黃子亮，張翀，吳希，蘇楠，邢新會

清華大學化學工程系，北京 100084

酶是一類能在溫和條件下催化化學反應的物質 (絕大部分為蛋白質)，具有高底物特異性、高產(chǎn)物特異性和高催化效率等特點。酶不但在各種生命活動中扮演著重要的角色，而且隨著人類對各種酶特性的認識加深，其功能被廣泛應用于人類生活、醫(yī)藥、環(huán)保和工業(yè)生產(chǎn)等領域[1]。生命科學和生物技術的快速發(fā)展，使人們對酶的認識不再停留在簡單的應用研究上，開始從微觀上探究酶的分子結構、催化特性和機理，并積累了豐富的酶學數(shù)據(jù)，如BRENDA數(shù)據(jù)庫目前已經(jīng)收錄了 5 536種酶的催化特性數(shù)據(jù)， PDB數(shù)據(jù)庫收錄了38 315條酶立體結構相關的記錄。同時，隨著基因工程、蛋白質工程和分子酶工程、基因組學、蛋白組學以及宏基因組學等技術發(fā)展，不僅大大提高了人們發(fā)現(xiàn)新酶 (特別是挖掘具有工業(yè)應用潛力的新酶)的能力[2-3]，而且也提供了更多的改造酶功能的工具，使酶在清潔工業(yè)中的應用也進入了一個新的階段，在化學品生產(chǎn)、食品加工、有機合成、醫(yī)療保健、檢測、污染治理等方面的成功應用案例日益增多 (目前已有超過 300種酶催化過程在工業(yè)生產(chǎn)中得到應用[4])。

酶催化技術的核心是酶的高效生產(chǎn)、分離、制劑化和應用開發(fā)，但目前酶制劑的生產(chǎn)過程復雜、成本高是制約酶催化廣泛應用的關鍵問題。因此，酶的高催化活性、高穩(wěn)定性及循環(huán)利用技術成為構建高效低成本酶催化工藝的關鍵創(chuàng)新方向所在。雖然通過基因工程等手段，可以利用合適的宿主對酶進行高效異源表達，但實際生產(chǎn)上還面臨著蛋白可溶表達效率低、蛋白不穩(wěn)定、分離純化壓力大、活性檢測繁瑣等問題。此外，工業(yè)生物催化中，希望利用的底物或希望得到的產(chǎn)物往往與酶的天然底物/產(chǎn)物不同，一些催化過程還難以在自然界中找到合適的酶。另外，工業(yè)生物催化過程中的環(huán)境 (如高底物濃度、高產(chǎn)物濃度、有機溶劑等) 與酶合成過程中所處的細胞環(huán)境有很大差異，天然酶不一定具有實際催化環(huán)境所要求的耐受性。再者，由于天然酶的穩(wěn)定性有限，且工業(yè)生物催化過程中酶處于不斷“消耗”的過程，因此對酶的穩(wěn)定性提出了較高的要求。這些都表明需要對酶的性能進行改造和優(yōu)化[1]。

除了傳統(tǒng)的固定化、溶劑工程、過程工程等手段，通過分子生物學技術對酶進行改造，是目前重要且有效的方法[1]?；谌诤系鞍自O計的融合酶技術是分子酶工程和代謝工程的一個研究熱點，已逐漸應用于多功能酶和酶靠近效應的構建與控制研究中，顯示出重要的理論和應用研究價值 (圖 1)。本論文重點綜述融合酶的分子設計及其應用研究進展，并對今后的發(fā)展趨勢和需要解決的問題進行了展望。

圖1 融合酶在工業(yè)酶過程集成及代謝酶空間靠近效應控制中的重要性. (A) 同時具有可視化信號、親和吸附和催化功能的融合酶能實現(xiàn)酶生產(chǎn)、分離、檢測和催化的過程集成. (B) 融合酶能作為調控代謝酶空間靠近效應的一種有力手段Fig. 1 The importance of fusion enzymes in process integration and proximity modulation of metabolic enzymes. (A) Fusion proteins with visible signal, affinity and catalysis functions can realize the process integration for enzyme production, purification, detection and catalysis. (B) Fusion enzymes is a useful tool for modulating proximity of metabolic enzymes.

