時迎娣，張迎秋，倪揚笑，史國利，楊懷義

1 中國科學院微生物研究所，北京 100101

2 中國科學院研究生院，北京 100049

3 遼寧師范大學，遼寧 大連 116029

隨著人們飲食結構和生活方式的改變，我國的前列腺癌發(fā)病率和死亡率呈現(xiàn)逐年上升趨勢[1-2]。針對早期前列腺癌細胞具有雄激素依賴性的特征，前期治療前列腺癌最有效的手段，是通過雄激素阻斷療法進行治療，然而在治療期間，前列癌細胞往往會由雄激素依賴性轉變?yōu)樾奂に胤且蕾囆訹3-5]。目前，還沒有有效的手段或藥物治療雄激素非依賴性前列腺癌。因此，雄激素非依賴性前列腺癌的治療成為前列腺癌治療的難點和重點。

PC3M細胞是前列腺癌高轉移細胞系，是一種研究抑制前列腺癌雄激素非依賴性癌細胞生長的常用細胞[6-10]。近年來，人們研究了DIM[6]、金絲桃素[7]、羥基喜樹堿[8]、苦參堿[9]、茶多酚[10]等對該細胞的抑制作用，為雄激素非依賴性前列腺癌的治療提供了新的線索。

11-脫氧輪枝菌素A (又稱11′-脫氧沃替西林A，11'-deoxyverticillin A，C42)，是一種從冬蟲夏草共生菌中分離得到的多硫代二氧基哌嗪(Epipolythiodioxopiperazines，ETPs) 族結構化合物[11]，其對結腸癌細胞有誘導細胞凋亡的作用[12]。為探討其對前列腺癌雄激素非依賴性癌細胞生長的抑制作用，我們研究了其對PC3M細胞凋亡的影響。結果表明，C42具有誘導 caspase依賴性細胞凋亡，抑制PC3M細胞生長的作用。這為進一步研究利用 C42類化合物作為雄激素非依賴性前列腺癌的可能臨床藥物提供了一定的實驗和理論參考。

1 材料與方法

1.1 細胞

雄激素非依賴性前列腺癌高轉移細胞系PC3M細胞為本實驗室保存。

1.2 主要試劑和儀器

MEM、無酚紅DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清購自Gibco公司；預染蛋白Marker購自Fermentas公司；β-Actin抗體購自北京中杉金橋公司，PARP抗體購自Sigma-Aldrich公司；ECL發(fā)光液購自GE公司；Caspase-Glo 3/7試劑盒、MTS試劑盒(CellTiter 96? Aqueous Non-Radioactive Cell Proliferation Assay) 購自Promega公司；Annexin V-FITC試劑盒購自BD公司。11'-Deoxyverticillin A (C42) 由中國科學院微生物研究所車永勝研究員提供。Sunrise酶標儀為TECAN公司生產；生物發(fā)光檢測儀為Promega公司生產；流式細胞儀為BD公司生產。

1.3 細胞培養(yǎng)

PC3M細胞于完全MEM培養(yǎng)基 (10%胎牛血清、100 g/L鏈霉素和100 U/mL的青霉素) 中培養(yǎng)，條件為37 ℃、5% CO2。

1.4 細胞增殖檢測

將5 000~10 000個細胞分至96孔板中，每孔加入100 μL完全MEM培養(yǎng)基 (含10%胎牛血清、100 g/L鏈霉素及100 U/mL的青霉素)。過夜后換為新鮮的無酚紅DMEM培養(yǎng)基 (含10%胎牛血清)，并加入不同濃度的C42。加入20 μL MTS/PMS (MTS∶PMS=20∶1)，37 ℃、5% CO2條件下持續(xù)培養(yǎng)，4 h內檢測，酶標儀測定490 nm處的OD值，每樣品設3次以上重復。

