張曉，張銳，孫國清，史計，孟志剛，周燾，侯思宇，梁成真，于源華，郭三堆

1 中國農(nóng)業(yè)科學院生物技術研究所 國家農(nóng)作物基因資源與遺傳改良重大科學工程，北京 100081

2 長春理工大學生命科學技術學院，吉林 長春 130022

在分子生物學中，為更好地研究某個基因的結構和功能，往往需要克隆其側翼序列。目前，已有多種技術用于擴增基因的側翼序列[1-10]。但雙拷貝基因側翼序列的克隆仍是一個難點，因為難以確定所克隆到的序列是屬于2個拷貝中的哪一個。以往要克隆雙拷貝基因的側翼序列，往往需要建立基因文庫，然后篩選陽性克隆子進行測序，但這種方法費時費力。

棉花 Gossypium hirsutum L. 線粒體基因組中 atpA基因以雙拷貝形式存在，該基因編碼線粒體ATP酶復合體F1因子中的α亞基。研究發(fā)現(xiàn)，atpA基因在棉花細胞質(zhì)雄性不育 (CMS) 系和保持系之間，以及棉花A、D基因組二倍體之間都存在明顯的限制性片段長度多態(tài)性(RFLPs)[11-15]，這說明該基因是棉花線粒體基因組中的一個重組活躍位點，并很可能與棉花細胞質(zhì)雄性不育相關。鞏養(yǎng)倉[11]利用外源接頭介導PCR法克隆到哈克尼西棉 CMS系及其保持系atpA基因的部分側翼序列，但未能將棉花 atpA基因的2個拷貝區(qū)分開并加以詳細解析。

為了克隆棉花雙拷貝 atpA基因側翼序列，我們將iPCR方法進行優(yōu)化，并與TAIL-PCR相結合，摸索出一套高效簡便的克隆雙拷貝基因側翼序列的方法。利用該方法，我們將 atpA兩個拷貝進行了明確區(qū)分，并且獲得的單條完整片段長達12 kb。結合實驗結果，對該方法在擴增雙拷貝甚至多拷貝基因側翼序列中的應用進行了討論。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料

陸地棉CMS不育系P30A (不育胞質(zhì))、保持系P30B (可育胞質(zhì))、三系雜交種“銀棉2號” (不育胞質(zhì))。P30A和P30B是同核異質(zhì)系；P30A與“銀棉2號”具有相同胞質(zhì)。

1.1.2 菌株與質(zhì)粒

大腸桿菌Escherichia coli TOP10感受態(tài)細胞購自北京博邁德生物技術公司；pGEMT-easy載體購自Promega公司。

1.1.3 試劑

Southern blotting檢測試劑盒 (DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit Ⅱ)購自 Roche公司；尼龍膜 Hybond-N+購自Amersham公司；凝膠回收試劑盒購自 Axygene公司；限制性內(nèi)切酶EcoR Ⅰ、Hind Ⅲ、T4 DNA連接酶、Taq DNA聚合酶購自北京天根生物公司；LA-Taq酶購自 TaKaRa公司；DNA ladder 0331購自Fermentas公司；其他化學試劑購自北京拜爾迪生物技術公司，均為分析純。引物合成及DNA測序由上海生工生物工程技術服務公司完成。iPCR和TAIL-PCR所用引物如表1所示。