1 融合酶的概念及其特點

融合酶是指通過一定的手段將目標酶和另外一個或多個酶 (或蛋白、短肽等) 以一定的形式連接起來，從而獲得的具有多種功能的酶。構建融合酶的最直接的優(yōu)勢之一是可以將多個蛋白功能集成于一體，實現(xiàn)酶的多功能化。融合蛋白策略在酶的高效表達、分離純化、跟蹤定位、快速定量、目標靶向等方面已經(jīng)有了廣泛的應用[5-10]。特別是，通過構建具有親和吸附和熒光的多重融合蛋白，可以實現(xiàn)酶的生產(chǎn)、分離、催化、監(jiān)測等多個過程的集成，能減少酶制劑的使用成本 (圖1A)[11]，而這正是目前工業(yè)酶催化的瓶頸問題之一。融合酶的另一個優(yōu)勢在于能夠將多種酶催化活性整合在一個雜合蛋白上。在大量的順序酶催化 (Sequential catalysis) 過程中，一個酶的產(chǎn)物 (中間產(chǎn)物) 是下一歩 酶催化反應的底物，而這些酶往往處于游離狀態(tài)，特別在細胞工廠內(nèi)，酶分子之間的距離難以控制，制約了其催化效率。一個解決思路是通過融合蛋白技術將多個參與序列催化反應的酶連接，通過調控其空間靠近效應，控制反應效率。通過融合酶實現(xiàn)多酶的空間靠近效應，能帶來一系列好處 (圖1B)：1) 強化中間產(chǎn)物在兩個或多酶之間的傳遞過程；2) 避免了中間產(chǎn)物向主體相的擴散；3) 減少了中間產(chǎn)物被其他副反應的競爭；4) 減少了中間體不穩(wěn)定性導致的降解；5) 更重要的是增加了中間產(chǎn)物在催化活性中心附近的局部濃度(一般情況下中間產(chǎn)物的平衡濃度遠低于Km)，從而大大加速了整個順序催化過程[12-13]。在天然酶中也已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了不少在進化過程中通過融合不同催化結構域以提高順序催化過程效率的例子[14-17]，多蛋白融合被認為是自然界進化的一種高級形態(tài)，表明構建融合酶強化酶的空間靠近效應是調控酶催化反應效率的極具研究價值的方向，為代謝工程提供新的手段。

2 融合酶的分子設計策略研究進展

2.1 直接的順序融合

融合酶最簡單的構建方式是直接把兩個酶的編碼基因首尾相連 (除去第一個酶的終止密碼子)，構成融合酶基因，繼而在合適的宿主中進行蛋白表達得到融合酶 (順序融合，end-to-end fusion，圖2A)[18]。關于這方面的報道，之前已經(jīng)有不少研究者對其做了很好的總結，在此不再贅述[19-22]。理論上，因為新得到的融合酶分子的一級序列包含融合前各個酶的一級序列，因此應該具有被融合的酶所具有的功能，而且也有不少成功的案例[3,23-25]。然而實際上，通過這個方法構建得到的融合酶，往往會導致 (單個或多個)酶功能的喪失甚至是表達的失敗[23,26]，其原因可以總結如下：1) 融合酶基因翻譯后多肽鏈上各個氨基酸殘基之間的相互作用，比單個酶 (結構域) 的情況要復雜得多，編碼不同結構域的多肽片段上的氨基酸殘基相互干擾，有可能打破了某個結構域正確折疊的過程，從而導致該結構域乃至整個融合酶的折疊失敗，最后得到被降解的多肽或者包涵體。2) 與單獨表達時每個酶的N端和C端處于自由狀態(tài)下不同，融合表達時各個結構域的N端和C端首尾相連，會影響各個結構域在這些區(qū)域的折疊和天然構象，導致功能受影響。3) 蛋白在催化過程中需要在構象上有一定程度的變化和運動，直接融合將導致結構域自由度的減少，阻礙這種運動進行，從而使得酶的催化能力下降。4) 某個結構域和底物的結合可能在空間上受到其他結構域的屏蔽和阻礙，導致酶-底物親和性下降，同樣催化后也會影響產(chǎn)物離開活性中心，這些都將影響酶的催化能力[27-28]。鑒于直接順序融合會導致折疊、表達和催化等過程出現(xiàn)問題，這種融合策略已經(jīng)逐漸被其他融合策略所取代。

圖2 幾種融合酶的分子設計策略示意圖. (A) 直接順序融合. (B) 通過連接肽的順序融合. (C) 插入融合. (D) 分枝融合 (圖中N和C分別表示蛋白的N端和C端)Fig. 2 Several strategies for fusion enzyme design. (A) Direct end-to-end fusion. (B) End-to-end fusion with a linker. (C) Insertional fusion. (D) Branched fusion (N and C denote the N-terminus and C-terminus of the protein, respectively).

