劉婷婷， 殷幼平， 林亞玉， 賢家旭， 陳世偉， 王中康＊

（1．重慶大學生物工程學院基因研究中心，重慶 400030；2．廣西利添生物科技發(fā)展 （合浦）有限公司，北海 536128）

柑橘黃龍病 （Citrus Huanglongbing，HLB）是影響世界柑橘產業(yè)的一種毀滅性病害［1］。該病害至今未能得到穩(wěn)定的純培養(yǎng)，妨礙了病害侵染機理的深入研 究［2］。Jeong－Soon Ki m［3］、Ute Albrecht［4］用生物芯片技術對柑橘染病后體內的基因表達進行了研究，從分子角度對柑橘被黃龍病菌侵染后的反應進行了分析。利用寄主抗病性是防治病害的一種經濟有效的方法，國際對于柑橘的分子抗性育種也正在研究中［5］，但尚未有商用的抗性品種問世。依據現(xiàn)有的研究報道及田間觀察，發(fā)現(xiàn)長期生長在柑橘黃龍病病區(qū)的多年生柚樹（10～30年）病害癥狀不明顯，對黃龍病呈現(xiàn)一定程度的耐病性，是抗黃龍病育種的潛在的基因資源，因此可以由此入手分析其抗病相關基因的特性。迄今為止，已經分離鑒定出約50余種抗病基因［6］，通過對這些基因進行分析，發(fā)現(xiàn)其表達產物具有特定的保守結構域，如核苷酸結合位點（nucleotide binding site，NBS）、亮氨酸重復序列（leucine－rich repeat，LRR）、絲氨酸／蘇氨酸蛋 白 激酶（serine－threonine kinase，STK）等［7－8］。根據已知抗病基因表達產物的保守區(qū)域設計簡并引物PCR擴增得到的序列稱為抗病基因同源序列（resistance gene analogs，RGAs），目前通過該方法已經從甘蔗［9］、姜［10］、杏［11］、大豆［12］、小麥［13］等植物中擴增得到了大量RGAs。但是從基因組中得到的RGA可能有不表達的假基因，而從c DNA中分離的RGA則一般都是表達序列［14］，通過對已克隆RGA的分析，并不是所有的RGA都與抗病基因相關，因此需要對得到的RGA進行抗病相關性的分析和鑒別以確定抗病相關基因?；虻墓δ芸梢酝ㄟ^基因的表達特征反映出來，定量PCR是研究基因表達較為靈敏、快速、簡單的方法，目前已經在各個研究領域得到了廣泛的應用［15］。利用定量PCR技術，蔡高磊等［16］研究了小麥Ta OZR基因的表達情況，張薇等［17］對煙草激活蛋白Pea T1的誘導抗性作用進行了研究，楊立桃等［18］對轉基因水稻外源基因拷貝數(shù)進行了分析。本研究利用較耐病的柑橘屬柚c DNA為模板，根據植物抗病基因表達產物的保守區(qū)域設計簡并引物擴增抗病基因相似序列，然后設計特異性引物，采用實時熒光定量PCR技術，驗證抗性基因相似序列與黃龍病菌侵染的相關性，期望獲得具有抗病基因保守區(qū)域的黃龍病抗性候選基因，為黃龍病抗性基因的克隆及抗病基因作用機制的研究提供理論基礎。

1 材料與方法

1．1 材料處理及RNA提取

供試植物為10年生琯溪蜜柚葉片（福建長泰）與奧林達夏橙（由廣西合浦烏家柑橘種植場提供）。甜橙采取兩組處理方式，一組嫁接黃龍病病芽（T），一組不嫁接作為空白對照（C），每組8棵植株。處理后的兩組植物分別放于溫室內培養(yǎng)，保持持續(xù)的自然光照射，溫度為17～25℃。嫁接1個月后開始取樣，每株取3片葉片，以后每個月取1次連續(xù)取8個月。每次取的樣品洗凈后液氮速凍后于－80℃冰箱保存。提取DNA，選取定量PCR檢測為陽性的3株樣品用于進一步試驗。用Trizol法提取植物的總RNA，每組樣品3個生物重復，RNase－free DNase I處理樣品以排除DNA的污染，分光光度計檢測樣品，并于1．0%的瓊脂糖凝膠上電泳檢測RNA的完整性，A260nm／A280nm的比值在1．8～2．0之間的樣品利用隨機引物和M－MLV反轉錄酶合成c DNA第1鏈。

1．2 RGA的擴增及序列分析

根據抗性基因保守區(qū)利用Pri mer5．0設計簡并引物（表1），以琯溪蜜柚c DNA為模板進行PCR擴增，產物于1．5%的瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，回收、連接、轉化，挑選陽性克隆酶切，篩選部分差異陽性克隆測序。序列輸入Gen Bank進行Blast比對，ORF Finder用于尋找RGA的開放閱讀框。推導的氨基酸序列與已克隆的NBS類抗性基因利用DNA MAN軟件進行序列比對，尋找其保守區(qū)域，并利用Cl ustal x及MEGA4進行系統(tǒng)進化樹的構建。

