金海燕，鐘久昌，2，宋 蓓，2，葉佳穎，張麗紅，李宇琳，2，于 茜，徐旭東，林國(guó)珍

(1.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院臨床心理科與醫(yī)學(xué)基因組學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200025;2.上海市高血壓研究所，上海市血管生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200025;3.寧波大學(xué)醫(yī)學(xué)院分子高血壓研究室，浙江寧波 315211;4.復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院解剖與組織胚胎學(xué)系上海 200032)

高血壓病是危害人類健康的最常見(jiàn)的慢性病，也是心腦血管病最主要的危險(xiǎn)因素［1－2］。血管緊張素Ⅱ(angiotensinⅡ，AngⅡ)及其新近發(fā)現(xiàn)的催化酶血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2(angiotensin-converting enzyme 2，ACE2)是機(jī)體內(nèi)血管一氧化氮(nitric oxide，NO)生成與氧化應(yīng)激狀態(tài)的關(guān)鍵調(diào)控因子，在高血壓病的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中起著重要的作用［3－6］。替米沙坦(telmisartan)為一種新型長(zhǎng)效的AngⅡ1型受體(AT1)的拮抗劑(ARB)，已廣泛應(yīng)用于臨床治療高血壓患者［1，7－8］，但其是否通過(guò)調(diào)控血管 ACE2表達(dá)進(jìn)而在血管氧化應(yīng)激調(diào)控中發(fā)揮作用目前尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究旨在探討替米沙坦(telmisartan)對(duì)自發(fā)性高血壓大鼠(spontaneously hypertensive rat，SHR)血管ACE2表達(dá)的影響及其參與血管保護(hù)功效可能的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司［許可證號(hào) SCXK(滬)2007-0005］提供SHR大鼠24只及同源對(duì)照WKY(Wistar-Kyoto rats，WKY)大鼠8只。將大鼠隨機(jī)分成4組，每組8只:WKY對(duì)照組(WKY-C);SHR對(duì)照組(SHR-C);低劑量替米沙坦治療組(SHR-L);高劑量替米沙坦治療組(SHRH)。大鼠均為♂，9～10周齡，體質(zhì)量(250±30)g。大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。替米沙坦由德國(guó)Boehringer Ingelheim公司提供，溶解于無(wú)菌生理鹽水中，配制濃度為1 g·L－1。大鼠每日灌胃給藥(telmisartan 5或10 mg·kg－1或安慰劑生理鹽水 5 mg·kg－1)，為期10周。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，麻醉處死大鼠，分離胸主動(dòng)脈迅速置于液氮，后轉(zhuǎn)入－80℃待測(cè)。

1.2 Western blot用Bradford法測(cè)定大鼠主動(dòng)脈組織總蛋白濃度。采用常規(guī)的Western blot法檢測(cè)大鼠主動(dòng)脈組織中ACE2蛋白與eNOS磷酸化水平。取40 μg總蛋白進(jìn)樣于預(yù)灌制的8～10%聚丙烯酰胺凝膠中，100伏電泳2 h，然后電轉(zhuǎn)移至PVDF膜。用5%脫脂奶粉室溫封閉2 h后，將膜采用抗ACE2、eNOS一抗及抗磷酸化p-eNOS(Ser1177)一抗(美國(guó)Santa Cruz及Cell Signaling公司)孵育過(guò)夜。洗膜后接著室溫下將膜用二抗孵育1 h 30 min，洗膜3次，每次10 min。最后采用ECL試劑盒顯影曝光，對(duì)特異性條帶進(jìn)行半定量分析，同時(shí)采用α-tubulin蛋白作為內(nèi)對(duì)照。

1.3 NO含量測(cè)定采用硝酸還原酶比色法檢測(cè)主動(dòng)脈組織中硝酸鹽(NO3－)和亞硝酸鹽(NO2－)含量來(lái)間接反映各種條件刺激下大鼠主動(dòng)脈組織中NO水平。NO檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京建成生物有限公司，嚴(yán)格按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。采用Beckman可見(jiàn)光－紫外分光光度儀，在550 nm條件下，0.5 cm光徑比色測(cè)各管吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算NO含量。同時(shí)設(shè)立空白對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照組，每個(gè)樣品檢測(cè)3次，取其平均值。

