麻耀華， 尹淑麗， 張麗萍＊， 黃亞麗， 張 蕾

（1．河北省科學(xué)院生物研究所，石家莊 050081； 2．河北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，石家莊 050016）

黃瓜是我國的主栽蔬菜之一，多年連作使得尖孢鐮刀菌在土壤中大量積累，引起黃瓜枯萎病的暴發(fā)，造成重大的經(jīng)濟損失，已成為影響設(shè)施黃瓜高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)的主要障礙。目前，主要以殺菌廣、見效快的化學(xué)藥劑進(jìn)行防治，由于病原菌易產(chǎn)生抗藥性，導(dǎo)致化學(xué)農(nóng)藥施用量不斷增加，造成了嚴(yán)重的農(nóng)藥殘留及土壤生物結(jié)構(gòu)的破壞［1］。因此，相對安全的生物防治引起了人們的關(guān)注。劉敏等人研究的采用擬康氏木霉和枯草芽胞桿菌對黃瓜枯萎病具有協(xié)同防治作用［3］；陳雪麗、王光華等人接種2株生防菌對大豆根腐病、黃瓜和番茄枯萎病具有一定的防治效果，且具有較明顯的促生作用［3－4］。土壤微生物數(shù)量是標(biāo)志土壤生物學(xué)性質(zhì)的重要組成部分。王茹華等人通過試驗證明植物對土傳病害的抗性與根際土壤微生物關(guān)系密切［5］。目前，復(fù)合微生態(tài)制劑的研究主要集中在兩種微生物構(gòu)成的復(fù)合微生態(tài)制劑應(yīng)用效果及其生態(tài)效應(yīng)上，多種復(fù)合的微生態(tài)制劑對植物微生態(tài)環(huán)境、土壤酶活的影響及其與病害防治間關(guān)系的系統(tǒng)研究少見報道。本項目組研制出了防治黃瓜等多種植物土傳真菌病害的復(fù)合微生態(tài)制劑，并取得了農(nóng)業(yè)部施肥登記證。本研究采用傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)技術(shù)及土壤酶活測定方法，探討于黃瓜不同生育時期施用復(fù)合微生態(tài)制劑對土壤根際微生物數(shù)量和土壤酶活性的影響，為明確復(fù)合微生態(tài)制劑防治黃瓜枯萎病的作用機制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1．1 試驗材料

1.1.1 供試材料

供試黃瓜種子先用復(fù)合微生態(tài)制劑浸泡4 h后，于花盆（26 c m×26 c m）內(nèi)種植黃瓜，供試土為大棚中7年連作黃瓜土壤，其中加入10%蛭石混勻。

供試 土 壤特 性：p H 為6．78，有 機 質(zhì)含 量4．186%，全氮0．285%，速效磷1 239．46 mg／kg，速效鉀444．60 mg／kg。

1．1．2 復(fù)合微生態(tài)制劑

該菌劑為主要由枯草芽胞桿菌BSD－2、放線菌S－317、木霉T36等多種有益微生物構(gòu)成的液態(tài)復(fù)合微生態(tài)制劑，活菌含量為1×108cf u／mL。

1．1．3 試驗設(shè)計

試驗設(shè)4個處理，在黃瓜苗期（6月11日）、花期（7月1日）、瓜期（7月22日）分別施入復(fù)合微生態(tài)制劑，每盆加入1×108cf u／mL復(fù)合微生態(tài)制劑20 mL，每個處理3個重復(fù)，以不施入復(fù)合微生態(tài)制劑為對照CK（5月30日）。在拉秧期分別取4個時期處理的黃瓜根際土壤，測定土壤微生物數(shù)量和土壤酶活。

1．2 測定方法

1．2．1 土壤微生物數(shù)量統(tǒng)計

測定土壤細(xì)菌、放線菌、真菌、尖孢鐮刀菌數(shù)量，微生物計數(shù)采用傳統(tǒng)方法［6］，細(xì)菌采用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，放線菌采用改良髙氏1號培養(yǎng)基，真菌采用PDA培養(yǎng)基，尖孢鐮刀菌采用選擇性培養(yǎng)基（參照 Komada H 的方法）［7］。