表1 PCR擴增所需引物1）

1．3 定量PCR表達分析

根據測序結果利用beacon designer 7．0設計特異性定量引物（表2），對甜橙c DNA進行擴增，經驗證后的特異性引物進行實時熒光定量PCR。PCR反應體系為25μL，其中包括 SYBGREEN Mix 12．5μL，10μmol／L引物各1μL，反轉錄產物2μL作為模板，每個樣品3個技術重復，空白處理水為模板以排除污染。最后通過IQ5軟件對數(shù)據進行分析。

表2 用于實時熒光定量PCR的引物

2 結果與分析

2．1 柚子c DNA RGA的克隆與序列分析

利用引物對柚c DNA進行擴增，將目的條帶進行回收和克隆，通過RFLP篩選差異陽性克隆，共選取6個送去測序，分別命名為GJ10、GJ17、GJ20、GJ28、GJ31、GJ35，通過DNA MAN軟件將序列與煙草N、亞麻L6、擬南芥RPS2、RPS5、RPP8、RPM1等基因進行多序列比對，發(fā)現(xiàn)除GJ17以外，其余5個序列與選取的R基因具有一致的NBS保守區(qū)（P－loop、kinase－2、GLPL 等）（圖1），上傳到 Gen Bank中，登錄號為H M777043～HM777047。同時，序列分析顯示其在氨基酸水平上的相似性為分別為32．52%、19．71%、28．41%、39．23%、42．86%。通過Clustalx，MEGA等軟件進行進一步的系統(tǒng)分析，構建進化樹（圖2），如圖所示5個RGAs與擬南芥RPS2、RPS5形成一個分支，擬南芥RPM1、RPP8和土豆I2C屬于一個分支簇，亞麻L6和煙草N 屬于一個分支簇。

2．2 定量PCR的表達分析

為確定得到的RGAs是否受黃龍病誘導而表達變化，采用實時熒光定量PCR技術分析其表達。根據得到的RGAs設計的特異性引物以甜橙c DNA為模板均能夠得到擴增曲線，經克隆測序驗證屬于甜橙序列，因此可利用定量PCR方法研究黃龍病侵染過程中5個RGAs的表達情況。同時，根據本實驗室石小剛博士的研究結果，GAPDH和NADH是分析柑橘黃龍病侵染過程中基因表達最合適的內參基因［19］。結果（圖3）顯示在嫁接病芽后8個月的連續(xù)采樣中5個RGAs的表達受到不同程度的調控，GJ20和GJ31在試驗組第2次采樣中表達量大幅上升，而在嫁接病原前后的其余月份中表達相對比較穩(wěn)定；GJ28在試驗組第4次采樣時表達上調，其余幾個月表達趨于穩(wěn)定；GJ35在嫁接病原后總體表達較對照組大幅度下調；GJ10在嫁接病原后3個月時表達下降，其余月份與對照組幾乎達到平衡。

圖1 克隆得到的5個RGAs推導的氨基酸序列與7個已知抗病基因NBS保守結構域的比對

圖2 5個序列推導的氨基酸與已知物種抗病基因蛋白產物的系統(tǒng)進化樹

3 討論

由于黃龍病寄主植物通常樹體大，生長周期長，很難通過傳統(tǒng)方法克隆抗性基因，RGAs的分離鑒定及表達分析可以為抗性基因的克隆提供一定的線索，但是利用基因組DNA為模板擴增得到的RGA或許包含內含子，而從c DNA中得到的序列則是無終止子的編碼序列。迄今為止，從柚c DNA中分離鑒定RGA僅見1篇報道［20］，他們以柚花柱c DNA為模板擴增得到了10個序列，但并未對其進行表達特性的研究分析。本試驗從柚c DNA中成功獲得5個RGAs，所得到的5個RGAs與7個已知的植物抗性基因的NBS保守區(qū)域具有高度相似性。然而，核苷酸結合位點（NBS）僅僅是植物抗性基因的一個保守區(qū)域，它不僅在抗性基因中存在，在ATP和GTP結合蛋白中也存在［21］。除了核苷酸結合位點（NBS），柚NBS－LRR類抗性基因還應具有其他的重要 結 構，例 如 TOLL、TIR（Interluken－1－receptor）或LRR（Leucine－rich repeats），因此所得到的5個RGAs只能作為抗性候選基因。

圖3 接種黃龍病后5個RGAs的相對表達分析

為證實本研究得到的抗病同源基因是否為抗黃龍病相關基因，采用實時熒光定量PCR技術來觀察其在黃龍病病原侵染過程中的表達是否發(fā)生變化，如果能被誘導進行上調或下調表達，則可能是抗病候選特異基因，參與病原侵染過程。由于柚感染黃龍病后相關癥狀表現(xiàn)并不十分明顯，尤其是多年生的大樹，甚至并不能被病原所感染。本試驗嫁接柚多次未能得到感染株，遂利用得到全部感染病程的奧林達夏橙作為定量PCR的材料，因此試驗結果或許會有些許差異。本試驗中的5個RGAs經實時熒光定量PCR后，其表達量均有所變化，可以初步確定為抗病相關基因，但是其表達只是在特定時期發(fā)生微量變化，推測除了病原其表達可能同時也受其他因素的影響。其中GJ20和GJ31在接種后第2月表達量大幅度上升，其余月份表達穩(wěn)定，根據黃龍病的生長情況推測其可能是因為在侵染初期病菌數(shù)量相對較少，對基因表達的誘導不強；而后病菌增殖，致使相關基因表達增強，又反過來抑制了病菌繁殖，使得基因表達下降并最終趨于穩(wěn)定。GJ10、GJ28和GJ35的表達相對來說無明顯的規(guī)律。根據表達情況，推測GJ20和GJ31較有可能與HLB菌的相關抗性基因相關，進一步的試驗主要是通過獲得其全長序列，構建表達載體，通過RNAi技術進一步驗證，以確定其功能。

