范 昕 北京市房山區(qū)良鄉(xiāng)醫(yī)院 （北京 102401）

葛根為豆科植物野葛Pueraria lobata（Willd.）ohwi的干燥根，主要功效成分為異黃酮，具有擴(kuò)張血管、改善心肌的氧代謝、改善微循環(huán)、降低血管阻力等作用，廣泛應(yīng)用于心腦血管的防治。目前，關(guān)于葛根的研究主要是局限在葛根中幾個(gè)異黃酮的藥動(dòng)學(xué)，而對(duì)葛根總黃酮提取物的藥動(dòng)學(xué)研究較少。本實(shí)驗(yàn)結(jié)合離體和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)預(yù)測(cè)藥物的吸收情況。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥品與儀器 葛根素、大豆苷、大豆苷元和染料木素為本實(shí)驗(yàn)室自制，經(jīng)HPLC法測(cè)定含量均在98%以上。葛根（產(chǎn)地：四川；批號(hào)100623），經(jīng)本院周偉副教授鑒定為正品。葛根總黃酮提取物 （本院化學(xué)室，含葛根素44.57%，大豆苷12.53%，大豆苷元3.87%，染料木素2.74%）。Agilent1100高效液相色譜儀，DAD二極管陣列檢測(cè)器，HP1100色譜工作站。電子分析天平（Sartorius BS124S），移液槍（Gilson），高速離心機(jī) （塞維斯科技有限公司）。HSE－12A 固相萃取儀，Agela Cleanert ODS－Cl8SPE柱 （100mg，1mL）（北京成萌偉業(yè)科技有限公司）。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SD大鼠，SPF級(jí)，雌雄各半，體重200±20g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供。

1.2 方法

1.2.1 葛根總黃酮的提取方法 將5kg葛根藥材粉碎，70%乙醇（5倍量）回流提取2h，重復(fù)2次，合并提取液，減壓回收至5000mL，用95%的乙醇調(diào)乙醇濃度至70%，抽濾，回收乙醇，減壓干燥得樣品。

1.2.2 臺(tái)氏液的配制 密稱取 NaCl 80g，KCl 0.28g，NaHCO31.0g，NaH2PO40.05g，MgCl20.1g，溶于500mL蒸餾水中，CaCl20.2g溶于500mL蒸餾水中，用前將CaCl2與前者混合，再加入葡萄糖 10g，即得［1］。

1.2.3 色譜方法 色譜柱：Diamonsil XDB－C18色譜柱，（250mm×4.6mm，5μm），預(yù)柱為Diamonsil XDB－C18柱 （12.5 mm×4.6mm，5μm）。梯度洗脫：A （乙腈），B（0.5%乙酸水），0～30min （11：89），30～60min （11：89→50：50），60～75min（50：50→40：60）。柱溫30℃，檢測(cè)波長(zhǎng)250nm，流速1.0mL／min，進(jìn)樣量20μL。

1.2.4 擴(kuò)散池法 大鼠禁食不禁水12h，乙醚麻醉脫頸猝死，打開腹腔，取出小腸，置臺(tái)式液中，剪取3～4cm腸段，固定于擴(kuò)散池上。黏膜側(cè)向上，黏膜側(cè)加入含樣品的臺(tái)式液，漿膜側(cè)加入空白臺(tái)式液。實(shí)驗(yàn)在37℃水浴進(jìn)行，臺(tái)式液通氣體（95%O2、5%CO2）。

1.2.5 擴(kuò)散池給藥方案 取葛根總黃酮提取物三份，溶解于1ml的臺(tái)式液中 （以葛根素為準(zhǔn)，分別含有葛根素20、50、100μg／mL）作為供試液。將配好的供試液加到黏膜側(cè)，按照1.2.4方法操作，2h后收集雙側(cè)的培養(yǎng)基，20℃保存。

1.2.6 大鼠體內(nèi)試驗(yàn)給藥方案與血樣采集 大鼠禁食不禁水12h，葛根總黃酮提取液灌胃，按200mg／kg給藥，于0.25、0.5、1、1.5、2、2.5、3、4、6、8、12、24h眼眶后靜脈叢取血0.5mL。4000r／min離心5min分離血漿，20℃保存。

