盧 露 顧建成 張曉紅 趙 濤 陜西步長制藥有限公司（西安 710075）

步長參仙升脈口服液是臨床上治療緩慢性心律失常的常用中成藥，主要成分由人參、淫羊藿、枸杞子、補骨脂、麻黃、細辛、丹參、水蛭等。藥理實驗表明其具有顯著提高心率、改善心功能；活血化瘀，改善血流動力學(xué)［1-2］；扶正固本、提高免疫力［3］等作用。同時臨床試驗表明其安全有效，無任何毒副作用，適合長期服用。但我們在臨床實踐中，還發(fā)現(xiàn)參仙升脈口服液對多種類型的心律失常均有良好的調(diào)節(jié)作用，除了對緩慢性心律失常有確切治療作用外，對快速性心律失常也有很好的減緩調(diào)節(jié)效果。大量研究表明左室肥厚（LVH）是心臟性猝死的獨立危險因素［4-7］，多類型心律失常發(fā)作的病理基礎(chǔ)，改善和逆轉(zhuǎn)心肌肥厚在很大程度上有助于心律失常的治療。參仙升脈口服液改善左室肥厚具體機制研究的報導(dǎo)目前還甚少，高血壓左室肥厚的形成與細胞內(nèi)鈣離子濃度的改變有密切關(guān)系［7］，而SERCA在[Ca2＋]i的穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)起著關(guān)鍵性的作用。本研究觀察步長參仙升脈口服液對自發(fā)性高血壓大鼠左室重構(gòu)的改善作用及其對心肌Ca2＋－ATPase表達的影響，探討參仙升脈口服液改善左室肥厚可能的分子機制。

1 材料與方法

1.1 分組與給藥 雄性12周齡SHR大鼠24只，體重250－300g，隨機抽取分為四組①血壓對照組（SHR）：6只，蒸餾水灌胃；②氯沙坦（由默沙東公司提供）治療組（Los）：6只，10mg.kg－1.d－1；③參仙升脈大劑量治療組（SXSMh）6只，15mg.kg－1.d－1；④參仙升脈小劑量治療組（SXSMl）6只，5mg.kg－1.d－1加少量蒸餾水灌胃；⑤正常血壓對照組（WKY）：相同年齡、體重WKY大鼠8只，蒸餾水灌胃。飼養(yǎng)條件：3～4只一籠，恒溫22±2℃，恒濕55±5%，人工照明暗各12h／天，24h自由取食和飲水，飼料由上海必凱公司提供。參仙升脈口服液由山東步長制藥有限公司提供。

1.2 動物實驗及取材 喂藥12周后，處死大鼠，迅速開胸游離心臟，沿房室環(huán)剪去心房及右室游離壁，濾紙吸干后用電子天平稱取左心室（包括室間隔）質(zhì)量，并與體質(zhì)量相除計算左心室質(zhì)量／體質(zhì)量比值（LVM／BW ，mg／g），以反映左心室肥厚程度。切取左心室冠狀面中部約4mm組織，置于10%中性甲醛液中固定，石蠟包埋切片常規(guī)VG染色。經(jīng)VG染色后，膠原纖維呈鮮紅色，肌纖維、胞質(zhì)及紅細胞呈黃色，在VG染色下計算心肌膠原容積分數(shù)（CVF）其余左心室組織放于液氮冷凍，－70 ℃保存 。

1.3 RT－PCR法 采用Trizol（購自Invitrogen公司）一步法提取心肌總RnA，紫外光檢測樣品吸光度；應(yīng)用RT－PCR法（RT－PCR 試劑購自 TaKaRa公司）檢測 Ca2＋－ATPase的mRnA 表 達，引 物 序 列 如 下：Ca2＋－ATPase上 游：5’－ATGACGGGCTTGTAGAGTTAG－3’下 游：5’－GCTCGGTTTGTTTGGTGTA－3’，退火溫度55℃，擴增長度293bp GADPH 上 游：5’－ACCACAGTCCATGCCATCACT－3’下 游：5’－TCCACCACCCTGTTGCTGTA－3’，退火溫度55℃，擴增長度423bp。反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性5min，然后進入PCR循環(huán)，94℃變性30s，各自退火溫度退火30s，72℃延伸30s，循環(huán)30次后，最后延伸7min結(jié)束。取PCR產(chǎn)物5μL與5μL GADPH一起上樣，經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳，應(yīng)用Gel 2000凝膠成像系統(tǒng)對電泳條帶進行掃描，以GADPH為內(nèi)參照進行光密度分析。目標(biāo)基因PCR產(chǎn)物的相對量＝目標(biāo)基因電泳條帶灰度積分／GADPH電泳條帶灰度積分。

1.4 免疫組化實驗 石蠟切片（4μm）經(jīng)常規(guī)脫蠟、脫水后以枸櫞酸鹽緩沖液為抗原修復(fù)液高壓修復(fù)，滴加1∶400兔抗鼠一抗（購自Alomone Labs Ltd），4℃孵育過夜。滴加辣根酶標(biāo)記山羊抗兔IgG（購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司），DAB（購自北京中山生物技術(shù)有限公司）顯色，蘇木素復(fù)染，酒精脫水、二甲苯透明后用中性樹膠封片，置鏡下觀察和拍攝。