1.2 方法

1.2.1 棉花總DNA提取

使用改良CTAB法[16]提取棉花CMS系、保持系、雜交種葉片總DNA。

1.2.2 棉花材料的Southern blotting分析

Southern blotting分析參考王教瑜等[17]的方法。

1.2.3 反向PCR (iPCR) 擴增atpA基因EcoRⅠ限制片段

參考Kim等[18]的方法并加以修改：取10 μg棉花總 DNA，在 200 μL酶切體系 (含 50 U EcoRⅠ酶) 中，37 ℃酶切6 h；用等體積苯酚：氯仿進行抽提，然后用無水乙醇沉淀。將 DNA用3 U的T4 DNA連接酶在300 μL體系中16 ℃連接24 h。然后，自連產(chǎn)物用等體積苯酚：氯仿進行抽提，然后用無水乙醇沉淀，20 μL雙蒸水重溶。從中取500 ng DNA作為模板，用LA-Taq酶在50 μL體系中進行PCR反應。反應程序為：94 ℃預變性5 min；94 ℃，1 min；60 ℃，1 min；72 ℃，2 min，共35個循環(huán)；然后72 ℃延伸10 min。后續(xù)實驗步驟參照分子克隆實驗手冊[19]。擴增產(chǎn)物用 0.9%瓊脂糖凝膠進行電泳，回收純化目的片段，連接到pGEMT-easy載體，然后轉(zhuǎn)化E. coli TOP10感受態(tài)細胞，將陽性質(zhì)粒送上海生工生物工程技術服務公司測序。

1.2.4 TAIL-PCR擴增atpA基因Hind Ⅲ限制片段

具體方法參見文獻[20]。簡并引物選用AD10 (表1)；采用50 μL PCR體系；從第一步 (Primary)和第二步 (Secondary) 反應液中取 0.5 μL作為各自下一步的模板。具體反應步驟如表2所示。

2 結果與分析

2.1 atpA基因在陸地棉CMS不育胞質(zhì)和可育胞質(zhì)間存在明顯的RFLPs

以atpA核心編碼區(qū) (引物為P1和P2，圖3所示) 為探針，對陸地棉細胞質(zhì)雄性不育系P30A、保持系P30B、三系雜交種“銀棉2號”進行Southern blotting分析。結果表明，可育胞質(zhì) (保持系) 和不育胞質(zhì) (不育系和雜交種) 間存在明顯的RFLP多態(tài)性：用EcoRⅠ酶切時，可育胞質(zhì)出現(xiàn)2.2 kb和5.1 kb兩條雜交帶，而不育胞質(zhì)的雜交帶是2.2 kb和3.3 kb；用Hind Ⅲ酶切時，可育胞質(zhì)出現(xiàn)8.5 kb和11.6 kb兩條雜交帶，而不育胞質(zhì)的雜交帶是9.1 kb和11.6 kb。這表明，陸地棉可育胞質(zhì)和不育胞質(zhì)在 atpA位點存在明顯差異。所以，如果能克隆到 atpA基因所在的EcoRⅠ和Hind Ⅲ限制片段，對研究棉花胞質(zhì)雄性不育機理將很有意義。

表1 本實驗所用的引物序列Table 1 Primers used in this study

表2 TAIL-PCR反應條件Table 2 Cycling conditions of TAIL-PCR

圖1 atpA基因為探針的Southern blotting雜交結果Fig. 1 Southern blotting analysis of total DNA from CMS line P30A (1), maintainer line P30B (2) and hybrid cultivar “Yinmian 2” (3) hybridized with atpA probe. Polymorphic bands between the fertile cytoplasm (2) and sterile cytoplasm (1, 3) are indicated by arrows.

2.2 iPCR法擴增atpA基因EcoRⅠ限制片段

根據(jù)atpA基因編碼序列設計iPCR所需的兩對反向引物：P4和P5，P3和P6。P4和P5分別對應atpA編碼區(qū)的258~285 bp和1 098~1 125 bp，二者相距812 bp；P3和P6分別對應atpA編碼區(qū)的140~167 bp和1 183~1 210 bp，相距1 015 bp (表1和圖3)。首先按照常規(guī)的iPCR方法：先用P4和P5為引物，以100 ng自連產(chǎn)物為模板進行一次iPCR (1st iPCR)，然后用P3和P6為引物，以“1st iPCR”產(chǎn)物為模板進行巢式PCR (“2nd iPCR”)。結果發(fā)現(xiàn)，在P30A中“1st iPCR”可以擴增出相應條帶，但亮度很弱；“2nd iPCR”時目的條帶未獲得富集反而亮度更淡。在 P30B中，“1st iPCR”可以將2.2 kb Southern blotting雜交片段所對應的條帶擴增出來，但無法擴增出5.1 kb雜交片段所對應的條帶；“2nd iPCR”時目的條帶未獲得富集反而亮度更淡 (圖 2B)。然后，我們參照Kim等的方法[18]，將自連條件改為37 ℃，2 h，PCR模板量增大到500 ng進行iPCR。結果發(fā)現(xiàn)可以將圖2A中雜交片段所對應的條帶都擴增出來，但是亮度偏弱 (圖 2C)，很難進行回收克隆，這說明連接時間太短會明顯降低環(huán)化效果。