2.2 通過連接肽的順序融合

為了解決直接順序融合遇到的問題，研究者提出了各種融合策略，其中在兩個酶之間引入連接肽 (Linker) 是一種有效的手段，并已經(jīng)被很多研究者所采用 (圖2B)[15,29-32]。連接肽是指兩個被融合的酶或者結構域之間存在的一段多肽(一般認為與酶的催化過程沒有直接聯(lián)系)，其長度從幾個到上百個氨基酸殘基不等[33-35]。在自然界發(fā)現(xiàn)的酶分子中，兩個結構域之間也發(fā)現(xiàn)有連接肽的存在，表明這是自然界中產(chǎn)生的這類“融合”蛋白是自然進化過程的一種策略[34-36]。連接肽的引入之所以能實現(xiàn)融合酶的成功表達，目前一般認為是因為連接肽能把兩個酶 (結構域) 適當?shù)母糸_，從而避免了不同結構域在折疊、催化過程中的相互干擾[27,34]。目前已經(jīng)有很多多肽序列 (天然的或者人工設計的) 被用作連接肽，以下總結了近年研究中幾類常見的連接肽類型(表1)。

2.2.1 柔性連接肽

柔性連接肽 (Flexible linker) 是指沒有形成特定二級結構的能力的連接肽，這類連接肽在空間上一般是以無規(guī)卷曲的形式存在[27-28]。其中，聚甘氨酸或者富含甘氨酸的連接肽是典型的柔性連接肽，這種連接肽能增加蛋白的可溶性，抗蛋白酶降解，并能提供催化過程中蛋白所需的柔性，使各個結構域不相互干擾，因此得到非常廣泛的應用[27-28,37]。最為典型的柔性連接肽是Huston等提出的 (GGGGS)n(一般n≤6)[32,38-39]，已經(jīng)幾乎成為一種“通用連接肽”。Lu等在構建β-葡聚糖酶 (Glu) 和木聚糖酶 (Xyl) 的融合酶的研究中發(fā)現(xiàn)，若不使用連接肽，融合酶的Xyl活性的催化效率會有 31%的下降 (與單獨表達的Xyl相比，下同)，而引入 (GGGGS)2連接肽后，Xyl的催化效率有43%的提高，Glu的催化效率也比沒有連接肽的情況下更高[25,31]。雖然(GGGGS)n一類的柔性連接肽已經(jīng)在很多融合體系中成功應用，但這種連接肽也存在諸多不足，譬如容易被蛋白酶降解，對兩個結構域的隔離效果不穩(wěn)定等，在一些體系中導致融合酶表達和催化的失敗[40-42]。

2.2.2 能形成α螺旋的連接肽

自Maeda等在構建蛋白G和熒光素酶融合酶的工作中成功應用一個來自葡萄球菌蛋白 A的α-集束結構域作為連接肽，能形成α螺旋的多肽才開始被接受并作為連接肽使用[42]。雖然蛋白A的α-集束能有效隔開兩個結構域，但作為連接肽對融合酶來說太大，會增加蛋白表達的負擔和風險。Maeda等后來采用 (EAAAK)n(一種能形成α螺旋的結構)[43]，同樣成功實現(xiàn)了融合酶的活性表達。Arai等通過進一步研究 (EAAAK)n在融合蛋白中的構象，證實了 (EAAAK)n能形成螺旋結構，而且隨著 (EAAAK)n中結構單元數(shù)目 n的增多，兩個相連的結構域之間的距離越大[40-41]。與 (GGGGS)n相比，(EAAAK)n的優(yōu)勢在于能形成相對穩(wěn)定的二級結構，能給兩個相連的結構域提供相對穩(wěn)定且可控的隔離效果；而(GGGGS)n類型的連接肽，即使增加其重復單元數(shù)目，但結構域間的距離變化不大，且(GGGGS)n提供的隔離效果在不同體系中變化較大[40]。在蛋白穩(wěn)定性方面，因為 (EAAAK)n不是舒展的構象，在一定程度上減少了蛋白酶攻擊的可能性，使得融合蛋白較為穩(wěn)定；而(GGGGS)n的舒展構象有可能使其成為蛋白酶切割位點，導致融合蛋白的不穩(wěn)定[37]。Amet等在不同融合蛋白中引入 (EAAAK)2，發(fā)現(xiàn)蛋白表達量能分別提高1.7~11.2倍[44]。本研究組在構建肝素酶 (HepA)、麥芽糖結合蛋白 (MBP) 和綠色熒光蛋白 (GFP) 的融合蛋白的研究中發(fā)現(xiàn)，當在MBP和GFP之間引入柔性連接肽 (GGGGS)3時，不能得到全長的目標蛋白；而MBP和GFP之間采用剛性連接肽 (EAAAK)3則能實現(xiàn)融合蛋白的高效表達[45]，表明α螺旋連接肽在融合蛋白表達和折疊上的優(yōu)勢。但是連接肽的屬性，特別是剛/柔性對融合酶的性能影響規(guī)律目前了解得十分有限，融合酶的設計仍是個案處理 (Case by case)，缺乏理論依據(jù)和指導。

