馮全周，李十中，王莉，李天成

清華大學核能與新能源技術研究院新能源所，北京 100084

在能源短缺和環(huán)境污染日益嚴重的背景下，世界各國都在積極尋求發(fā)展可再生能源。生物質(zhì)能普遍被認為是一種理想的替代能源，特別是燃料乙醇[1-2]。包括農(nóng)業(yè)和工業(yè)廢棄物在內(nèi)的木質(zhì)纖維素是自然界中最為豐富的可再生資源，因此是工業(yè)化生產(chǎn)燃料乙醇的理想底物[3-4]。纖維素和半纖維素都是碳水化合物的聚合體，可以被水解為單糖。纖維素水解產(chǎn)物為葡萄糖；而半纖維素水解產(chǎn)物較復雜，主要是以木糖和葡萄糖為主的單糖[5]。所有這些水解產(chǎn)物中，葡萄糖和木糖含量占絕大部分[6-7]。因此，葡萄糖和木糖的高效充分轉化是纖維素乙醇生產(chǎn)必須解決的關鍵問題，引起了國內(nèi)外的廣泛關注。

自然界僅有少數(shù)細菌、酵母菌和真菌可發(fā)酵木糖產(chǎn)乙醇，但這些天然菌株大多存在乙醇收率低、對水解物中低濃度抑制物敏感、乙醇耐受性低等問題。另一方面，高產(chǎn)乙醇的菌株如釀酒酵母和運動發(fā)酵單胞菌等，通常不能利用木糖。為此，人們通過基因工程手段構建出一系列新的重組菌，使其可以發(fā)酵木質(zhì)纖維素水解液中的五碳糖產(chǎn)乙醇[8-13]。但重組菌株發(fā)酵速率慢，中間代謝產(chǎn)物木糖醇積累的現(xiàn)象比較嚴重，無法滿足乙醇發(fā)酵工業(yè)化生產(chǎn)的要求。

運動發(fā)酵單胞菌Zymomonas mobilis乙醇發(fā)酵性能優(yōu)良，與目前乙醇發(fā)酵使用的釀酒酵母相比，其高溫耐受性好、發(fā)酵速度快，有利于節(jié)省發(fā)酵過程發(fā)酵罐冷卻能耗，縮短生產(chǎn)周期[14]。此外，Z. mobilis通過ED途徑進行糖代謝，是目前已知唯一通過ED途徑厭氧代謝的微生物[15]。與釀酒酵母乙醇發(fā)酵的EMP不同，ED途徑中每分子葡萄糖只產(chǎn)生一分子 ATP，這一低能態(tài)造成較低的細胞產(chǎn)量和更高的乙醇產(chǎn)量，提高了乙醇對糖的收率，有利于降低原料消耗。盡管Z. mobilis只能利用葡萄糖、蔗糖和果糖[16],但該種屬模式菌株基因組測序已經(jīng)完成，遺傳背景清晰，是通過基因工程操作賦予五碳糖代謝途徑的良好出發(fā)菌株，已經(jīng)取得很多研究進展[10-11,17]。

本實驗室基于Z. mobilis 31821，將木糖異構酶 (xylA)、木酮糖激酶 (xylB)、轉醛醇酶 (talA)和轉酮醇酶 (tktA) 基因通過自行構建的質(zhì)粒結合在一起，構建了一株可以高效利用木糖發(fā)酵產(chǎn)乙醇的重組菌株Z. mobilis TSH01。本文研究了該工程菌的最優(yōu)發(fā)酵條件以及對玉米秸稈稀酸水解液的發(fā)酵效果，為其應用于利用木質(zhì)纖維素水解液發(fā)酵產(chǎn)乙醇提供了理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株、質(zhì)粒以及引物