1.2.7 樣品處理 將SPE柱用甲醇和水活化。取待測(cè)樣品0.1mL移入已活化的SPE柱，減壓使其恒速通過(guò)SPE柱。用水2mL清洗，抽干，再用甲醇1.5mL洗脫，收集洗脫液，洗脫液50℃水浴中N2吹干。用0.1mL流動(dòng)相復(fù)溶，微孔濾膜過(guò)濾，進(jìn)樣20μL，HPLC分析。

1.2.8 方法學(xué)考察 分別取葛根素、大豆苷、大豆苷元和染料木素對(duì)照品適量，等比稀釋成一系列不同濃度的供試品溶液。分別取不同濃度的對(duì)照品溶液0.1mL兩份，加入空白臺(tái)式液和大鼠空白血漿各0.1mL，按1.2.6方法處理，測(cè)得峰面積，以峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，對(duì)照品濃度（X）為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸。同法配制低、中、高3個(gè)濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液，按1.2.6方法操作，計(jì)算回收率和日內(nèi)、日間精密度。

1.2.9 數(shù)據(jù)分析 擴(kuò)散池結(jié)果用表觀滲透系數(shù)（Papp）和表觀滲透率（PDR）表示。大鼠體內(nèi)的藥時(shí)數(shù)據(jù)采用3p87軟件進(jìn)行模型擬合，以AIC值和F檢驗(yàn)結(jié)果確定最佳房室模型，并計(jì)算各藥動(dòng)學(xué)參數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 方法學(xué)考察

2.1.1 配制含葛根素濃度為0.03125、0.0625、0.125、0.25、0.5、1μg／mL的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液，按1.2.3色譜條件測(cè)定。結(jié)果表明四個(gè)被測(cè)成分在各自的標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，回歸方程分別為葛根素 Y＝72120X－68.96（r＝0.9999），大豆苷＝57417X－27.407（r＝0.9999），大豆苷元 Y＝51675X－6.1665（r＝0.9998），染料木素 Y＝49673X－8.1469（r＝0.9998）；葛根素、大豆苷、大豆苷元、染料木素的線性范圍分別為1.82～90μg／mL，0.43～20μg／mL，0.01～5μg／mL，0.01～5μg／mL。葛根素、大豆苷、大豆苷元、染料木素的平均回收率在96.57%－104.87%之間，精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果RSD在0.68%－1.27%之間，標(biāo)準(zhǔn)品在冷凍解凍以及室溫8h內(nèi)穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果RSD＜2%。在葛根素、大豆苷、大豆苷元和染料木素保留時(shí)間附近無(wú)基質(zhì)干擾。本實(shí)驗(yàn)方法準(zhǔn)確，可行

2.2 藥物的吸收研究

2.2.1 腸吸收實(shí)驗(yàn) 擴(kuò)散池實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1。葛根素為濃度依賴性吸收，無(wú)明顯外排；大豆苷吸收和外排差；大豆苷元、染料木素吸收與給藥濃度成正比，且染料木素外排作用強(qiáng)于大豆苷元。

表1 不同質(zhì)量濃度的葛根素、大豆苷、大豆苷元及染料木素的腸吸收量（n＝3）

圖1 口服葛根黃酮類藥物后葛根素、大豆苷、大豆苷元及染料木素的平均血藥濃度－時(shí)間曲線。

表2 口服葛根黃酮類藥物后葛根素、大豆苷、大豆苷元及染料木素的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)值（n＝6，）

表2 口服葛根黃酮類藥物后葛根素、大豆苷、大豆苷元及染料木素的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)值（n＝6，）

