范 昕 北京市房山區(qū)良鄉(xiāng)醫(yī)院 (北京 102401)
葛根為豆科植物野葛Pueraria lobata(Willd.)ohwi的干燥根,主要功效成分為異黃酮,具有擴(kuò)張血管、改善心肌的氧代謝、改善微循環(huán)、降低血管阻力等作用,廣泛應(yīng)用于心腦血管的防治。目前,關(guān)于葛根的研究主要是局限在葛根中幾個(gè)異黃酮的藥動(dòng)學(xué),而對(duì)葛根總黃酮提取物的藥動(dòng)學(xué)研究較少。本實(shí)驗(yàn)結(jié)合離體和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)預(yù)測(cè)藥物的吸收情況。
1.1 材料
1.1.1 藥品與儀器 葛根素、大豆苷、大豆苷元和染料木素為本實(shí)驗(yàn)室自制,經(jīng)HPLC法測(cè)定含量均在98%以上。葛根(產(chǎn)地:四川;批號(hào)100623),經(jīng)本院周偉副教授鑒定為正品。葛根總黃酮提取物 (本院化學(xué)室,含葛根素44.57%,大豆苷12.53%,大豆苷元3.87%,染料木素2.74%)。Agilent1100高效液相色譜儀,DAD二極管陣列檢測(cè)器,HP1100色譜工作站。電子分析天平(Sartorius BS124S),移液槍(Gilson),高速離心機(jī) (塞維斯科技有限公司)。HSE-12A 固相萃取儀,Agela Cleanert ODS-Cl8SPE柱 (100mg,1mL)(北京成萌偉業(yè)科技有限公司)。
1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SD大鼠,SPF級(jí),雌雄各半,體重200±20g,由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供。
1.2 方法
1.2.1 葛根總黃酮的提取方法 將5kg葛根藥材粉碎,70%乙醇(5倍量)回流提取2h,重復(fù)2次,合并提取液,減壓回收至5000mL,用95%的乙醇調(diào)乙醇濃度至70%,抽濾,回收乙醇,減壓干燥得樣品。
1.2.2 臺(tái)氏液的配制 密稱取 NaCl 80g,KCl 0.28g,NaHCO31.0g,NaH2PO40.05g,MgCl20.1g,溶于500mL蒸餾水中,CaCl20.2g溶于500mL蒸餾水中,用前將CaCl2與前者混合,再加入葡萄糖 10g,即得[1]。
1.2.3 色譜方法 色譜柱:Diamonsil XDB-C18色譜柱,(250mm×4.6mm,5μm),預(yù)柱為Diamonsil XDB-C18柱 (12.5 mm×4.6mm,5μm)。梯度洗脫:A (乙腈),B(0.5%乙酸水),0~30min (11:89),30~60min (11:89→50:50),60~75min(50:50→40:60)。柱溫30℃,檢測(cè)波長(zhǎng)250nm,流速1.0mL/min,進(jìn)樣量20μL。
1.2.4 擴(kuò)散池法 大鼠禁食不禁水12h,乙醚麻醉脫頸猝死,打開腹腔,取出小腸,置臺(tái)式液中,剪取3~4cm腸段,固定于擴(kuò)散池上。黏膜側(cè)向上,黏膜側(cè)加入含樣品的臺(tái)式液,漿膜側(cè)加入空白臺(tái)式液。實(shí)驗(yàn)在37℃水浴進(jìn)行,臺(tái)式液通氣體(95%O2、5%CO2)。
1.2.5 擴(kuò)散池給藥方案 取葛根總黃酮提取物三份,溶解于1ml的臺(tái)式液中 (以葛根素為準(zhǔn),分別含有葛根素20、50、100μg/mL)作為供試液。將配好的供試液加到黏膜側(cè),按照1.2.4方法操作,2h后收集雙側(cè)的培養(yǎng)基,20℃保存。
1.2.6 大鼠體內(nèi)試驗(yàn)給藥方案與血樣采集 大鼠禁食不禁水12h,葛根總黃酮提取液灌胃,按200mg/kg給藥,于0.25、0.5、1、1.5、2、2.5、3、4、6、8、12、24h眼眶后靜脈叢取血0.5mL。4000r/min離心5min分離血漿,20℃保存。