1.5 Western blotting檢測

細胞經(jīng)不同濃度、不同時間C42處理后，PBS漂洗并加入細胞裂解液 (150 mmol/L NaCl，50 mmol/L Tris-HCl，2 mmol/L EDTA，0.5% TritonX-100，0.5%脫氧膽酸鈉和 1×蛋白酶抑制劑)，收集裂解產物，冰上放置30 min，13 000 r/min離心15 min后收集上清。SDS-PAGE (8%) 電泳，濕轉法將蛋白轉移至PVDF膜。5%的脫脂牛奶封閉 2 h。孵育特異性抗體，anti-PARP為1∶1 000，anti-β-actin為1∶4 000，二抗分別為辣根過氧化物酶標記的抗兔 IgG 1∶4 000或抗小鼠IgG 1∶2 000，加ECL發(fā)光液，X-ray自顯影后采用圖像系統(tǒng)軟件Quantity One分析，分析目的蛋白的表達差異。

1.6 Caspase-Glo 3/7檢測

將5 000~10 000個細胞分至96孔板中，每孔加入100 μL完全MEM培養(yǎng)基 (含10%胎牛血清、100 g/L鏈霉素及100 U/mL的青霉素)。過夜后換為新鮮的DMEM培養(yǎng)基 (含10%胎牛血清)，并加入不同濃度的 C42，每孔100 μL。37 ℃、5% CO2條件下持續(xù)培養(yǎng)6 h后，于室溫下，加入100 μL Caspase-Glo 3/7試劑，300~500 r/min搖動30 min，生物發(fā)光儀檢測熒光。每樣品設3次以上重復。

1.7 流式細胞檢測

胰酶消化經(jīng)不同濃度C42處理的細胞，離心收集細胞，PBS洗滌 2次，加入 1×結合緩沖液(0.1 mol/L Hepes (pH 7.4)，1.4 mol/L NaCl，25 mmol/L CaCl2) 重懸細胞，使其密度為1×106個細胞/mL。取出 1×105個細胞加入流式專用管中，并加入5 μL Annexin V-FITC，室溫下避光孵育15 min，上機前1 min，再加入1.5 μL PI，并補加400 μL 1×結合緩沖液，混勻細胞后，流式細胞儀分析。

2 結果

2.1 C42處理可抑制PC3M細胞的增殖

通過MTS/PMS檢測C42處理對PC3M細胞增殖的影響。結果表明，使用濃度分別為0.25 μmol/L、0.5 μmol/L的C42處理PC3M細胞12 h后，其相對細胞增殖抑制率分別為11% (P＜0.05) 及44% (P＜0.01) (圖1A)。用濃度為0.25 μmol/L C42處理PC3M細胞，發(fā)現(xiàn)隨著時間的延長，PC3M細胞相對細胞增殖抑制率顯著增加 (圖1B)。如圖1B所示，PC3M細胞相對細胞增殖抑制率從無顯著變化 (6 h) 增加至 36% (24 h)，其中12 h組與6 h組相比，24 h組與12 h組相比均具有顯著性差異 (P＜0.01)。以上說明，C42具有抑制PC3M細胞生長的作用，并且對細胞生長的抑制作用同時間和濃度具有相關性。

圖1 C42誘導對PC3M細胞生長的影響Fig. 1 C42 inhibits the cell proliferation of prostate cancer cells. (A) Cell viability of PC3M cells treated with different concentrations of C42 for 12 h. (B) Cell viability of PC3M cells treated with C42 (0.25 μmol/L) for different time. The data is represented as from three independent experiments. *P<0.05; **P<0.01.