所以，我們對iPCR技術在2個方面進行了優(yōu)化，以保證通過一次PCR反應就能獲得足夠的目的產(chǎn)物。一是自連時間延長到 24 h以上(16 ℃)，以獲得足夠的目的環(huán)化 DNA；二是將PCR的起始模板量增大到500 ng，以保證目標產(chǎn)物獲得高效擴增。結果從不育胞質(zhì)線粒體基因組中擴增出1.2 kb和2.3 kb兩條帶，分別對應2.2 kb和3.3 kb EcoRⅠ限制片段；從可育胞質(zhì)線粒體基因組中擴增出1.2 kb和4.1 kb兩條帶，分別對應2.2 kb和5.1 kb EcoRⅠ限制片段 (圖2 D)。

將上述片段分別克隆測序后與 atpA基因核心保守序列進行拼接還原，發(fā)現(xiàn) atpA基因在不育胞質(zhì)和可育胞質(zhì)線粒體基因組中各有兩個不同的拷貝，如圖3所示。

可育胞質(zhì)中2條EcoRⅠ限制片段的長度是2 225 bp和5 083 bp，分別命名為N-1和N-2，二者5′端的EcoRⅠ位點相同，都是位于atpA基因編碼序列的第4 bp處 (ATGG AATTC)。N-1中含有完整atpA基因 (需要加上EcoRⅠ酶切位點上游的4個堿基ATGG)，長度1 524 bp，編碼507 aa。N-2中含有截短型atpA基因，截斷位點位于編碼區(qū)第1 352 bp處。不育胞質(zhì)中相應的兩條EcoRⅠ限制片段分別命名為S-1 (2 194 bp)和S-2 (3 297 bp)。S-1中含有完整atpA基因；S-2中含有3′截短型基因，截斷位點位于編碼區(qū)第1 336 bp處。

iPCR結果中，可育胞質(zhì)除1.2 kb和4.1 kb兩條目的帶之外，還存在一條 2.5 kb和一條0.3 kb的條帶?？寺y序結果表明，二者分別由N-2中3 599 bp處 (GAATT T) 和1 327 bp處(A AATTC) 的 EcoRⅠ星號活性產(chǎn)生。同樣，不育胞質(zhì)0.35 kb條帶是由S-2中1 369 bp處(GAATT T) 的星號活性產(chǎn)生。

為驗證所克隆到的 EcoRⅠ限制片段是否正確，我們根據(jù)片段兩端序列設計引物：P7結合P8擴增N-1和S-1，P7結合P9和P10來分別擴增 N-2和 S-2。結果擴增出與 Southern blotting結果相符的條帶 (圖4)。證明iPCR法成功將棉花線粒體atpA基因2個不同拷貝進行正確區(qū)分。

