王 晨 丁井永 王 珂 史恒軍 第四軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院中醫(yī)科（西安 710038）

本文將采用酒精性肝損傷模型來研究肝樂康膠囊對(duì)肝損傷的保護(hù)作用，為其臨床應(yīng)用提供更多依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及試劑

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 昆明種小鼠，雄性，體重（20±2）g，河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào)：0000713；許可證號(hào)SCXK（豫）2005－0001。飼料、墊料均由實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。在恒溫21～24℃，相對(duì)濕度45%～50%的環(huán)境中適應(yīng)飼養(yǎng)1周后實(shí)驗(yàn)。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑 52°紅星二鍋頭購(gòu)自家樂福超市，加蒸餾水配制為實(shí)驗(yàn)所需；肝樂康膠囊由內(nèi)蒙古自治區(qū)教育廳重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室內(nèi)蒙古民族大學(xué)蒙醫(yī)藥學(xué)院提供；復(fù)方益肝靈片，21mg水飛薊素／片，吉林省博威藥業(yè)有限公司，批號(hào)：20101004；谷丙轉(zhuǎn)氨酶（Alanine aminotransferase，ALT）測(cè)定試劑盒（批號(hào)：20110808）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（Aspartate aminotransferase，AST）測(cè)定試劑盒（批號(hào)：20110808）、丙二醛（Malondialdehyde，MDA）測(cè)定試劑盒（批號(hào)：20110810）、還原性谷胱甘肽（Reduced gluta－thione hormone，GSH）測(cè)定試劑盒（批號(hào)：20110730）、超氧化物 歧 化 酶 （superoxide dismutase，SOD）試 劑 盒 （批 號(hào)：20110807）均為南京建成生物工程研究所生產(chǎn)；山梨醇脫氫酶（Sorbitol dehydrogense，SDH）酶 聯(lián) 免 疫 試 劑 盒 （批 號(hào)：20110724）為上海逸峰生物科技有限公司生產(chǎn)。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器 Sartorius BP 211D型電子分析天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）；SK 5200HP型超聲波清洗機(jī)（上?？茖?dǎo)超聲有限公司）；QL－861型漩渦混勻器（海門市其林貝爾儀器制造有限公司）；TG16－WS高速離心機(jī)（湖南賽特湘儀離心機(jī)儀器有限公司）；731紫外分光光度儀（上海美譜達(dá)儀器有限公司）；Olympus BX5顯微鏡（日本Olympus株式會(huì)社）；DZKW型電熱恒溫水浴鍋（北京市永光明醫(yī)療儀器廠）；DQP－9010石蠟冷凍切片機(jī)（上海華巖儀器設(shè)備有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)方法 昆明種小鼠72只隨機(jī)分成6組，每組12只，分別為正常組，模型組，陽(yáng)性藥物益肝靈組，肝樂康膠囊（GLK）低劑量組（0.24g／kg），GLK中劑量組（0.48g／kg），GLK高劑量組（0.96g／kg），各組小鼠按文獻(xiàn)方法［1］，正常組給予蒸餾水，模型組不給藥物干預(yù)，陽(yáng)性藥物組按0.2g／kg灌胃給予益肝靈混懸液；康樂膠囊高中低組分別按0.24、0.48、0.96g／kg灌胃給藥，給藥30min后，除正常對(duì)照組外，其余各組小鼠均灌胃35度二鍋頭白酒16mL·kg－1，正常對(duì)照組灌胃等容積的蒸餾水。第10天給酒后禁食不禁水，20h后眼靜脈采血，常規(guī)離心后分離血清測(cè)定ALT、AST和SDH活力。同時(shí)迅速剖取肝臟，取小鼠肝左葉適量，制備10%肝勻漿，備用。另取肝右葉作病理組織學(xué)檢查。

1.2.2 主要指標(biāo)測(cè)定 取血清，測(cè)定血清中ALT、AST和SDH活力；取肝勻漿，測(cè)其GSH、MDA和SOD含量；各指標(biāo)測(cè)定方法均按試劑盒說明書操作。