2 結(jié) 果

2.1 左心室質(zhì)量／體質(zhì)量（LVW／BW）比值（mg／g）和心肌膠原容積分數(shù)（CVF） 高血壓組LVW／BW明顯高于正常對照組（P ＜0.001），不同劑量參仙升脈口服液和氯沙坦治療組LVW／BW較高血壓組明顯降低（P 均＜0.05），治療組間無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）（表1）。高血壓組CVF明顯高于正常對照組（P ＜0.001），大小劑量參仙升脈口服液以及氯沙坦治療組CVF較高血壓組明顯降低（P均＜0.05），治療組間無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）（圖1、表1）。正常對照組，SHR為高血壓組，SXSMl為參仙升脈口服液小劑量治療組，SXSMh為參仙升脈口服液大劑量治療組，Los為氯沙坦治療組。與正常組相比，高血壓組心肌Ca2＋－ATPase轉(zhuǎn)錄明顯降低。而參仙升脈口服液、氯沙坦治療組Ca2＋－ATPase轉(zhuǎn)錄較高血壓組明顯增強。

圖1 參仙升脈口服液及氯沙坦治療后心肌膠原的改變。高血壓組大鼠心肌膠原纖維增生，VG染色顏色明顯加深。參仙升脈口服液及氯沙坦治療組，膠原纖維增生減少，VG染色顏色變淺 。（10x，VG染色）

圖2 各組大鼠心肌Ca2＋－ATPase蛋白免疫組化產(chǎn)物染色深度的分析比較，與正常組相比，高血壓組心肌Ca2＋－ATPase蛋白免疫組化產(chǎn)物胞漿褐色深度明顯降低，而參仙升脈口服液、氯沙坦治療組Ca2＋－ATPase蛋白免疫組化產(chǎn)物胞漿褐色深度較高血壓增強。

圖3 參仙升脈口服液及氯沙坦治療后心肌細胞Ca2＋－ATPase基因產(chǎn)物mRnA影響。M為100bp Marker，WKY為

2.2 各組大鼠心肌Ca2＋－ATPase蛋白免疫組化產(chǎn)物染色深度的分析比較 與正常組相比，高血壓組心肌Ca2＋－ATPase蛋白免疫組化產(chǎn)物胞漿褐色深度明顯減弱（P＜0.001）。而參仙升脈口服液、氯沙坦治療組Ca2＋－ATPase蛋白免疫組化產(chǎn)物胞漿褐色深度較高血壓組明顯增強（P值均＜0.001），治療組間無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）（圖2、表2）。

2.3 對心肌組織肌漿網(wǎng)Ca2＋－ATPasemRnA含量的影響與正常組相比，高血壓組心肌Ca2＋－ATPasemRnA轉(zhuǎn)錄明顯降低（P＜0.001）。而參仙升脈口服液、氯沙坦治療組Ca2＋－ATPasemRnA轉(zhuǎn)錄較高血壓組明顯增強（P均＜0.05），治療組間無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）（圖3、表2）。

表1 參仙升脈口服液和氯沙坦治療對大鼠心／體比和心肌膠原容積分數(shù)的影響

表2 參仙升脈口服液和氯沙坦治療對大鼠心肌SERCA－2amRnA和蛋白的影響

3 討 論

本研究結(jié)果表明，治療12周后，高血壓組LVW／BW、CVF明顯高于正常對照組，而參仙升脈口服液、氯沙坦治療組LVW／BW、CVF較高血壓組明顯降低，這說明，參仙升脈口服液與氯沙坦一樣，能有效降低自發(fā)性高血壓大鼠的心臟重構(gòu)，減輕左心室肥厚。根據(jù)中醫(yī)方解理論的闡述，參仙升脈口服液的全方能溫補心腎，活血化瘀，其中人參、淫羊藿，益氣助陽、溫補心腎為君藥；補骨脂、枸杞子與君藥配伍，溫陽益氣為臣藥；麻黃、細辛助君臣藥，溫陽散寒止痛為佐藥；丹參、水蛭逐瘀通脈為使藥。其現(xiàn)代作用機制可能與降低冠脈血管阻力，增加冠脈流量，提高心率［1］；降低全血黏度、抑制血小板聚集，對瘀血證有不同程度的改善［8］，提高機體免疫力等作用有關(guān)。中西醫(yī)作用機理相輔相成，基本一致，為本實驗打下了堅實的研究基礎(chǔ)。本實驗結(jié)果說明參仙升脈口服液具有改善心肌細胞Ca2＋－ATPase轉(zhuǎn)錄和蛋白水平的作用，可能通過抑制細胞膜 Ca2＋內(nèi)流，同時增強 Ca2＋－ATPase表達，由 Ca2＋－ATPase泵將升高的細胞內(nèi)Ca2＋泵入肌質(zhì)網(wǎng)，共同作用下達到改善鈣超載狀態(tài)，恢復(fù)鈣穩(wěn)態(tài)，阻斷高血壓心臟重構(gòu)的信號傳導(dǎo)，逆轉(zhuǎn)心肌肥厚。這可能是參仙升脈口服液治療高血壓左心室附肥厚及心律失常的重要機制。

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