2.3 TAIL-PCR擴增atpA Hind Ⅲ限制片段

atpA基因EcoR Ⅰ限制片段的大小在2.2~ 5.1 kb之間，Hind Ⅲ限制片段的大小在8.5~11.6 kb之間，這說明前者總體上只是后者的一部分。為進一步解析后者的多態(tài)性，我們在前者的基礎上，采用TAIL-PCR方法，進一步克隆atpA的側翼序列。分析發(fā)現(xiàn)，前者4條片段中只在N-2的第4 143 bp處發(fā)現(xiàn)一個Hind Ⅲ位點。所以，要獲得后者的4條片段，需要以前者片段為核心，分別向上、下游進行基因組步移 (TAIL-PCR)，理論上共需要向7個方向進行，即：N-1、S-1、N-2、S-2片段的5′上游和N-1、S-1、S-2片段的3′下游。進一步分析發(fā)現(xiàn)4條EcoR Ⅰ限制片段的5′末端都是相同的，且先前對atpA基因 5′上游進行TAIL-PCR時發(fā)現(xiàn)，兩種胞質(zhì)TAIL-PCR擴增條帶是相同的，這說明兩種胞質(zhì)atpA基因的 5′上游序列基本一致。所以，“N-1、S-1、N-2、S-2片段的5′上游”這四者的基因組步移工作可以簡化成其中之一。同樣，“N-1、S-1片段的3′下游”這兩者的基因組步移工作也簡化成其中之一。這樣，7個步移任務簡化成 3個：S-1片段的 5′上游和 3′下游、S-2片段的3′下游。

圖2 atpA基因的Southern blotting (EcoR Ⅰ酶切) 及反向PCR結果Fig. 2 Southern blotting and iPCR results of atpA gene. (A) Southern blotting analysis of atpA probe (EcoR I digested). (B, C, D) Results of iPCR with atpA-specific primer pairs. M: DNA marker; S: P30A; N: P30B; asterisks (*) indicate the bands resulted from star activity of EcoR I.

圖3 陸地棉可育胞質(zhì)和不育胞質(zhì)中atpA基因EcoRⅠ限制片段示意圖Fig. 3 Schematic structures of all EcoR Ⅰ restriction fragments of atpA in fertile and sterile cytoplasm. The atpA coding sequences are indicated by gray boxes. The 3′ identical noncoding regions in N-1 and S-1 are represented by open bars. The deletion of the sequences at the SSR loci located downstream of the full-length atpA gene in S-1 is shown in hatched bars. The truncated regions of N-2 and S-2 are indicated by different cross-hatched bars. The 3′identical regions in N-2 and S-2 following the truncated regions are represented by hatched bars. P1 and P2 indicate the primers used for amplifying the core sequence of atpA for Southern blotting. P3-P6 indicate the primers used for inverse PCR. P7-P10 indicate the primer used for amplifying the EcoR Ⅰ restriction fragments ofatpA. Pentagrams indicate the sites that show star activity of EcoRⅠ.

圖4 克隆片段的PCR鑒定Fig. 4 Identification of the cloning fragments by PCR. M: generuler 0331 marker; four primer pairs (P7/P8, P7/P8, P7/P10, and P7/P9) were used to amplify fragments of S-1, N-1, S-2, and N-2, respectively.

2.3.1 atpA基因5′上游區(qū)的基因組步移

我們以P30A總DNA為模板，向atpA 5′上游進行了兩輪 TAIL-PCR (圖 5A)，第Ⅰ輪TAIL-PCR的3步反應中使用的特異引物分別為R1、R2、R3；第Ⅱ輪使用的引物分別為R4、R5、R6 (表1，圖6)。通過兩輪PCR反應，共獲得了4 837 bp的側翼序列，在atpA起始密碼子5′上游4 351 bp處發(fā)現(xiàn)了Hind Ⅲ酶切位點。

為驗證這段4 351 bp序列是否為4個片段(N-1、S-1、N-2、S-2) 所共有，我們在該序列的5′端設計引物P11，在全長atpA編碼區(qū)3′末端設計引物P12，在N-2和S-2 atpA編碼區(qū)截短位點后分別設計引物P13 和P14 (表1，圖6)，分別以P30A或P30B總DNA為模板進行PCR擴增，獲得了與預期相符的條帶 (數(shù)據(jù)未顯示)，測序結果證明該序列是4個片段所共有。