1.2.7 樣品處理 將SPE柱用甲醇和水活化。取待測(cè)樣品0.1mL移入已活化的SPE柱,減壓使其恒速通過(guò)SPE柱。用水2mL清洗,抽干,再用甲醇1.5mL洗脫,收集洗脫液,洗脫液50℃水浴中N2吹干。用0.1mL流動(dòng)相復(fù)溶,微孔濾膜過(guò)濾,進(jìn)樣20μL,HPLC分析。
1.2.8 方法學(xué)考察 分別取葛根素、大豆苷、大豆苷元和染料木素對(duì)照品適量,等比稀釋成一系列不同濃度的供試品溶液。分別取不同濃度的對(duì)照品溶液0.1mL兩份,加入空白臺(tái)式液和大鼠空白血漿各0.1mL,按1.2.6方法處理,測(cè)得峰面積,以峰面積(Y)為縱坐標(biāo),對(duì)照品濃度(X)為橫坐標(biāo),進(jìn)行線性回歸。同法配制低、中、高3個(gè)濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液,按1.2.6方法操作,計(jì)算回收率和日內(nèi)、日間精密度。
1.2.9 數(shù)據(jù)分析 擴(kuò)散池結(jié)果用表觀滲透系數(shù)(Papp)和表觀滲透率(PDR)表示。大鼠體內(nèi)的藥時(shí)數(shù)據(jù)采用3p87軟件進(jìn)行模型擬合,以AIC值和F檢驗(yàn)結(jié)果確定最佳房室模型,并計(jì)算各藥動(dòng)學(xué)參數(shù)。
2.1 方法學(xué)考察
2.1.1 配制含葛根素濃度為0.03125、0.0625、0.125、0.25、0.5、1μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液,按1.2.3色譜條件測(cè)定。結(jié)果表明四個(gè)被測(cè)成分在各自的標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,回歸方程分別為葛根素 Y=72120X-68.96(r=0.9999),大豆苷=57417X-27.407(r=0.9999),大豆苷元 Y=51675X-6.1665(r=0.9998),染料木素 Y=49673X-8.1469(r=0.9998);葛根素、大豆苷、大豆苷元、染料木素的線性范圍分別為1.82~90μg/mL,0.43~20μg/mL,0.01~5μg/mL,0.01~5μg/mL。葛根素、大豆苷、大豆苷元、染料木素的平均回收率在96.57%-104.87%之間,精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果RSD在0.68%-1.27%之間,標(biāo)準(zhǔn)品在冷凍解凍以及室溫8h內(nèi)穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果RSD<2%。在葛根素、大豆苷、大豆苷元和染料木素保留時(shí)間附近無(wú)基質(zhì)干擾。本實(shí)驗(yàn)方法準(zhǔn)確,可行
2.2 藥物的吸收研究
2.2.1 腸吸收實(shí)驗(yàn) 擴(kuò)散池實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1。葛根素為濃度依賴性吸收,無(wú)明顯外排;大豆苷吸收和外排差;大豆苷元、染料木素吸收與給藥濃度成正比,且染料木素外排作用強(qiáng)于大豆苷元。
表1 不同質(zhì)量濃度的葛根素、大豆苷、大豆苷元及染料木素的腸吸收量(n=3)
圖1 口服葛根黃酮類藥物后葛根素、大豆苷、大豆苷元及染料木素的平均血藥濃度-時(shí)間曲線。
表2 口服葛根黃酮類藥物后葛根素、大豆苷、大豆苷元及染料木素的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)值(n=6,)
表2 口服葛根黃酮類藥物后葛根素、大豆苷、大豆苷元及染料木素的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)值(n=6,)