1．2．2 土壤酶活的測定

測定土壤中脲酶、過氧化氫酶、蔗糖酶和中性磷酸酶活性。土壤脲酶活性用靛酚藍(lán)比色法［8］測定，以每克土24 h產(chǎn)生的NH3－N毫克數(shù)表示；過氧化氫酶活性用高錳酸鉀滴定法［8］測定，以每克土消耗0．1 mol／L K Mn O4毫升數(shù)表示；蔗糖酶活性用3，5－二硝基水楊酸比色法［8］測定，以每克土24 h產(chǎn)生的葡萄糖毫克數(shù)表示；中性磷酸酶活性用磷酸苯二鈉比色法［9］測定，以每克土24 h產(chǎn)生的酚毫克數(shù)表示。

1．3 數(shù)據(jù)分析方法

數(shù)據(jù)均為3次重復(fù)的平均值，用DPS進(jìn)行顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2．1 不同生育期加入復(fù)合微生態(tài)制劑對黃瓜根際土壤微生物數(shù)量的影響

由圖1、圖2試驗結(jié)果可知，不同生育期施入復(fù)合微生態(tài)制劑，苗期、花期、瓜期施入處理與對照相比，細(xì)菌數(shù)量分別增長了3．8%、27．9%、12．2%；放線菌數(shù)量分別增長了12．6%、20．6%、9．7%?；ㄆ谑┤霃?fù)合微生態(tài)制劑處理對根際土壤中細(xì)菌和放線菌數(shù)量的影響最大，可能是由于施入復(fù)合微生態(tài)制劑后土壤中細(xì)菌和放線菌的積累促進(jìn)了黃瓜植株的旺盛生長，增加了根系及根系分泌物，從而使微生物生命活動旺盛；在苗期、花期和瓜期施入復(fù)合微生態(tài)制劑，與對照相比，土壤中細(xì)菌和放線菌數(shù)量有顯著差異。復(fù)合微生態(tài)制劑對土壤中細(xì)菌和放線菌數(shù)量有促進(jìn)作用，其中在花期施入復(fù)合微生態(tài)制劑對根際土壤中細(xì)菌和放線菌數(shù)量的影響最大。

圖1 不同生育期施入復(fù)合微生態(tài)制劑對黃瓜根際土壤細(xì)菌數(shù)量的影響

圖2 不同生育期施入復(fù)合微生態(tài)制劑對黃瓜根際土壤放線菌數(shù)量的影響

在花期、瓜期施入復(fù)合微生態(tài)制劑的處理，土壤微生物真菌數(shù)量分別比對照減少了64．5%、17．7%，與對照相比差異顯著；苗期施入處理與對照相比差異不顯著；苗期、花期與瓜期處理尖孢鐮刀菌數(shù)量分別比對照減少了7．6%、66．7%、51．8%，各處理與對照相比差異性均顯著（圖3、圖4）。由此看出，復(fù)合微生態(tài)制劑對土壤真菌和尖孢鐮刀菌都表現(xiàn)為抑制作用，其中花期施入復(fù)合微生態(tài)制劑的處理對真菌及尖孢鐮刀菌數(shù)量的影響最大。

圖3 不同生育期施入復(fù)合微生態(tài)制劑對黃瓜根際土壤真菌數(shù)量的影響

從整個生育期來看，在花期施入復(fù)合微生態(tài)制劑后，黃瓜根際土壤微生物細(xì)菌和放線菌數(shù)量顯著高于對照，細(xì)菌增加了27．9%，放線菌增加了20．6%；真菌和尖孢鐮刀菌的數(shù)量顯著低于對照，真菌減少了64．5%，尖孢鐮刀菌減少了66．7%，說明復(fù)合微生態(tài)制劑的施入能夠抑制真菌和尖孢鐮刀菌的生長。