大腸桿菌 DH5α被選為質(zhì)粒表達的受體菌，E. coli K-12提供tktA、talA、xylA以及xylB基因[18],其培養(yǎng)基為LB，培養(yǎng)條件為100 mg/L氨芐青霉素，37 ℃；Z. mobilis ATCC 29191提供Peno和Pgap啟動子基因[19-20]；Z. mobilis 31821作為宿主菌接收外源基因代謝木糖產(chǎn)乙醇；質(zhì)粒pMD-18 Simple T和pBBR322用來合成質(zhì)粒pMTM (表1)。Z. mobilis培養(yǎng)基為RMG (10 g/L酵母粉、2 g/L的KH2PO4以及各20 g/L的葡萄糖)，30 ℃靜置培養(yǎng)。

表1 本實驗所用的菌株和質(zhì)粒Table 1 Strain and plasmid used in this study

1.2 pMTM-talA-tktA-Pgap-xylA-Peno-xylB質(zhì)粒的構建

克隆策略如圖 1所示，首先，分別以Me-Ori-for和Me-Amp-rev為上、下游引物，從pMD-18 Simple T載體中擴增出氨芐青霉素(Amp) 抗性基因及Ori復制子序列，同時引入幾個酶切位點和EZ-Tn5轉座酶識別的Me序列；再用引物Tet-for和Tet-rev從pBBR322質(zhì)粒上擴增出四環(huán)素 (Tet) 抗性基因。分別將以上兩個PCR產(chǎn)物進行BamHⅠ+NcoⅠ雙酶切，DNA純化后進行連接轉化，抗性篩選出正確的克隆質(zhì)粒pMTM。以Z. mobilis ATCC 29191基因組DNA為模板，Peno-for-NdeⅠ和 Peno-rev-tktA為上、下游引物，擴增得到 NdeⅠ-Peno-3′片段；以E. coli K-12基因組 DNA為模板，tktA-for、tktA-rev-BglⅡ為上、下游引物，擴增得到5′-tktABgl Ⅱ片段。利用前者3′端和后者5′端的重疊序列 (表 2斜體部分) 進行 overlap PCR，得到NdeⅠ-Peno-tktA-BglⅡ操作子，雙酶切之后插入質(zhì)粒pMTM之中，得到質(zhì)粒pMTM-tktA。相同方法，不同引物 (表 2) 得到另外 3個操作子BamHⅠ-Pgap-talA-BamHⅠ、NdeⅠ-Pgap-xylABamHⅠ和XhoⅠ-Peno-xylB-BamHⅠ。BamHⅠ單酶切 BamHⅠ-Pgap-talA-BamHⅠ之后非定向插入質(zhì)粒 pMTM-tktA，篩選獲得正確的pMTM-talA-tktA質(zhì)粒。NdeⅠ+BamHⅠ雙酶切NdeⅠ-Pgap-xylA- BamHⅠ后定向插入 pMTM-talA-tktA 質(zhì)粒，篩選到正確的 pMTM-talA-tktA-Pgap-xylA質(zhì)粒。最后一個XhoⅠ-Peno-xylBBamHⅠ操作子經(jīng) XhoⅠ+BamHⅠ雙酶切后定向插入pMTM-talA-tktA-Pgap-xylA質(zhì)粒之中，篩選得到最終含有木糖代謝相關的4個基因的質(zhì)粒：pMTM-talA-tktA-Pgap-xylA-Peno-xylB。

1.3 重組菌Z. mobilis TSH01的構建

用 ApaⅠ酶切質(zhì)粒 pMTM-talA-tktA-PgapxylA-Peno-xylB之后，得到兩端含有 Me序列的目的基因的片段，將其與轉座酶EZ-Tn5混合，室溫反應30~60 min，形成轉座復合體，取1 μL電轉化進入Z. mobilis 31821感受態(tài)內(nèi)，電轉化條件參照文獻[22]。10 g/L的四環(huán)素抗性RMG平板篩選，挑取幾個單菌落接種RMGX (20 g/L葡萄糖和20 g/L木糖) 液體培養(yǎng)基中，得到幾株可以代謝木糖產(chǎn)乙醇的重組菌，選取其中一株代謝木糖速率最快的進行下步發(fā)酵驗證，并將其命名為Z. mobilis TSH01。

圖1 載體質(zhì)粒pMTM-talA-tktA-Pgap-xylA-Peno-xylB的構建Fig. 1 Construction of pMTM-talA-tktA-Pgap-xylA-Peno-xylB.