1.2.3 病理觀察 將5%福爾馬林所固定的肝組織石蠟包埋切片，HE染色，200倍光鏡下觀察其病變。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，組間多項(xiàng)數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析，若有差別，采用LSD檢驗(yàn)對(duì)各劑量組均數(shù)與模型對(duì)照組進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)。P＜0.05認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 肝樂康膠囊對(duì)小鼠血清ALT、AST和SDH的影響

與正常組對(duì)比，模型組中血清ALT、AST和SDH顯著升高（P＜0.05）；與模型組對(duì)比，GLK高劑量組和中劑量組能顯著降低血清中ALT、AST和SDH水平，具有顯著性差異（P＜0.05）；GLK低劑量組雖能降低血清中ALT、AST和SDH水平，但是無(wú)顯著性差異（P＞0.05）；與陽(yáng)性藥益肝靈組對(duì)比，GLK中劑量組療效沒有益肝靈顯著（P＜0.05），GLK高劑量組療效和益肝靈相當(dāng)（P＞0.05）。由此可以看出，肝樂康膠囊能夠顯著降低血清中ALT、AST和SDH活性，其療效和益肝靈相當(dāng)。結(jié)果見表1。

表1 肝樂康膠囊對(duì)小鼠血清ALT、AST和SDH的影響（，n＝12）

表1 肝樂康膠囊對(duì)小鼠血清ALT、AST和SDH的影響（，n＝12）

注：△ 與益肝靈組對(duì)比，P＜0.05▲與空白組對(duì)比，P＜0.05；◇與模型組比較，P＜0.05；

組 別 劑量（g／kg） ALT（IU／L） AST（IU／L） SDH（IU／L）空白組 —— 43.42±6.03△ 39.74±3.55△ 3.67±0.38模型組 —— 216.91±32.18▲△ 237.50±31.56▲△ 24.92±1.96▲△益肝靈組 0.2 89.60±13.76◇ 92.81±15.73◇ 8.32±1.58◇GLK低劑量 0.24 192.04±33.25△ 198.01±27.52△ 21.48±1.75 GLK中劑量 0.48 116.43±21.65◇△ 120.15±16.54◇△ 12.06±1.12◇△GLK高劑量 0.96 89.67±10.65◇ 86.93±11.43◇ 5.08±0.19◇

2.2 肝樂康膠囊對(duì)肝組織中GSH、MDA和SOD的影響與空白組對(duì)比，模型組中肝組織GSH和SOD含量明顯降低（P＜0.05），MDA含量顯著升高（P＜0.05）；與模型組對(duì)比，GLK高劑量組和中劑量組能顯著升高肝組織GSH和SOD含量（P＜0.05），降低 MDA含量（P＜0.05），而GLK低劑量組雖能升高肝組織中GSH和SOD含量，降低MDA含量，但是無(wú)顯著性差異（P＞0.05）；與陽(yáng)性藥益肝靈組對(duì)比，GLK中劑量組在GSH和MDA的改善方面與益肝靈相當(dāng)（P＞0.05），GLK高劑量組療效顯著優(yōu)于益肝靈（P＜0.05），改善SOD的療效對(duì)比，GLK高劑量組療效和益肝靈相當(dāng)（P＞0.05）。由此可以看出，GLK能顯著降低肝組織中的MDA含量，升高GSH和SOD含量，其療效和益肝靈相當(dāng)。結(jié)果見表2。

2.3 肝樂康膠囊對(duì)小鼠肝組織病理變化的影響 由HE染色病理切片圖可知，正常對(duì)照組肝細(xì)胞以中央靜脈為中心呈放射狀排列，細(xì)胞核明顯，肝索正常。模型組小鼠肝組織中央靜脈明顯擴(kuò)張，胞漿液連成一片，幾乎看不到細(xì)胞膜，肝細(xì)胞嚴(yán)重壞死，并且可觀察到周圍大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，存在不同程度的氣球性樣變；GLK低劑量組相對(duì)模型組肝細(xì)胞稍微有些改善，但是損傷依然嚴(yán)重；GLK中、高劑量組能明顯改善這種損傷，壞死細(xì)胞也已經(jīng)修復(fù)，中央靜脈周圍只有少量的炎性細(xì)胞。結(jié)果見圖1。