圖4 不同生育期施入復(fù)合微生態(tài)制劑對黃瓜根際土壤尖孢鐮刀菌數(shù)量的影響

2．2 復(fù)合微生態(tài)制劑對不同生育期黃瓜根際土壤酶活性的影響

2．2．1 復(fù)合微生態(tài)制劑對土壤脲酶活性的影響

脲酶廣泛存在于土壤中，對尿素在土壤中的轉(zhuǎn)化及尿素利用率有重大影響［10］。苗期、花期、瓜期施入處理與對照相比，脲酶活性分別增加了70．6%、130．8%、110．96%，其中在花期處理脲酶活性最高（圖5），表明花期施入復(fù)合微生態(tài)制劑可顯著提高土壤脲酶活性。

圖5 不同生育時期施入復(fù)合微生態(tài)制劑對土壤脲酶活性的影響

2．2．2 復(fù)合微生態(tài)制劑對土壤過氧化氫酶活性的影響

過氧化氫酶是一種分解土壤中過氧化氫進(jìn)而減小其對植物毒害作用的氧化還原酶，可以用來表征土壤的生化活性［11－12］。由圖6可知，苗期、花期、瓜期施菌處理土壤過氧化氫酶活性與對照相比差異顯著，均可提高過氧化氫酶活性，但3個處理間無顯著差異。土壤過氧化氫酶活性變化較小，表明不同生育時期施入復(fù)合微生態(tài)制劑對根際土壤中過氧化氫酶活性的影響不明顯。

圖6 不同生育期施入復(fù)合微生態(tài)制劑對土壤過氧化氫酶活性的影響

2．2．3 復(fù)合微生態(tài)制劑對土壤蔗糖酶活性的影響

土壤蔗糖酶是表征土壤生物學(xué)活性的重要酶，蔗糖酶活性高，說明土壤生物活性高，土壤狀況良好［13－14］。3種處理的土壤蔗糖酶活性均高于對照，差異均顯著?；ㄆ?、瓜期施入處理與對照相比，蔗糖酶活性分別增加了190．5%、206．3%（圖7）。不同生育期施入復(fù)合微生態(tài)制劑與對照相比，均可以提高根際土壤中蔗糖酶活性。

圖7 不同生育期施入復(fù)合微生態(tài)制劑對土壤蔗糖酶活性的影響

2．2．4 復(fù)合微生態(tài)制劑對土壤中性磷酸酶活性的影響

土壤磷酸酶是催化土壤中磷酸單酯和磷酸二酯水解的酶，它能將有機磷酯水解為無機磷酸［15］。在整個生育期中，各處理土壤中性磷酸酶活性均高于對照，花期和瓜期施菌處理土壤中性磷酸酶活性變化較大，與對照相比，分別增加了123．5%和117．6%；而苗期施用變化相對較小，與對照比增加了52．9%（圖8），3個處理與對照相比，差異均顯著。因此，不同生育期施入復(fù)合微生態(tài)制劑與對照相比，均可以提高根際土壤中性磷酸酶活性。

圖8 不同生育期施入復(fù)合微生態(tài)制劑對土壤中性磷酸酶活性的影響

3 討論

3．1 不同生育期加入復(fù)合微生態(tài)制劑對黃瓜根際土壤微生物數(shù)量的影響

復(fù)合微生態(tài)制劑促進(jìn)了土壤微生物中細(xì)菌和放線菌的增殖，抑制了真菌和尖孢鐮刀菌的生長。與不施入菌劑對照相比，在花期施菌處理，細(xì)菌增加27．9%，放線菌增加20．6%，真菌減少64．5%，尖孢鐮刀菌減少66．7%。從本試驗的結(jié)果來看，施入復(fù)合微生態(tài)制劑后，真菌和尖孢鐮刀菌數(shù)量明顯受到抑制，細(xì)菌和放線菌數(shù)量明顯提高，說明可能是由于復(fù)合微生態(tài)制劑的施入促進(jìn)了根際土壤細(xì)菌和放線菌等微生物的大量繁殖，從而抑制了真菌和尖孢鐮刀菌的生長，減少黃瓜枯萎病發(fā)生的可能性。復(fù)合微生態(tài)制劑的施入可以影響根際土壤中微生物的數(shù)量，從而可以達(dá)到改善土壤結(jié)構(gòu)的作用。而土壤微生物是土壤酶重要來源之一，土壤微生物的增加，有利于提高土壤酶的活性［16］。這一結(jié)果與苗則彥［17］等人在研究不同抗、感枯萎病黃瓜品種不同生育期根際微生物數(shù)量消長動態(tài)分析所得的結(jié)論相似，即根際細(xì)菌數(shù)量在花期處理達(dá)到最高。細(xì)菌和放線菌大量增殖，其分泌抗生素等物質(zhì)對真菌有拮抗作用［18］。之后隨著復(fù)合微生態(tài)制劑的降解，到末期細(xì)菌和放線菌的生長繁殖受到抑制，對真菌的拮抗作用逐漸減弱，真菌數(shù)量又呈現(xiàn)逐漸上升的趨勢，其機理有待進(jìn)一步研究。