1.4 丙二醛(MDA)含量測(cè)定采用硫代巴比妥酸(TBA)比色法測(cè)定大鼠主動(dòng)脈組織MDA含量，其原理是過(guò)氧化脂質(zhì)產(chǎn)物中的MDA可與TBA縮合，形成紅色產(chǎn)物，在532 nm處有最大吸收峰。MDA檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京建成生物有限公司，采用分光光度計(jì)測(cè)定收集主動(dòng)脈組織上清MDA含量，嚴(yán)格按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理資料數(shù)據(jù)以±s表示，采用SPSS(16.0)軟件進(jìn)行分析處理。多個(gè)樣本均數(shù)的比較采用單因素方差分析;多個(gè)樣本均數(shù)的兩兩比較采用t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 替米沙坦對(duì)SHR大鼠血管ACE2蛋白表達(dá)的影響如Fig 1所示，與WKY大鼠相比，SHR大鼠主動(dòng)脈組織中ACE2蛋白水平明顯降低(0.39±0.05 vs 1.00±0.06，P＜0.01)。與SHR對(duì)照組相比，替米沙坦低、高劑量治療組SHR大鼠主動(dòng)脈組織中 ACE2蛋白表達(dá)均明顯上升(0.62±0.06，0.65±0.07 vs 0.39±0.05，P 值均 ＜0.05)。

2.2 替米沙坦對(duì)SHR大鼠血管eNOS磷酸化表達(dá)及NO水平的影響與WKY對(duì)照組相比，SHR大鼠主動(dòng)脈組織中Ser1177-eNOS磷酸化水平明顯降低，伴NO水平下調(diào)(p-eNOS:0.43±0.06 vs 1.00±0.04;NO mmol·g－1protein:11.5 ± 2.1 vs 27.8 ±4.9;P值均＜0.01，F(xiàn)ig 2、3)。而經(jīng)替米沙坦治療后，SHR大鼠(SHR-L與SHR-H組)主動(dòng)脈Ser1177-eNOS磷酸化表達(dá)和NO水平則明顯增加(p-eNOS:0.68 ±0.07，0.71 ±0.06 vs 0.43 ±0.06;NO mmol·g－1protein:19.2 ±3.3，23.9 ±3.2 vs 11.5 ±2.1;P值均 ＜0.05，F(xiàn)ig 2、3)。

Fig 1 ACE2 protein expression in aortas of WKY rats and SHR

Fig 2 Effects of Telmisartan on Ser1177-eNOS phosphorylation level in rat aortas

2.3 替米沙坦治療后SHR大鼠血管MDA含量的改變?nèi)鏔ig 4所示，與WKY對(duì)照組相比，SHR大鼠主動(dòng)脈組織 MDA含量上升(393.9±17.9 vs 186.3 ±14.5 nmol·g－1protein;P ＜0.01)。而經(jīng)低、高劑量替米沙坦治療后，SHR主動(dòng)脈組織MDA含量則明顯降低(271.9±16.1，249.2±19.6 vs 393.9±17.9 nmol·g－1protein;P 值均 ＜0.05)。

3 討論

Fig 3 Effects of Telmisartan on NO level in rat aortas(mmol·g－1Pro)

Fig 4 Effects of Telmisartan on MDA contents in rat aortas(nmol·g－1Pro)

活性氧族(reactiveoxygenspecies，ROS)增加及氧化應(yīng)激增強(qiáng)參與高血壓病的發(fā)生、發(fā)展，最終導(dǎo)致高血壓內(nèi)皮功能紊亂和心血管等靶器官損害［3－4，9］。在腎素血管緊張素系統(tǒng)(renin-angiotensin system，RAS)中，AngⅡ是心血管系統(tǒng)中ROS生成和氧化應(yīng)激的重要激活物［3，5－6，9－11］。ROS 參與多種細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，引發(fā)血管炎癥反應(yīng)、細(xì)胞增殖及血管重塑等過(guò)程，最終導(dǎo)致高血壓病的發(fā)?。?，5－6，9］。NO主要由內(nèi)皮來(lái)源的NO合酶eNOS催化L-精氨酸代謝生成，具有擴(kuò)張血管、抗炎癥、抑制細(xì)胞凋亡等作用，對(duì)心血管系統(tǒng)具有保護(hù)作用。機(jī)體內(nèi)心血管組織ROS的過(guò)度生成會(huì)降低NO的生物活性，削弱心血管組織的抗氧化能力，從而導(dǎo)致心血管組織損害［9－11］。有趣的是，本研究發(fā)現(xiàn)，與 WKY 對(duì)照大鼠相比，SHR大鼠血管組織中出現(xiàn)eNOS磷酸化水平下降，同時(shí)伴血管NO水平下調(diào)及MDA水平增加。MDA是細(xì)胞膜氧自由基連鎖反應(yīng)的終產(chǎn)物之一，其含量直接反映細(xì)胞脂質(zhì)過(guò)氧化的速率和強(qiáng)度，代表細(xì)胞的氧化應(yīng)激水平。上述提示高血壓大鼠主動(dòng)脈組織中eNOS/NO體系下調(diào)可能導(dǎo)致抗氧化能力下調(diào)，通過(guò)促進(jìn)MDA生成增加，導(dǎo)致高血壓大鼠血管組織氧化應(yīng)激增強(qiáng)。

