王 晨 丁井永 王 珂 史恒軍 第四軍醫(yī)大學唐都醫(yī)院中醫(yī)科（西安 710038）

本文將采用酒精性肝損傷模型來研究肝樂康膠囊對肝損傷的保護作用，為其臨床應用提供更多依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及試劑

1.1.1 實驗動物 昆明種小鼠，雄性，體重（20±2）g，河南省實驗動物中心提供，合格證號：0000713；許可證號SCXK（豫）2005－0001。飼料、墊料均由實驗動物中心提供。在恒溫21～24℃，相對濕度45%～50%的環(huán)境中適應飼養(yǎng)1周后實驗。

1.1.2 實驗試劑 52°紅星二鍋頭購自家樂福超市，加蒸餾水配制為實驗所需；肝樂康膠囊由內(nèi)蒙古自治區(qū)教育廳重點實驗室內(nèi)蒙古民族大學蒙醫(yī)藥學院提供；復方益肝靈片，21mg水飛薊素／片，吉林省博威藥業(yè)有限公司，批號：20101004；谷丙轉(zhuǎn)氨酶（Alanine aminotransferase，ALT）測定試劑盒（批號：20110808）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（Aspartate aminotransferase，AST）測定試劑盒（批號：20110808）、丙二醛（Malondialdehyde，MDA）測定試劑盒（批號：20110810）、還原性谷胱甘肽（Reduced gluta－thione hormone，GSH）測定試劑盒（批號：20110730）、超氧化物 歧 化 酶 （superoxide dismutase，SOD）試 劑 盒 （批 號：20110807）均為南京建成生物工程研究所生產(chǎn)；山梨醇脫氫酶（Sorbitol dehydrogense，SDH）酶 聯(lián) 免 疫 試 劑 盒 （批 號：20110724）為上海逸峰生物科技有限公司生產(chǎn)。

1.1.3 實驗儀器 Sartorius BP 211D型電子分析天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）；SK 5200HP型超聲波清洗機（上?？茖С曈邢薰荆?；QL－861型漩渦混勻器（海門市其林貝爾儀器制造有限公司）；TG16－WS高速離心機（湖南賽特湘儀離心機儀器有限公司）；731紫外分光光度儀（上海美譜達儀器有限公司）；Olympus BX5顯微鏡（日本Olympus株式會社）；DZKW型電熱恒溫水浴鍋（北京市永光明醫(yī)療儀器廠）；DQP－9010石蠟冷凍切片機（上海華巖儀器設備有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 實驗方法 昆明種小鼠72只隨機分成6組，每組12只，分別為正常組，模型組，陽性藥物益肝靈組，肝樂康膠囊（GLK）低劑量組（0.24g／kg），GLK中劑量組（0.48g／kg），GLK高劑量組（0.96g／kg），各組小鼠按文獻方法［1］，正常組給予蒸餾水，模型組不給藥物干預，陽性藥物組按0.2g／kg灌胃給予益肝靈混懸液；康樂膠囊高中低組分別按0.24、0.48、0.96g／kg灌胃給藥，給藥30min后，除正常對照組外，其余各組小鼠均灌胃35度二鍋頭白酒16mL·kg－1，正常對照組灌胃等容積的蒸餾水。第10天給酒后禁食不禁水，20h后眼靜脈采血，常規(guī)離心后分離血清測定ALT、AST和SDH活力。同時迅速剖取肝臟，取小鼠肝左葉適量，制備10%肝勻漿，備用。另取肝右葉作病理組織學檢查。

1.2.2 主要指標測定 取血清，測定血清中ALT、AST和SDH活力；取肝勻漿，測其GSH、MDA和SOD含量；各指標測定方法均按試劑盒說明書操作。

1.2.3 病理觀察 將5%福爾馬林所固定的肝組織石蠟包埋切片，HE染色，200倍光鏡下觀察其病變。

1.2.4 統(tǒng)計學處理 實驗數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，組間多項數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析，若有差別，采用LSD檢驗對各劑量組均數(shù)與模型對照組進行差異顯著性檢驗。P＜0.05認為具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 肝樂康膠囊對小鼠血清ALT、AST和SDH的影響

與正常組對比，模型組中血清ALT、AST和SDH顯著升高（P＜0.05）；與模型組對比，GLK高劑量組和中劑量組能顯著降低血清中ALT、AST和SDH水平，具有顯著性差異（P＜0.05）；GLK低劑量組雖能降低血清中ALT、AST和SDH水平，但是無顯著性差異（P＞0.05）；與陽性藥益肝靈組對比，GLK中劑量組療效沒有益肝靈顯著（P＜0.05），GLK高劑量組療效和益肝靈相當（P＞0.05）。由此可以看出，肝樂康膠囊能夠顯著降低血清中ALT、AST和SDH活性，其療效和益肝靈相當。結(jié)果見表1。

表1 肝樂康膠囊對小鼠血清ALT、AST和SDH的影響（，n＝12）

表1 肝樂康膠囊對小鼠血清ALT、AST和SDH的影響（，n＝12）

注：△ 與益肝靈組對比，P＜0.05▲與空白組對比，P＜0.05；◇與模型組比較，P＜0.05；

組 別 劑量（g／kg） ALT（IU／L） AST（IU／L） SDH（IU／L）空白組 —— 43.42±6.03△ 39.74±3.55△ 3.67±0.38模型組 —— 216.91±32.18▲△ 237.50±31.56▲△ 24.92±1.96▲△益肝靈組 0.2 89.60±13.76◇ 92.81±15.73◇ 8.32±1.58◇GLK低劑量 0.24 192.04±33.25△ 198.01±27.52△ 21.48±1.75 GLK中劑量 0.48 116.43±21.65◇△ 120.15±16.54◇△ 12.06±1.12◇△GLK高劑量 0.96 89.67±10.65◇ 86.93±11.43◇ 5.08±0.19◇