3．2 復(fù)合微生態(tài)制劑對不同生育期黃瓜根際土壤酶活性的影響

酶類參與了土壤中一切復(fù)雜的生物化學(xué)過程，包括凋落物的分解，腐殖質(zhì)及各種有機化合物的分解與合成，土壤養(yǎng)分固定與釋放，以及各種氧化還原反應(yīng)，直接參與了土壤營養(yǎng)元素的有效化過程。土壤酶活性是土壤生物活性較為穩(wěn)定和靈敏的一個指標(biāo)，在一定程度上能夠反映土壤養(yǎng)分的轉(zhuǎn)化動態(tài)［19］。根際土壤酶是土壤中具有生物活性的蛋白質(zhì)，是由微生物、動植物活體的分泌物或動植物殘體、遺骸分解釋放于土壤中的一類具有催化能力的生物活性物質(zhì)，其活性是土壤新陳代謝的重要肥力指標(biāo)［20－22］。土壤酶活性增強意味著土壤生物活性提高，能增強植株的抗性［20］。其中，脲酶是一種專屬性很強的水解酶，能催化酰胺化合物水解為氨，根際土壤中脲酶活性的提高，將加速土壤的各類含氮有機中間產(chǎn)物轉(zhuǎn)化為植物可利用的物質(zhì)，從而提高根系有效態(tài)氮的含量。磷酸酶活性的增加可加速土壤有機磷脫磷速度，改善土壤磷素的供應(yīng)水平，磷酸酶能促進(jìn)土壤中有機磷化合物或無機磷酸鹽轉(zhuǎn)化成能為黃瓜利用的無機態(tài)磷。黃瓜根際土壤中蔗糖酶活性的增加為根際微環(huán)境提供了必要的營養(yǎng)物質(zhì)。過氧化氫酶可促進(jìn)土壤多種化合物的氧化，并可防止過氧化氫積累對生物體造成毒害。本研究結(jié)果表明復(fù)合微生態(tài)制劑的施入能夠提高土壤中脲酶、中性磷酸酶和蔗糖酶的生物活性，改善根際土壤環(huán)境，促進(jìn)微生物繁衍并延緩?fù)寥牢⑸锼p的速率，有利于實現(xiàn)作物高產(chǎn)的目標(biāo)。

與對照相比，花期施入復(fù)合微生態(tài)制劑后，促進(jìn)了根際土壤中細(xì)菌和放線菌的生長，抑制了真菌和尖孢鐮刀菌的生長，提高了根際土壤中脲酶、過氧化氫酶、蔗糖酶、中性磷酸酶的活性，促進(jìn)了花期土壤中微生物種類和數(shù)量到拉秧期可持續(xù)達(dá)到最大保護值，為黃瓜根際土壤創(chuàng)造了良好的微生態(tài)環(huán)境，進(jìn)而為黃瓜的快速生長提供物質(zhì)基礎(chǔ)。土壤微生物活性提高，可能會增強與其土壤病原菌之間在空間及養(yǎng)分上的競爭，減輕病害的發(fā)生。但復(fù)合微生態(tài)制劑生防機理研究還遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠深入和細(xì)致，很多方面有待進(jìn)一步研究證實。

