋白的帶電作用，要調(diào)整溶液的p H值，使金顆粒與抗體蛋白穩(wěn)定的結(jié)合。本試驗中發(fā)現(xiàn)最適p H應該是一個p H范圍而非準確值，每株抗體的最適標記p H范圍均不同，多克隆抗體Xccpab2的最適標記p H為8．0～8．5范圍內(nèi)，單克隆抗體Xcc－2D8和 Xcc－2D6的最適標記p H 為10．0～10．5范圍內(nèi)，因此每使用一株抗體都要進行最適p H的分析。一個有趣的現(xiàn)象是：在非最適p H時抗體蛋白會與膠體金顆粒聚集沉淀，但當抗體失去生物活性后金顆粒又會重新懸浮起來，恢復鮮紅透亮的穩(wěn)定膠體狀態(tài)，其p H也回到了最初的范圍（5．5左右）。

3．3 測試卡性能評價

前期同類產(chǎn)品［25］檢測下限在1×106cf u／mL。本研究制備的膠體金免疫層析速測卡用于檢測柑橘潰瘍病菌靈敏度高，檢測下限為1×103～1×104cfu／mL，較之前靈敏度得到了很大的提高。采用畫線而非點滴的方式固定檢測線和指控線，速測卡背景降低，外觀上有了較大的改進。

由于柑橘潰瘍病是植物細菌性病害，因此選擇了其他植物致病菌、從柑橘組織中分離的伴生菌以及環(huán)境中常見的細菌來檢測特異性，速測卡無交叉反應，特異性的效果理想。

與目前最靈敏穩(wěn)定的q PCR方法比較，結(jié)果一致性達到了95．15%。主要差異存在于10份無病癥攜帶微量柑橘潰瘍病Xcc樣本，此種樣本q PCR法檢出為陽性，膠體金速測卡法檢出為陰性。q PCR方法的檢測靈敏度在1×101～1×102cf u／mL，微量的細菌靶DNA能夠在q PCR反應體系中擴增并放大信息。而膠體金速測卡的顯色原理是由抗體結(jié)合待測樣品中的細菌，并在檢測線抗體的攔截堆積下形成顯色條帶，待測樣品中的細菌不能自行擴增，所以細菌的量是造成最后顯色深淺的直接因素。細菌濃度過低，截留效果不明顯，檢測線所顯色的結(jié)果就會顯得模棱兩可，需要進一步采用其他方法進行判別。但是目前的檢測下限在實際應用中已經(jīng)可以對大部分樣品進行初步診斷，對于少數(shù)結(jié)果不太有把握的樣本送檢相關檢測機構(gòu)，工作量已經(jīng)大幅度的減少，為基礎檢驗檢疫工作提供了一定的幫助。

4 結(jié)論

本研究利用免疫學技術(shù)所研發(fā)柑橘潰瘍病菌膠體金速測卡靈敏度下限1×103～1×104cfu／mL，快速，特異性強，效果穩(wěn)定，操作簡便，結(jié)果直觀，與常規(guī)qPCR方法的檢測結(jié)果一致性高（kappa值＝95．15%），具有一定的實用效果，基本滿足柑橘實際樣品的柑橘潰瘍病的快速診斷檢測要求，達到向基層推廣使用，克服現(xiàn)有技術(shù)缺陷的研究目的。

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