2.3.2 atpA全長拷貝3′下游區(qū)的基因組步移

以P30A總DNA為模板，向S-1 3′下游進行了兩輪TAIL-PCR (圖5 B)，兩輪反應所使用的特異引物分別是F1、F2、F3; F4、F5、F6 (表1，圖6)。結果共獲得5 509 bp側翼序列，其中在S-1下游5 109 bp處發(fā)現(xiàn)了Hind Ⅲ位點。為驗證所獲序列是否正確，我們在全長 atpA編碼區(qū)3′末端設計引物P15，在5 509 bp序列3′端設計引物P16，分別以P30A或P30B總DNA為模板進行 PCR擴增，結果獲得了與預期相符的條帶(數(shù)據(jù)未顯示)，測序結果證明該序列是S-1和N-1所共有。

2.3.3 不育胞質(zhì)截短型 atpA拷貝 (S-2) 3′下游區(qū)的基因組步移

以P30A總DNA為模板，以SF1、SF2、SF3 (表1，圖6) 為特異引物，向S-2下游進行了一輪TAIL-PCR (圖5 C)，獲得了3 369 bp側翼序列，其中在第1 482 bp處，發(fā)現(xiàn)了Hind Ⅲ位點。為驗證正確與否，我們在S-2 atpA編碼區(qū)截短位點及所獲序列 3′末端處分別設計引物 P17和 P18 (表1，圖6)，以P30A總DNA為模板進行PCR擴增，結果獲得了與預期相符的條帶 (圖片未顯示)。

圖5 不育胞質(zhì)atpA基因側翼序列 TAIL-PCR結果Fig. 5 TAIL-PCR results of flanking sequences of atpA in CMS line. (A) TAIL-PCR results of 5′ flanking sequences of atpA in CMS line. (B) TAIL-PCR results of 3′ flanking sequences of intact atpA gene in CMS line. (C) TAIL-PCR results of 3′flanking sequences of truncated atpA gene in CMS line. M: generuler 0331 marker; 1, 2, and 3 indicate the primary, secondary and tertiary reaction of TAIL-PCR (Table 2); I and II indicate the first and second round of TAIL-PCR.

圖6 棉花可育胞質(zhì)和不育胞質(zhì)中atpA基因Hind Ⅲ限制片段示意圖Fig. 6 Schematic structures of all Hind Ⅲ restriction fragments of atpA in fertile and sterile cytoplasm of cotton. The 5′ identical regions in N-1, N-2, S-1 and S-2 are represented by dotted bars. The 3′ identical regions in N-1 and S-1 following the atpA coding regions are represented by open bars. The differential sequences near 3′ Hind Ⅲ sites in N-2 and S-2 are indicated by different hatched bars. F1-F6, R1-R6, SF1-SF3 indicate the primers used for TAIL-PCR. P11-P14 indicate the primers used for amplifying 5′ flanking and coding regions of atpA; P15-P18 indicate the primers used for amplifying 3′ flanking regions of atpA.

通過以上TAIL-PCR反應，獲得了棉花線粒體atpA基因EcoR Ⅰ與Hind Ⅲ酶切位點之間的序列 (圖6)，發(fā)現(xiàn)了兩種胞質(zhì)間新的差異序列，并確定了可育胞質(zhì)和不育胞質(zhì)中兩條Hind Ⅲ限制片段長度分別是11 689 bp和8 501 bp；11 658 bp和9 139 bp。

綜上所述，通過iPCR和TAIL-PCR相結合的方法，我們獲得了陸地棉可育胞質(zhì)和不育胞質(zhì)atpA基因所有的EcoR Ⅰ限制片段和Hind Ⅲ限制片段，將該基因的2個拷貝進行了明確區(qū)分，確定了導致RFLP多態(tài)性的序列，在兩種胞質(zhì)中各獲得了超過20 kb的線粒體DNA序列，這些序列將有助于研究棉花 CMS機理及開發(fā) CMS相關分子標記。