［1］ 王玉梅，祁紅英，郭建華．植物土傳病害的微生物防治研究進(jìn)展［J］．世界農(nóng)業(yè)，1995（1）：37－39．

［2］ 郭敏，劉春燕，陳靠山．?dāng)M康氏木霉對蔬菜病原真菌的拮抗作用及對番茄灰霉病防效的初步研究［J］．安徽農(nóng)學(xué)通報，2008，14（21）：156－157，102．

［3］ 陳雪麗，郝再彬，王光華，等．多粘類芽孢桿菌BRF－1抗菌蛋白的分離純化［J］．中國生物防治，2007，23（2）：156－159．

［4］ 王光華，周克琴，張秋英，等．拮抗細(xì)菌BRF－1對幾種植物病原真菌的抗生效果［J］．中國生物防治，2003，19（2）：73－77．

［5］ 王茹華，周寶利，張啟發(fā)，等．嫁接對茄子根際微生物種群數(shù)量的影響［J］．園藝學(xué)報，2005，32（1）：124－126．

［6］ 沈萍，范秀容，李廣武．微生物學(xué)實驗［M］．第3版．北京：高等教育出版社，2001：69－92．

［7］ Komada H．Develop mentof a selective mediu m for quantitative isolation of Fusariu m oxyspor u m fro m nat ural soil［J］．Review of Plant Pr otection Research，1975，8：114－125．

［8］ 關(guān)松蔭．土壤酶及其研究法［M］．北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，1986：1－13．

［9］ 趙蘭坡，姜巖．土壤磷酸酶活性測定方法的探討［J］．土壤通報，1986，6（3）：138－141．

［10］郭明，尹亞梅，何良榮，等．農(nóng)用化學(xué)物質(zhì)對土壤脲酶活性的影響［J］．農(nóng)業(yè)環(huán)境保護，2000，19（2）：68－71．

［11］郭瑞英，陳清，李曉林．土壤微生物－抑病性與土壤健康［J］．中國蔬菜，2005（S1）：78－82．

［12］張晶，張惠文，李新宇，等．土壤微生物生態(tài)過程與微生物功能基因多樣性［J］．應(yīng)用生態(tài)學(xué)報，2006，17（6）：1129－1132．

［13］吳鳳芝，欒非時，王東凱，等．大棚黃瓜連作對根系活力及其根際土壤活性影響的研究［J］．東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，1996，27（3）：255－258．

［14］嚴(yán)昶升．土壤肥力研究法［M］．北京：農(nóng)業(yè)出版社，1988：277－279．

［15］程國華，郭樹凡，薛景珍，等．長期施用含氯化肥對土壤酶活性的影響［J］．沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，1994，25（4）：360－365．

［16］趙萌，李敏，王淼焱，等．西瓜連作對土壤主要微生物類群和土壤酶活性的影響［J］．微生物學(xué)通報，2008，35（8）：1251－1254．

［17］苗則彥，趙奎華，劉長遠(yuǎn)，等．不同抗、感枯萎病黃瓜品種不同生育時期根際微生物數(shù)量消長動態(tài)分析［J］．沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2004，35（1）：13－15．

［18］吳敏娜，張惠文，李新宇，等．乙草胺脅迫對土壤真菌拮抗功能和假單胞菌以及芽胞桿菌群落結(jié)構(gòu)的影響［J］．農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報，2008，27（3）：926－931．

［19］樊軍，郝明德．黃土高原旱地輪作與施肥長期定位試驗研究．Ⅱ土壤酶活性與土壤肥力［J］．植物營養(yǎng)與肥料學(xué)報，2003，9（2）：146－150．

［20］孫紅霞，武琴，鄭國祥，等．EM對茄子、黃瓜抗連作障礙和增強土壤生物活性的效果［J］．土壤，2001，33（5）：264－267．

［21］孫波，趙其國，張?zhí)伊?，等．土壤質(zhì)量與持續(xù)環(huán)境Ⅲ．土壤質(zhì)量評價的生物學(xué)指標(biāo)［J］．土壤，1997，29（5）：225－233．

［22］任天志．持續(xù)農(nóng)業(yè)中的土壤生物指標(biāo)研究［J］．中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2000，33（1）：68－75．