表2 本實驗所用引物Table 2 Primer used in this study

1.4 發(fā)酵操作

取出凍存于?80 ℃冰箱內(nèi)的 Z. mobilis TSH01，用接種環(huán)將其接種于50 mL RMGX培養(yǎng)基中，30 ℃靜置培養(yǎng)1~2 d至OD600為2~3之間，作為一級種子液；取1 mL一級種子液接種于含200 mL培養(yǎng)基的500 mL三角瓶內(nèi)，30 ℃厭氧靜置培養(yǎng)18 h至OD600約為2，可作為二級種子液。所有發(fā)酵實驗均采用二級接種，將200 mL二級種子液在4 000 r/min條件下離心5 min，棄上清液，加50 mL滅菌水使菌體重新懸浮，接種于2 L的發(fā)酵罐進行發(fā)酵。發(fā)酵條件為：120 r/min攪拌，不通空氣進行厭氧發(fā)酵，采用 2 mol/L的KOH溶液調(diào)節(jié)發(fā)酵液的pH。

玉米秸稈水解條件：玉米秸稈粉碎后與2%稀硫酸混合，固液比1∶10，121 ℃保溫1 h，過濾，采用CaO過量中和，過濾，調(diào)pH至中性，利用真空旋轉蒸發(fā)儀濃縮備用。

1.5 分析

發(fā)酵液中的乙醇含量用氣相色譜進行定量分析，方法采用內(nèi)標法，內(nèi)標物為正丙醇；葡萄糖、木糖、乙酸、甲酸、糠醛用高效液相色譜進行定量分析，色譜柱使用 Aminex HPX-87H column (Bio-Rad USA) 離子交換柱，流動相為0.05 mol/L的H2SO4，流速為0.6 mL/min，柱溫為40 ℃，采用示差折光檢測器RID-20A (島津公司)，檢測器溫度為40 ℃。

計算公式：

2 結果與分析

2.1 發(fā)酵條件的確定

為確定Z. mobilis TSH01的最佳發(fā)酵條件，選取40 g/L的葡萄糖和40 g/L的木糖為發(fā)酵培養(yǎng)基的碳源，設計兩因子、兩水平的正交試驗，研究溫度 (30 ℃和37 ℃) 和pH值 (5和6) 對發(fā)酵結果的影響。表3為發(fā)酵驗證結果，較高pH條件下發(fā)酵有更高的葡萄糖利用率，而且據(jù)報道[22]，當胞內(nèi)pH降低時，會導致胞內(nèi)有機酸處于未電離狀態(tài)，未電離狀態(tài)的有機酸會對發(fā)酵產(chǎn)生抑制作用；而且相同溫度下，當pH為6時，無論是木糖利用率還是乙醇收率均比pH 5時要高；當pH同為6時，37 ℃發(fā)酵的木糖利用率和乙醇收率也比30 ℃發(fā)酵時要高。37 ℃條件下，控制pH為6的發(fā)酵具有最大的木糖利用率和乙醇收率，分別為98.5%和94.3%。為得到更高的乙醇收率，因此37 ℃，pH 6被選定為后續(xù)發(fā)酵條件。

2.2 純糖發(fā)酵研究

圖2為發(fā)酵培養(yǎng)基中可發(fā)酵糖分別為8%葡萄糖、8%木糖、8%葡萄糖和8%木糖時，糖利用以及乙醇生成隨時間的變化趨勢。該圖表明，單一糖組分發(fā)酵時，葡萄糖的完全利用時間為25 h，利用速率為3.06g/(L·h) (5~14 h為快速利用期，利用速率為 6.8 g/(L·h))；而木糖需要發(fā)酵72 h才能利用完畢 (無快速利用期)，利用速率為1.01 g/(L·h)?；旌习l(fā)酵時，葡萄糖完全利用需要48 h，利用速率為1.41 g/(L·h) (16~36 h為快速利用期，利用速率為2.55 g/(L·h))；木糖發(fā)酵72 h后利用完畢，利用速率為1.05 g/(L·h) (32~48 h為快速利用期，利用速率為 2.54 g/(L·h))。單一糖組分發(fā)酵時，雖然二者均可以被充分利用，但是Z. mobilis TSH01對木糖的利用速率要明顯低于葡萄糖的利用速率；混合發(fā)酵時，由于木糖代謝會產(chǎn)生木糖醇，而木糖醇的存在會抑制菌體生長，從而導致葡萄糖的利用速率降低[23]，在Z. mobilis中，木糖是經(jīng)由運輸葡萄糖的通道Glf進入細胞內(nèi)的，當葡萄糖存在時會抑制木糖的吸收，而當葡萄糖下降到低濃度時會減少對木糖轉運的抑制，木糖便借助Glf通道以較快速度進入胞內(nèi)進行代謝[21]。