ACE2表達(dá)或活性異?？赡軈⑴c高血壓病的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程，通過(guò)調(diào)節(jié)ACE2的轉(zhuǎn)錄與表達(dá)為防治高血壓病及其并發(fā)癥的重要手段［1，6，10］。在新的RAS中，ACE2可高效降解 ACE的作用產(chǎn)物 AngⅡ，使之生成Ang-(1-7);還可競(jìng)爭(zhēng)性地作用于ACE的底物AngⅠ，使之生成Ang-(1-9)，后者經(jīng)ACE作用進(jìn)一步生成為Ang-(1-7)。Ang-(1-7)為一種較強(qiáng)的舒血管物質(zhì)肽，主要分布于心臟、血管、腎臟等處和血液中，通過(guò)結(jié)合Mas受體促進(jìn)緩激肽、前列腺素和NO的釋放，發(fā)揮其擴(kuò)血管、抗氧化及促凋亡等功效［1，4，9－11］。ACE2 基因通過(guò)拮抗 AngⅡ的作用減少ROS生成，從而發(fā)揮一定的抗氧化功效。新近研究顯示，ACE2的過(guò)表達(dá)能改善小鼠NOS活性且增加NO信號(hào)，從而降低機(jī)體氧化應(yīng)激水平，而ACE2基因敲除小鼠出現(xiàn)機(jī)體內(nèi)氧化應(yīng)激水平增加，造成各組織氧化損傷［6，9］。本研究發(fā)現(xiàn)，與WKY對(duì)照大鼠相比，SHR大鼠血管組織中出現(xiàn)ACE2蛋白水平降低，同時(shí)伴有eNOS/NO體系下調(diào)及MDA 增加。Zhong等［5－6］新近研究證實(shí)，Ang Ⅱ可以導(dǎo)致小鼠心臟組織ACE2表達(dá)下調(diào)，而ACE2基因缺失或表達(dá)減少可導(dǎo)致心臟和腎臟組織細(xì)胞內(nèi)NADPH氧化酶的活性增加，同時(shí)伴有白介素(IL)-1、IL-6、腫瘤壞死因子等炎癥介質(zhì)增加，從而加重AngⅡ介導(dǎo)的心血管及腎臟組織氧化損傷。替米沙坦能通過(guò)選擇性地、不可逆地阻斷AngⅡ與其1型受體AT1結(jié)合，減少AT1受體所介導(dǎo)AngⅡ引起心血管的肥大、細(xì)胞增殖和血管氧化應(yīng)激生成，另外還可能反饋性增加AngⅡ與AT2受體的結(jié)合，進(jìn)而抑制心血管增殖及氧化應(yīng)激損傷，發(fā)揮其心血管保護(hù)作用［2，7－8，12］。另外，替米沙坦具有特異性的苯丙咪唑環(huán)和異芳香基團(tuán)，具備脂溶性強(qiáng)和組織穿透性高的特性，與AT1受體的親合力更高，從而對(duì)AngⅡ的拮抗作用更強(qiáng)、更持久［2，8，12］。本研究結(jié)果顯示，長(zhǎng)期替米沙坦治療后，SHR大鼠血管組織中出現(xiàn)ACE2蛋白和eNOS磷酸化水平增加，同時(shí)伴血管NO生成增加及MDA水平降低，提示替米沙坦通過(guò)調(diào)節(jié)血管ACE2基因表達(dá)及改善eNOS/NO信號(hào)，對(duì)逆轉(zhuǎn)高血壓大鼠血管組織氧化應(yīng)激損傷中起到一定的作用，從而實(shí)現(xiàn)其在高血壓治療中的血管保護(hù)功效，但其相關(guān)機(jī)制有待于深入探討。ACE2的發(fā)現(xiàn)拓展了RAS體系，為深入研究高血壓的氧化應(yīng)激機(jī)制及尋求更加符合生理的改善氧化應(yīng)激治療策略提供了機(jī)遇。通過(guò)各種途徑干預(yù)ACE2表達(dá)及活性，可望成為高血壓病等氧化應(yīng)激性疾病防治的新途徑。

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