2.2 C42處理可誘導PC3M細胞凋亡的發(fā)生

細胞凋亡是細胞死亡的一條重要途徑。為驗證C42處理是否通過誘導PC3M細胞凋亡的發(fā)生，從而降低了其細胞增殖能力。我們利用細胞凋亡發(fā)生時膜內外翻的磷脂酰絲氨酸可與Annexin V特異性結合，及PI能穿透不完整細胞膜使凋亡晚期細胞和壞死細胞的細胞核著色的特征，通過Annexin V/PI雙染，利用流式細胞術對其進行了分析。結果表明，經(jīng)C42處理6 h后，細胞凋亡顯著增強。0.25 μmol/L 和 0.5 μmol/L C42處理后，其早期凋亡細胞增加數(shù)量與對照相比分別增加了1.1倍和2.6倍，均達到了統(tǒng)計學上的顯著差異 (圖2A，2B)。而晚期凋亡細胞和/或壞死細胞的增加數(shù)量，僅0.5 μmol/L的處理達到了顯著性差異 (圖2A，2C)。

2.3 C42處理可增強PC3M細胞中 caspase-3/7的活性

圖2 C42對PC3M細胞凋亡的流式細胞分析Fig. 2 The relationship between C42 and cell apoptosis of PC3M cells. (A) After treated with different concentrations of C42 for 6 h, PC3M cells were collected, incubated with FITC-Annexin V/PI and subjected to flow cytometry. (B) Quantities of early apoptotic cells: PI negative and Annexin V positive cells in all analyzed PC3M cells. (C) Quantities of end stage apoptotic and/ or necrotic cells: PI positive cells in all analyzed PC3M cells. The data is represented as from three independent experiments. *P<0.05; **P<0.01.

圖3 C42對caspase-3/7的激活Fig. 3 Relationship between C42 and the activity of caspase-3/7 in PC3M cells. PC3M cells were pretreated with C42 for 6 h, then, cells were subjected to caspase-Glo 3/7 assay. The data represented is based on three independent experiments. **P<0.01.

Caspase-3/7在細胞發(fā)生凋亡過程中起到至關重要的作用，其酶活性隨著細胞凋亡發(fā)生程度的增加而增加。為驗證C42處理PC3M細胞后誘導的細胞凋亡，是否具有caspase依賴性。我們用caspase-Glo 3/7試劑盒對caspase-3/7的活性進行檢測。如圖 3所示，隨著 C42處理濃度的增加，caspase-3/7切割的底物所發(fā)的熒光強度不斷增加，當C42濃度分別為0.1、0.25、0.5 μmol/L時，其熒光強度與對照組相比均具有極顯著的差異，分別是對照組的2倍、5倍和6.5倍。說明C42能夠增強PC3M細胞的caspase-3/7的活性，誘導caspase依賴性細胞凋亡，且具有一定的濃度依賴性。

2.4 C42處理可誘導PC3M細胞中PARP的剪切

PARP的切割是 caspase依賴性細胞凋亡的一種特異性標志，當caspase依賴性細胞凋亡發(fā)生時，116 kDa的PARP會被caspase特異性切割為89 kDa和24 kDa[13-14]。因此為進一步闡明C42誘導的細胞凋亡為 caspase依賴的凋亡，我們在分析了caspase-3/7活性的基礎上，對PARP的切割情況進行了分析。結果發(fā)現(xiàn)，當分別用濃度為0.1、0.25、0.5 μmol/L的C42處理PC3M細胞12 h后，隨著C42濃度的增加，PARP蛋白的被剪切程度增強 (圖 4A，4B)。當用 0.25 μmol/L的C42處理細胞0、3、6、12 h時，PARP的剪切量隨著時間的延長而不斷增加 (圖4C，4D)。PARP的剪切對C42具有一定的濃度依賴性和時間依賴性。這進一步說明，C42對PC3M細胞誘導的細胞凋亡為caspase依賴的細胞凋亡。