表3 不同溫度和pH下Z. mobilis TSH01發(fā)酵產(chǎn)乙醇的結果Table 3 Fermentationa results for Z. mobilis TSH01 at different temperature and pH

圖2 不同糖源溶液發(fā)酵過程中糖源消耗以及乙醇生成動力學曲線Fig. 2 Fermentation of pure sugar. (A) Fermentation of 8% glucose. (B) Fermentation of 8% xylose. (C) Cofermentation of 8% glucose and 8% xylose.

表4計算并比較了3批發(fā)酵的糖利用率和乙醇收率。無論是單一組分發(fā)酵，還是混合發(fā)酵，糖利用率相差不大；但是單一組分發(fā)酵時的乙醇收率要遠小于混合發(fā)酵的，木糖為唯一組分時尤為明顯。這一現(xiàn)象的原因包括以下幾方面[23]：1)外源基因導入引起的代謝負擔增加；2) 包括木糖醇、乙酸、乳酸、乙偶姻以及二羥基丙酮等副產(chǎn)物的生成；3) 木糖醇的抑制；而混合發(fā)酵引起乙醇收率增加的現(xiàn)象之前也有過報道[24]。根據(jù)圖2和表3數(shù)據(jù)分析的對比結果可以大體推斷：在糖源進入胞內(nèi)的運轉機制上，葡萄糖和木糖存在一定的競爭；而低濃度的葡萄糖會促進木糖的胞內(nèi)吸收。所以混合發(fā)酵則會提高發(fā)酵效率，獲得更高的乙醇收率。

2.3 玉米秸稈水解液發(fā)酵分析

作為生產(chǎn)燃料乙醇工程菌的目標發(fā)酵底物，木質(zhì)纖維素原料的水解液成分復雜，包括一系列的糖分 (主要為葡萄糖和木糖) 和乙酸以及呋喃衍生物等抑制物。本實驗室采用工業(yè)中玉米秸稈的酸解工藝[25]得到水解液，研究了 Z. mobilis TSH01對玉米秸稈稀酸水解液的發(fā)酵效果。所制備玉米秸稈水解液中的成分如表5所示。

2.3.1 水解液發(fā)酵結果

將得到的稀酸水解液過濾中和后進行濃縮，補加葡萄糖使其與木糖濃度大體一致，加入10 g/L酵母粉和2 g/L的KH2PO4，高溫消毒后作為發(fā)酵培養(yǎng)基。發(fā)酵結果如圖3所示，發(fā)酵24 h葡萄糖基本消耗完全；72 h時木糖利用率為92.3%；以72 h為截點，計算出乙醇代謝收率為91.5%。發(fā)酵0 h取樣，測得乙酸、甲酸和糠醛的濃度分別為10.5 g/L、1.5 g/L和1.1 g/L；此外，隨著發(fā)酵進行過程上述3種物質(zhì)濃度均會逐漸減低，前兩者的濃度降低與加堿有關系，而后者濃度降低是因為菌體發(fā)酵過程中被代謝掉了。對比純糖發(fā)酵實驗，普通稀酸水解液中所含的抑制物質(zhì)對發(fā)酵影響不大，因此說明，Z. mobilis TSH01對普通稀酸水解液中的抑制物 (主要為10 g/L的乙酸) 具有良好的耐受性。

表4 Z. mobilis TSH01純糖發(fā)酵產(chǎn)乙醇的結果Table 4 Fermentation results for Z. mobilis TSH01 of pure suger

表5 玉米秸稈稀酸水解液成分Table 5 Components of corn stover hydrolysate

圖3 玉米秸稈稀酸水解液發(fā)酵Fig. 3 Fermentation of corn stover hydrolysate.