2.2 肝樂康膠囊對肝組織中GSH、MDA和SOD的影響與空白組對比，模型組中肝組織GSH和SOD含量明顯降低（P＜0.05），MDA含量顯著升高（P＜0.05）；與模型組對比，GLK高劑量組和中劑量組能顯著升高肝組織GSH和SOD含量（P＜0.05），降低 MDA含量（P＜0.05），而GLK低劑量組雖能升高肝組織中GSH和SOD含量，降低MDA含量，但是無顯著性差異（P＞0.05）；與陽性藥益肝靈組對比，GLK中劑量組在GSH和MDA的改善方面與益肝靈相當（P＞0.05），GLK高劑量組療效顯著優(yōu)于益肝靈（P＜0.05），改善SOD的療效對比，GLK高劑量組療效和益肝靈相當（P＞0.05）。由此可以看出，GLK能顯著降低肝組織中的MDA含量，升高GSH和SOD含量，其療效和益肝靈相當。結(jié)果見表2。

2.3 肝樂康膠囊對小鼠肝組織病理變化的影響 由HE染色病理切片圖可知，正常對照組肝細胞以中央靜脈為中心呈放射狀排列，細胞核明顯，肝索正常。模型組小鼠肝組織中央靜脈明顯擴張，胞漿液連成一片，幾乎看不到細胞膜，肝細胞嚴重壞死，并且可觀察到周圍大量炎性細胞浸潤，存在不同程度的氣球性樣變；GLK低劑量組相對模型組肝細胞稍微有些改善，但是損傷依然嚴重；GLK中、高劑量組能明顯改善這種損傷，壞死細胞也已經(jīng)修復，中央靜脈周圍只有少量的炎性細胞。結(jié)果見圖1。

圖1 GLK對小鼠酒精性肝損傷的肝組織病理變化 （A）正常組；（B）模型組；（C）益肝靈組；（D）（E）和（F）分別為GLK低、中、高劑量組。肝組織切片采用HE染色（200×）

表2 肝樂康膠囊對小鼠肝組織中GSH、MDA和SOD的影響（，n＝12）

表2 肝樂康膠囊對小鼠肝組織中GSH、MDA和SOD的影響（，n＝12）

注：△與益肝靈組對比P＜0.05，▲與空白組對比P＜0.05，◇與模型組對比P＜0.05。

組 別 劑量（mg／kg） GSH（mg／gprot） MDA（nmol／mgprot） SOD（U／mgprot）空白組 —— 2.47±0.38△ 0.59±0.09△ 248.86±23.81△模型組 —— 1.76±0.34▲△ 1.32±0.39▲△ 99.47±16.23▲△益肝靈組 0.2 2.05±0.31◇ 0.81±0.09◇ 212.63±25.91◇GLK低劑量 0.24 1.86±0.25△ 1.05±0.23△ 120.54±16.80△GLK中劑量 0.48 2.01±0.37◇ 0.83±0.12◇ 185.87±29.98◇△GLK高劑量 0.96 2.31±0.21◇△ 0.72±0.06◇△ 203.87±24.90◇

3 討 論

多數(shù)學者認為酒精中毒所引起的肝損傷與酒精代謝產(chǎn)物乙醛的直接毒性作用有關。乙醛毒性作用可歸納為：通過黃嘌呤氧化酶產(chǎn)生超氧離子，使脂質(zhì)過氧化；使微管蛋白解聚，細胞內(nèi)蛋白質(zhì)和水分滯留，細胞腫脹造成肝細胞壞死；干擾線粒體氧化磷酸化和電子傳遞系統(tǒng)。乙醛的活性很高，酒精性肝損傷的發(fā)展和乙醛的活性密切相關［2］。

SOD為高效清道夫，可抑制自由基啟動的脂質(zhì)過氧化，其變化可間接反應疾病情況下自由基的變化。MDA是脂質(zhì)過氧化的最終產(chǎn)物，可嚴重破壞細胞膜的結(jié)構(gòu)，導致細胞腫脹，壞死，其含量反映了組織過氧化的損傷程度［3］。

組織病理學檢查在肝臟疾病的診斷、分類及預后判定上占有重要地位，是明確診斷、衡量炎癥活動度、纖維化程度以及判定藥物療效的金標準。

本研究結(jié)果表明，肝樂康膠囊可顯著抑制血清ALT、AST和SDH，減輕肝細胞脂肪變性及炎性細胞浸潤，說明其具有抑制肝細胞、肝損傷的作用。此外，肝樂康膠囊能明顯降低肝損傷小鼠肝組織中異常升高的MDA含量，升高SOD和GSH含量，提示肝樂康膠囊抑制肝纖維化可能與抑制MDA的產(chǎn)生、抗自由基等作用有關，其作用機制及在臨床上是否有抗肝損傷的療效有待進一步深入研究。

［1］秦冬梅，胡利萍，曹文疆，等.維藥菊苣提取物對小鼠急性酒精性肝損傷的保護作用［J］.中國實驗方劑學雜志，2011，17（7）：128－131.

［2］李秀敏，李慧莉.乙醇誘導肝損傷作用機制概述［J］.中國藥師，2008，11（9）：1114－1116.

［3］金香子，金 政，蔡英蘭.決明子水提物D－半乳糖中毒大鼠急性肝損傷的保護作用［J］.時珍國醫(yī)國藥，2007，18（3）：582－583.