項(xiàng)目 葛根素 大豆苷 大豆苷元 染料木素α 0.71±0.050.33±0.070.39±0.110.78±0.12 β 0.05±0.010.13±0.020.03±0.010.04±0.01 Ka 1.96±0.451.93±0.251.02±0.321.90±0.32 t1／2α 0.98±0.122.08±0.341.78±0.540.88±0.21 t1／2β 12.33±0.236.12±0.6520.99±3.2115.92±2.13 AUC 194.07±4.3254.84±1.23627.32±9.31363.1±3.32 K210.12±0.020.13±0.040.09±0.020.10±0.04 K100.32±0.120.28±0.090.14±0.070.34±0.05 K120.31±0.080.03±0.010.19±0.060.39±0.23 Vc 2.69±0.430.31±0.051.36±0.342.61±0.98 Cl 0.26±0.090.91±0.140.08±0.010.14±0.02

2.2.2 大鼠吸收的藥代動(dòng)力學(xué)研究 大鼠灌胃給藥后測(cè)得葛根素、大豆苷、大豆苷元、染料木素的藥時(shí)曲線見(jiàn)圖1。用3p87軟件進(jìn)行藥代動(dòng)力學(xué)模型擬合，除大豆苷外，葛根素、大豆苷元和染料木素在大鼠體內(nèi)的動(dòng)力學(xué)行為均符合二房室開放模型。葛根素吸收速度最快，大豆苷消除最快，大豆苷元給藥24h后仍可檢測(cè)到。主要藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)見(jiàn)表2。

3 討 論

3.1 由表1可知小腸對(duì)葛根異黃酮有外排作用，結(jié)果與文獻(xiàn)［2］報(bào)道一致。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)檢測(cè)4種異黃酮的透過(guò)率，以考察不同濃度葛根異黃酮提取物在小腸壁的吸收情況，結(jié)果顯示與王睿銳等的研究結(jié)果相符［3］。大豆苷的吸收與濃度無(wú)關(guān)的原因可能是小腸的首過(guò)效應(yīng)所致［4］，大豆苷屬于氧苷異黃酮，而小腸壁上存在大量Ⅰ相和Ⅱ相代謝酶，所以大豆苷在吸收過(guò)程中極易被代謝為大豆苷元，導(dǎo)致大豆苷元高劑量組的吸收率比低劑量組高。

3.2 染料木素在體內(nèi)的行為與葛根素相似，本實(shí)驗(yàn)說(shuō)明染料木素不但可以促進(jìn)葛根素的吸收，同樣也可以因整體給藥提高自身的吸收。大豆苷和大豆苷元的吸收速率較葛根素和染料木素慢，說(shuō)明大豆苷和大豆苷元在小腸的透過(guò)率較低，也可能有載體蛋白的抑制作用以及小腸對(duì)大豆苷的首過(guò)效應(yīng)。但是大豆苷元的消除半衰期大于大豆苷，而且大豆苷的Cl最大，說(shuō)明大豆苷元比大豆苷在體內(nèi)的保留時(shí)間長(zhǎng)，生物利用度大，在圖1中也可以看出大豆苷元的達(dá)峰時(shí)間在大豆苷的后面，而且葛根總黃酮中大豆苷元的含量沒(méi)有圖1中大豆苷元的達(dá)峰濃度那么高，大豆苷元更多的是由大豆苷消除后代謝生成的。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)葛根總黃酮給藥，目的是尋找能夠提高葛根異黃酮生物利用度的方法，與仇峰［5］研究了大豆苷元及其前體藥物在體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)的結(jié)果相得益彰，而對(duì)于本實(shí)驗(yàn)，大豆苷即是大豆苷元的前藥。大豆苷元有心腦血管系統(tǒng)作用、雌激素樣作用和杭癌及誘導(dǎo)癌細(xì)胞的分化等作用，大豆苷元生物利用度的提高有利于其藥效作用的發(fā)揮。

3.3 本實(shí)驗(yàn)就葛根總黃酮的透過(guò)率和口服后的體內(nèi)吸收情況進(jìn)行了研究，研究結(jié)果與以往報(bào)道的結(jié)果進(jìn)行了比較，初步推斷整體給藥的效果比單體給藥的效果好，但是本實(shí)驗(yàn)僅僅監(jiān)測(cè)了葛根總黃酮中的4個(gè)成分，不能完全代表葛根中的藥效成分，所以需要進(jìn)一步研究。

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