3 討論

通過優(yōu)化的iPCR和TAIL-PCR相結合的方法，我們獲得了陸地棉可育胞質(zhì)和不育胞質(zhì)線粒體雙拷貝 atpA基因每個拷貝各自的側翼序列，證明可育胞質(zhì)和不育胞質(zhì)中各有一個全長拷貝和一個3′截短型拷貝，但3′截斷的位置不同。分析發(fā)現(xiàn)，在atpA編碼區(qū)存在一個BamH Ⅰ位點(圖3)，這解釋了為何在BamH Ⅰ酶切產(chǎn)物中atpA顯示出4條雜交條帶[14]。將我們的結果與鞏養(yǎng)倉的結果[11]進行比較發(fā)現(xiàn)，鞏養(yǎng)倉所獲得的 atpA側翼序列屬于 3′截短型拷貝。iPCR方法具有較高的靈敏性，我們不只擴增出目的條帶，同時也擴增出由 EcoRⅠ酶星號活性所產(chǎn)生的條帶。我們在對atpA基因進行Southern blotting實驗過程中發(fā)現(xiàn)，如果酶切產(chǎn)物上樣量較大，就很容易出現(xiàn)一些弱雜交帶。通過iPCR方法便明確了這些弱雜交帶通常是由內(nèi)切酶的星號活性產(chǎn)生的。所以，iPCR技術還可以用來鑒別某個基因Southern blotting的雜交信號中哪些是真拷貝，哪些是假拷貝。

iPCR在擴增基因側翼序列方面的優(yōu)勢就是它可以通過一個PCR反應同時擴增出5′和3′側翼序列，并且它可以在一個反應中擴增出多拷貝基因的側翼序列并加以區(qū)分，這是其他染色體步移方法很難做到的。傳統(tǒng)的iPCR需要連續(xù)進行二步PCR反應，我們用一步PCR就擴增出信號很強的條帶，關鍵因素之一就是加大iPCR反應的起始模板量，本實驗所用的模板量在500 ng以上。自連效率是iPCR成功的關鍵因素，由于連接體系中要求DNA濃度不能太高，為獲得產(chǎn)量較高的自連產(chǎn)物，需要適當加大自連體系，并延長連接時間。我們利用優(yōu)化的 iPCR方法還成功克隆到棉花線粒體atp9、nad6、nad7基因的側翼序列 (未發(fā)表)，表明該方法重復性較好。利用獲得的差異序列，我們已將棉花可育胞質(zhì)和不育胞質(zhì)之間的RFLP標記轉(zhuǎn)化成SCAR和SSR標記，說明該方法在分子標記開發(fā)中也具有很大的潛力。

從圖2可看出，優(yōu)化后的iPCR法不僅可以擴增出目的條帶，而且可以將星號活性位點產(chǎn)生的片段也擴增出來：在P30A中，共擴增出了3條帶；在P30B中，共擴增出了4條帶。這說明只要酶切產(chǎn)生的線性片段具有互補的粘性末端，并且長度不是過長 (超過5 kb)，就可以自連環(huán)化并進而被有效擴增。所以，優(yōu)化后的iPCR方法不僅可以克隆雙拷貝基因的側翼序列，而且也可以擴增多拷貝基因的側翼序列。

iPCR法對于片段自連效果要求高，如果一個限制片段很長，就很難有效連接并擴增。一般來說，在進行iPCR反應之前，先要進行Southern blotting分析，以確定一種能獲得合適長度雜交片段的限制性內(nèi)切酶。棉花atpA/EcoRⅠ限制片段的大小是2.2~5.1 kb，長度比較合適。但是Hind Ⅲ限制片段長達11.7 kb，需要借助TAIL-PCR方法。TAIL-PCR方法不受限制片段長度的束縛，只要控制好方向，它理論上可以無限地往側翼方向擴增延伸。在進行TAIL-PCR實驗時，我們使用了LA-Taq酶，該酶具有很強的擴增能力，我們進行了多輪TAIL-PCR反應，基本上每輪都能獲得2~3 kb的目的條帶。

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