2.2.3 抗蛋白酶降解的連接肽

(GGGGS)n最初被認為是能抵抗蛋白酶降解的一種結構，但后來被各種實驗數(shù)據(jù)證實并非如此[37]，這也能看出抗蛋白酶降解是人們希望連接肽具有的一種重要特性，對于融合蛋白的穩(wěn)定表達和催化有著重要意義。富含脯氨酸的多肽特別是脯氨酸-蘇氨酸 (PT) 重復序列經(jīng)常被用作連接肽的一個原因就是其被證實具有明顯的抗蛋白酶降解性，而且經(jīng)常出現(xiàn)在天然多結構域蛋白中作為連接肽[33,37]。譬如很多天然的纖維素酶和木聚糖酶就是通過 (PT)nP結構的多肽來連接其催化模塊和碳水化合物結合模塊 (CBM)，其連接肽已經(jīng)被證明對纖維素和木聚糖的降解非常重要[46-47]。除了從天然蛋白中尋找抗降解的連接肽外，另外一個策略就是通過計算機輔助設計人工連接肽，使其具有抗蛋白酶降解的性能。如通過MEROPS蛋白酶數(shù)據(jù)庫，根據(jù)在表達宿主中已知的蛋白酶切割位點信息來進行連接肽設計以及切割位點的預測[48-49]。Kavoosi等在CBM-GFP融合體系中，比較了常見的 (GGGGS)n，天然的(PT)nP和通過MEROPS設計的S3N10等連接肽的效果，發(fā)現(xiàn)S3N10和 (PT)nP均有很好的抗蛋白酶降解作用，而 (GGGGS)n上有不少位點受到了蛋白酶的切割[37]。

表1 不同類型連接肽的特點Table 1 Characteristics of different types of linkers

2.3 插入融合

相比于目前廣泛采用的順序融合，插入融合(Insertional fusion) 是融合蛋白的一種有趣的選擇模式，而且在酶催化的調控上有著其他融合方式所不具備的優(yōu)勢，并逐漸被作為一種新的功能整合方式應用在不同場合，具有巨大潛在的研究和應用價值 (圖2C)[18,50-54]。插入融合蛋白是指一個客體結構域被插入到一個主體結構域內(nèi)部形成的融合蛋白。插入融合的設計較順序融合困難，因為需要考慮融合后兩個結構域的相互空間結構。一般來說，成功的插入融合需要滿足兩方面的條件，即客體結構域在天然構象中其C端和N端在空間上要足夠靠近，以及主體結構域能承受由于客體的插入導致其結構域不連續(xù)所帶來的影響。這些看似苛刻的條件實際上沒有那么難以滿足[55]。首先，基于對PDB數(shù)據(jù)庫中已知結構蛋白的分析，約 50%的蛋白均具有靠近的 C端和N端 (距離小于5?)，從而能滿足被插入的空間要求[56]。另外，不連續(xù)結構域 (結構域的線性序列被另一結構域序列插入其中) 在自然界的蛋白中很常見。Jones等對蛋白的結構域進行的一個系統(tǒng)調查發(fā)現(xiàn)，28%的蛋白結構域都是不連續(xù)的[57]。這些發(fā)現(xiàn)都為插入融合的結構域提供了廣闊的選擇空間。Ehrmann等將堿性磷酸酶PhoA插入到跨膜蛋白MalF中，首次成功獲得同時具有兩者活性的插入融合蛋白[58]，隨后更多的蛋白組合被發(fā)現(xiàn)能用于插入融合。Doi等構建了將β-內(nèi)酰胺酶 (BLA) 插入到GFP的融合，通過控制 BLA的抑制蛋白 (BLIP) 的水平，實現(xiàn)了對GFP熒光的調控[18]。Guntas等將BLA插入到MBP，通過麥芽糖濃度改變MBP構象，從而實現(xiàn)BLA活性在0.16%~100%之間 (600-fold) 的調控，展示了插入融合作為分子開關的巨大潛力[59]。還有很多研究小組發(fā)現(xiàn)插入融合酶的構建在催化調控和分子傳感器等方面有巨大的潛在價值[60-61]。盡管基因組學和蛋白組學為插入融合提供了豐富的蛋白結構域信息和物質基礎，但插入融合仍面臨一些關鍵問題，譬如如何選擇兩個蛋白使其融合之后能具有調控的效果，以及插入位點的選擇。雖然通過計算模擬可以對其進行預測，但目前人們對蛋白結構域運動和相互作用的認識還難以做到很好的預測。