圖1 GLK對(duì)小鼠酒精性肝損傷的肝組織病理變化 （A）正常組；（B）模型組；（C）益肝靈組；（D）（E）和（F）分別為GLK低、中、高劑量組。肝組織切片采用HE染色（200×）

表2 肝樂康膠囊對(duì)小鼠肝組織中GSH、MDA和SOD的影響（，n＝12）

表2 肝樂康膠囊對(duì)小鼠肝組織中GSH、MDA和SOD的影響（，n＝12）

注：△與益肝靈組對(duì)比P＜0.05，▲與空白組對(duì)比P＜0.05，◇與模型組對(duì)比P＜0.05。

組 別 劑量（mg／kg） GSH（mg／gprot） MDA（nmol／mgprot） SOD（U／mgprot）空白組 —— 2.47±0.38△ 0.59±0.09△ 248.86±23.81△模型組 —— 1.76±0.34▲△ 1.32±0.39▲△ 99.47±16.23▲△益肝靈組 0.2 2.05±0.31◇ 0.81±0.09◇ 212.63±25.91◇GLK低劑量 0.24 1.86±0.25△ 1.05±0.23△ 120.54±16.80△GLK中劑量 0.48 2.01±0.37◇ 0.83±0.12◇ 185.87±29.98◇△GLK高劑量 0.96 2.31±0.21◇△ 0.72±0.06◇△ 203.87±24.90◇

3 討 論

多數(shù)學(xué)者認(rèn)為酒精中毒所引起的肝損傷與酒精代謝產(chǎn)物乙醛的直接毒性作用有關(guān)。乙醛毒性作用可歸納為：通過黃嘌呤氧化酶產(chǎn)生超氧離子，使脂質(zhì)過氧化；使微管蛋白解聚，細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)和水分滯留，細(xì)胞腫脹造成肝細(xì)胞壞死；干擾線粒體氧化磷酸化和電子傳遞系統(tǒng)。乙醛的活性很高，酒精性肝損傷的發(fā)展和乙醛的活性密切相關(guān)［2］。

SOD為高效清道夫，可抑制自由基啟動(dòng)的脂質(zhì)過氧化，其變化可間接反應(yīng)疾病情況下自由基的變化。MDA是脂質(zhì)過氧化的最終產(chǎn)物，可嚴(yán)重破壞細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致細(xì)胞腫脹，壞死，其含量反映了組織過氧化的損傷程度［3］。

組織病理學(xué)檢查在肝臟疾病的診斷、分類及預(yù)后判定上占有重要地位，是明確診斷、衡量炎癥活動(dòng)度、纖維化程度以及判定藥物療效的金標(biāo)準(zhǔn)。

本研究結(jié)果表明，肝樂康膠囊可顯著抑制血清ALT、AST和SDH，減輕肝細(xì)胞脂肪變性及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，說明其具有抑制肝細(xì)胞、肝損傷的作用。此外，肝樂康膠囊能明顯降低肝損傷小鼠肝組織中異常升高的MDA含量，升高SOD和GSH含量，提示肝樂康膠囊抑制肝纖維化可能與抑制MDA的產(chǎn)生、抗自由基等作用有關(guān)，其作用機(jī)制及在臨床上是否有抗肝損傷的療效有待進(jìn)一步深入研究。

［1］秦冬梅，胡利萍，曹文疆，等.維藥菊苣提取物對(duì)小鼠急性酒精性肝損傷的保護(hù)作用［J］.中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2011，17（7）：128－131.

［2］李秀敏，李慧莉.乙醇誘導(dǎo)肝損傷作用機(jī)制概述［J］.中國(guó)藥師，2008，11（9）：1114－1116.

［3］金香子，金 政，蔡英蘭.決明子水提物D－半乳糖中毒大鼠急性肝損傷的保護(hù)作用［J］.時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2007，18（3）：582－583.