項(xiàng)目 葛根素 大豆苷 大豆苷元 染料木素α 0.71±0.050.33±0.070.39±0.110.78±0.12 β 0.05±0.010.13±0.020.03±0.010.04±0.01 Ka 1.96±0.451.93±0.251.02±0.321.90±0.32 t1/2α 0.98±0.122.08±0.341.78±0.540.88±0.21 t1/2β 12.33±0.236.12±0.6520.99±3.2115.92±2.13 AUC 194.07±4.3254.84±1.23627.32±9.31363.1±3.32 K210.12±0.020.13±0.040.09±0.020.10±0.04 K100.32±0.120.28±0.090.14±0.070.34±0.05 K120.31±0.080.03±0.010.19±0.060.39±0.23 Vc 2.69±0.430.31±0.051.36±0.342.61±0.98 Cl 0.26±0.090.91±0.140.08±0.010.14±0.02
2.2.2 大鼠吸收的藥代動(dòng)力學(xué)研究 大鼠灌胃給藥后測(cè)得葛根素、大豆苷、大豆苷元、染料木素的藥時(shí)曲線見(jiàn)圖1。用3p87軟件進(jìn)行藥代動(dòng)力學(xué)模型擬合,除大豆苷外,葛根素、大豆苷元和染料木素在大鼠體內(nèi)的動(dòng)力學(xué)行為均符合二房室開放模型。葛根素吸收速度最快,大豆苷消除最快,大豆苷元給藥24h后仍可檢測(cè)到。主要藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)見(jiàn)表2。
3.1 由表1可知小腸對(duì)葛根異黃酮有外排作用,結(jié)果與文獻(xiàn)[2]報(bào)道一致。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)檢測(cè)4種異黃酮的透過(guò)率,以考察不同濃度葛根異黃酮提取物在小腸壁的吸收情況,結(jié)果顯示與王睿銳等的研究結(jié)果相符[3]。大豆苷的吸收與濃度無(wú)關(guān)的原因可能是小腸的首過(guò)效應(yīng)所致[4],大豆苷屬于氧苷異黃酮,而小腸壁上存在大量Ⅰ相和Ⅱ相代謝酶,所以大豆苷在吸收過(guò)程中極易被代謝為大豆苷元,導(dǎo)致大豆苷元高劑量組的吸收率比低劑量組高。
3.2 染料木素在體內(nèi)的行為與葛根素相似,本實(shí)驗(yàn)說(shuō)明染料木素不但可以促進(jìn)葛根素的吸收,同樣也可以因整體給藥提高自身的吸收。大豆苷和大豆苷元的吸收速率較葛根素和染料木素慢,說(shuō)明大豆苷和大豆苷元在小腸的透過(guò)率較低,也可能有載體蛋白的抑制作用以及小腸對(duì)大豆苷的首過(guò)效應(yīng)。但是大豆苷元的消除半衰期大于大豆苷,而且大豆苷的Cl最大,說(shuō)明大豆苷元比大豆苷在體內(nèi)的保留時(shí)間長(zhǎng),生物利用度大,在圖1中也可以看出大豆苷元的達(dá)峰時(shí)間在大豆苷的后面,而且葛根總黃酮中大豆苷元的含量沒(méi)有圖1中大豆苷元的達(dá)峰濃度那么高,大豆苷元更多的是由大豆苷消除后代謝生成的。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)葛根總黃酮給藥,目的是尋找能夠提高葛根異黃酮生物利用度的方法,與仇峰[5]研究了大豆苷元及其前體藥物在體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)的結(jié)果相得益彰,而對(duì)于本實(shí)驗(yàn),大豆苷即是大豆苷元的前藥。大豆苷元有心腦血管系統(tǒng)作用、雌激素樣作用和杭癌及誘導(dǎo)癌細(xì)胞的分化等作用,大豆苷元生物利用度的提高有利于其藥效作用的發(fā)揮。
3.3 本實(shí)驗(yàn)就葛根總黃酮的透過(guò)率和口服后的體內(nèi)吸收情況進(jìn)行了研究,研究結(jié)果與以往報(bào)道的結(jié)果進(jìn)行了比較,初步推斷整體給藥的效果比單體給藥的效果好,但是本實(shí)驗(yàn)僅僅監(jiān)測(cè)了葛根總黃酮中的4個(gè)成分,不能完全代表葛根中的藥效成分,所以需要進(jìn)一步研究。
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