2.3.2 添加成分對發(fā)酵的影響

圖4 添加成分對玉米秸稈水解液發(fā)酵的影響Fig. 4 Effect of corn stover hydrolysate fermentation by additional components. (A) Without yeast extract and KH2PO4. (B) With KH2PO4 but yeast extract.

考慮到成本因素，木質(zhì)纖維素水解液發(fā)酵產(chǎn)乙醇過程應該是添加物質(zhì)越少越好，實驗中除調(diào)控pH用KOH之外，外源添加物只有酵母粉和KH2PO4，于是我們通過發(fā)酵試驗驗證這兩者對糖利用和乙醇收率的影響 (圖4)。A組實驗為不添加酵母粉和KH2PO4情況下，給水解液補充葡萄糖至濃度和木糖基本相當，滅菌后調(diào)控pH進行發(fā)酵。發(fā)酵72 h后，葡萄糖和木糖利用率分別為98%和68.4%；乙醇代謝收率為84.1%。B組實驗為添加KH2PO4但不添加酵母粉情況下，后續(xù)操作發(fā)酵和A組實驗一樣。發(fā)酵72 h后，葡萄糖和木糖利用率分別為98%和94.4%；乙醇代謝收率為94.5%。B組實驗結果表明，酵母粉對糖利用率和乙醇收率基本上沒有任何影響。再結合A組實驗結果，可以得出結論：KH2PO4對混合發(fā)酵木糖利用率和乙醇收率的提高有明顯的促進作用，因為調(diào)控pH用的是KOH，發(fā)酵液中已經(jīng)存在K+，所以提升發(fā)酵效果的應該是PO43?、HPO42?或者H2PO4?，此結論需要進一步驗證。

3 結論

通過加強啟動子對木糖代謝產(chǎn)乙醇基因的調(diào)控，使每個基因均處于強啟動子調(diào)控之下，避免單一或者幾個蛋白對乙醇代謝途徑的限制，構建了一株共發(fā)酵葡萄糖和木糖性能良好的基因工程菌Z. mobilis TSH01，可同時高效利用葡萄糖和木糖產(chǎn)乙醇。Z. mobilis TSH01的最優(yōu)發(fā)酵條件為添加0.2% K2HPO4、pH 6.0、37 ℃、厭氧發(fā)酵。單一糖溶液發(fā)酵時，葡萄糖利用速率很高，可以達到3.06 g/(L·h)，而木糖利用速率相對較低，為1.01 g/(L·h)；當二者共發(fā)酵時，葡萄糖利用速率降低，而木糖利用速率有所提高，而且當葡萄糖濃度降低到一定值后木糖出現(xiàn)一個快速消耗階段，該結果表明，Z. mobilis TSH01代謝產(chǎn)乙醇的途徑中，葡萄糖和木糖在轉運機制上存在競爭關系，而低濃度的葡萄糖會減少對木糖吸收利用的抑制。當混合糖濃度為16% (1∶1)，葡萄糖和木糖的利用率分別為98.5%和97.4%，乙醇代謝收率高達94.9%。其對玉米秸稈稀酸水解液72 h的發(fā)酵結果為：葡萄糖和木糖的利用率分別為100%和92.3%，乙醇代謝收率為91.5%。而且KH2PO4對發(fā)酵過程中木糖的利用以及乙醇收率提高有明顯的促進作用。

Z. mobilis TSH01對玉米秸稈稀酸水解液中的抑制物具有良好的耐受性，而且發(fā)酵產(chǎn)乙醇效率很高；發(fā)酵環(huán)境為厭氧環(huán)境，無需攪拌，可減低纖維素乙醇工業(yè)化生產(chǎn)成本，具有很好的工業(yè)化應用前景。

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