圖4 C42對PC3M細胞PARP剪切的影響Fig. 4 Relationship between C42 and the expression levels of cleaved PARP in PC3M cells. (A) Western blotting analysis of the PARP expression levels in PC3M cells. PC3M cells were treated with different concentrations of C42 for 12 h, then cells were lysed and subjected to western blotting with antibody to PARP or β-actin. (B) Quantification of the cleaved PARP (cPARP) expression levels for A. The cPARP/A (%) and cPARP/PARP (%) in PC3M cells treated with 0.5 μmol/L C42 were defined as 100 respectively. The results were based on three independent experiments. (C) Western blotting analysis of the cPARP expression levels in PC3M cells. Treated with 0.25 μmol/L C42 for 0 h, 3 h, 6 h, and 12 h, PC3M cells were then lysed and subjected to Western blotting with the antibody to PARP or β-actin. (D) Quantification of the cPARP expression levels for C. The cPARP/A (%) and cPARP/PARP (%) in PC3M cells treated with C42 for 12 h were defined as 100 respectively. The results were based on three independent experiments. cPARP/A (%): Quantitation of the cPARP (89 kDa) expression levels normalized against β-actin. cPARP/PARP (%): Quantitation of the cPARP (89 kDa) expression levels normalized against the full-length PARP (116 kDa).

3 討論

ETPs族化合物是來源于真菌的活性化合物，具有免疫抑制、抗炎癥反應和抗菌、寄生蟲、病毒等廣泛的生物活性作用[15]，是潛在的腫瘤治療藥物，其家族成員膠黏毒素、來普生苷均被證實對癌細胞產生毒性[16-18]。我們研究發(fā)現(xiàn)，從冬蟲夏草共生菌中分離到的此類化合物C42，具有抑制前列腺癌雄激素非依賴性 PC3M細胞生長和誘導細胞凋亡的作用。進一步分析發(fā)現(xiàn)，其對PC3M誘導的細胞凋亡為caspase依賴性的凋亡，C42處理細胞后，細胞的caspase-3/7的活性增加，PARP的被剪切程度增強。這對利用C42類化合物作為腫瘤藥物的臨床應用所涉及的基礎研究具有重要意義。

我們研究發(fā)現(xiàn)，在利用0.25 μmol/L C42處理PC3M細胞6 h后，即可顯著增加caspase-3/7的活性，增加 PARP的被剪切量，顯著誘導caspase依賴的細胞凋亡發(fā)生；處理12 h后，即可顯著降低細胞增殖能力，抑制PC3M細胞的生長；24 h后，與對照相比，其細胞增殖抑制率可達至36%。當C42使用濃度提高至0.5 μmol/L時，處理6 h后，其不僅能顯著地增加早期凋亡細胞的數(shù)量，且可顯著提高晚期凋亡細胞和/或壞死細胞的比例；處理12 h后，其細胞增殖抑制率可達44%。

而目前篩選出的對 PC3M細胞具有殺傷作用的其他化合物，如金絲桃素在 1 μmol/L濃度下，處理48 h后，其細胞增殖抑制率為20%[7]；羥基喜樹堿在2.74 μmol/L濃度下，處理24 h后，其抑制率為26.57%[8]；苦參堿在503 μmol/L濃度下，處理24 h后，其抑制率為1.68%[9]；DIM在10 μmol/L濃度下，處理48 h后，其抑制率為35.6%[6]。由此可見，C42對PC3M細胞具有更好的殺傷作用，且具有更高的潛在應用價值。

目前研究認為，促使細胞導向死亡的途徑主要有3種，即細胞凋亡 (Apoptosis)、自噬性死亡(Autophagic cell death) 和細胞壞死 (Necrosis)[19]。C42處理對PC3M細胞生長的抑制，除通過細胞凋亡途徑使細胞導向死亡外，是否還通過引起自噬性細胞死亡、細胞壞死而使細胞導向死亡，C42是否可抑制實體瘤的生長等，這些對進一步開發(fā)利用ETPs類真菌來源的活性化合物和研究此類化合物的可能臨床治療前列腺癌均十分重要，有待進一步深入研究。

致謝 衷心感謝中國科學院微生物研究所姜學軍研究員給予本文的指導與幫助！

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