［1］ Bove J M．Huanglongbing：A destr uctive，newly－emerging，century－old disease of Citr us［J］．Plant Pat hology，2006，88（1）：7－37．

［2］ Wang Z K，Sun X Y，Yin Y P，et al．Comparison of PCR，DIA and pathogenicity assay for detection of Xanthomonas axonopodis pv．citri，the causal agentof citrus bacterial canker disease［J］．Agricultural Science in China，2004，3（6）：442－447．

［3］ Ki m J S，Sagara m U S，Bur ns J K，et al．Response of sweetorange（Citr us sinensis）to‘Candidatus Liberibacter asiaticus’infection，micr oscopy and microarray analyses［J］．Phytopat hology，2009，99（1）：50－57．

［4］ Al brecht U，Bowman K D．Gene expression in Citr us sinensis（L．）Osbeck f ollowing infection with the bacterial pat hogen Candidatus Liberibacter asiaticus causing Huanglongbing in Florida［J］．Plant Science，2008，175（3）：291－306．

［5］ Dutt M，Madhavaraj J，Gr osser J W．Agrobacteriu m t u mef aciens－mediated genetic transfor mation and plant regeneration fro m a co mplex tetraploid hybrid citr us r ootstock［J］．Scientia Horticult urae，2010，123：454－458．

［6］ Hulbert S H，Webb C A，Smit h S M，et al．Resistance gene co mplexes：evolution and utilization［J］．Annual Review of Phytopathology，2001，39：285－312．

［7］ Jones J D．Putting knowledge of plant disease resistance genes to work［J］．Current Opinion in Plant Biology，2001，4：281－287．

［8］ Dangl J L，Jones J D G．Plant pat hogens and integrated defence responses to infection［J］．Nat ure，2001，411：826－833．

［9］ Que Y X，Xu L P，Lin J W，et al．Isolation and characterization of NBS－LRR resistance gene analogs from sugarcane［J］．Acta Agron Sinica，2009，35（4）：631－639．

［10］Aswati N R，Tho mas G．Isolation，characterization and expression st udies of resistance gene candidates（RGCs）from Zingiber spp．［J］．Theoretical and Applied Genetics，2007，116：123－134．

［11］Soriano J M，Vilanova S，Ro mer o C，et al．Characterization and mapping of NBS－LRR resistance gene analogs in apricot（Pr unus ar meniaca L．）［J］．Theoretical and Applied Genetics，2005，110：980－989．

［12］Wang B J，Wang Y J，Wang Q，et al．Characterization of an NBS－LRR resistance gene ho mologue from soybean［J］．Journal of Plant Physiology，2004，161：815－822．

［13］Bozkurt O，Hakki E E，Akkaya M S．Isolation and sequence analysis of wheat NBS－LRR type disease resistance gene analogs using degenerate PCR pri mers［J］．Biochemical Genetics，2007，45：469－486．

［14］闕友雄，許莉萍，林劍偉，等．斑茅NBS－LRR類抗病基因同源序列的克隆與分析［J］．熱帶作物學報，2009，30（2）：192－197．

［15］吳靜，吳茂森，何晨陽．實時定量PCR的原理及其在植物病理學研究中的應用［J］．植物保護，2007，33（6）：123－128．

［16］蔡高磊，王曉杰，劉丹，等．條銹菌誘導的小麥Ta OZR的克隆及特征分析［J］．中國農業(yè)科學，2010，43（12）：2403－2409．

［17］張薇，楊秀芬，邱德文，等．激活蛋白Pea T1誘導煙草對T MV的系統(tǒng)抗性［J］．植物病理學報，2010，40（3）：290－299．

［18］楊立桃，丁嘉羽，張大兵，等．利用實時熒光定量PCR方法分析轉基因水稻外源基因拷貝數(shù)［J］．中國食品衛(wèi)生雜志，2005，17（2）：140－144．

［19］Shi X G，Hu X F，Yin Y P，et al．Reference gene selection for gene expression analysis in Huanglongbing infected sweetorange of citr us［J］．（sub mitted to BMC Molecular Biology）．

［20］黃代青，王平，呂柳新．柚c DNA中NBS－LRR類R基因同源序列的分離［J］．中國農業(yè)科學，2004，37（10）：1580－1584．

［21］Shirasu K，Schulze－Lefert P．Regulators of cell deat h in disease resistance［J］．Plant Mol Biol，2003，44：371－385．