2.4 蛋白水平融合和分枝融合

作為構建和設計融合酶的一種策略，除了在基因水平進行融合外，也可在蛋白質水平對酶進行直接融合。在蛋白水平進行融合的優(yōu)勢在于：1) 融合酶基因的表達有可能因形成包涵體等原因導致不能獲得有活性的融合酶或者產(chǎn)量、活性低，而蛋白水平的融合則不涉及融合酶基因的表達和折疊；2) 在目標蛋白的基因無法獲取的情況下 (如一些抗體)，或者需要構建非天然結構的情況下 (如分枝結構等非線性結構)，基因水平融合無法實現(xiàn)融合酶的構建，只能利用蛋白水平的融合。特別是在構建多重融合酶的情況下，蛋白水平融合將具備更加明顯優(yōu)勢[62]。將兩個蛋白進行融合 (或交聯(lián)) 有多種方法，其中通過酶法進行融合是最有效的方法[63]，而能催化這類蛋白-蛋白融合的酶主要有谷氨酰胺轉氨酶 (TGase)、轉肽酶 (如分選酶)，以及一些氧化還原酶 (酪氨酸酶、漆酶、過氧化物酶)[63-68]。分枝融合(Branched fusion) 正是利用蛋白-蛋白融合技術發(fā)展出來的一種新的融合方式 (圖 2D)。與順序融合相比，分枝融合在構建多元融合蛋白上有著明顯的優(yōu)勢：各個結構域的空間分布更均勻，空間位阻和干擾更少，更利于多個結構域之間的電子傳遞和反應中間體傳遞等。Hirakawa等利用TGase，成功構建了一個三元分枝融合蛋白 (包括單加氧酶細胞色素 P450，電子傳遞蛋白假單胞氧還蛋白Pdx，以及Pdx還原酶)。與3個酶等量混合的體系相比，分枝融合酶在3個結構域之間的電子傳遞效率和初始反應速率上都有了極大的提升[69-70]。Schoffelen等構建了一個具有分枝結構的多重融合酶 (含5個結構域)，包括植物次級代謝產(chǎn)物云杉新甙合成途徑相關的 3個酶(對稱二苯代乙烯合成酶、4-香豆酸輔酶 A連接酶和糖基轉移酶)。他們的結果表明該融合酶能在體外環(huán)境以對香豆酸為前體物合成云杉新甙，表明了分枝融合酶在多步催化過程中的應用潛力，是對順序融合酶的有力補充[62]。但這類融合方法的局限性也是明顯的，如 1) 融合方法的局限性比較大，且連接肽中需要引入特定的氨基酸作為酶的識別位點，給連接肽設計帶來限制；2) 目標酶分子中有可能存在催化融合過程的酶的作用位點，導致融合過程不能特異性地進行；3) 催化融合過程是一個多酶混合體系，如融合效率不足以使得大部分酶實現(xiàn)融合，殘留的目標蛋白會對后面的應用造成干擾，同時催化融合的酶也可能帶來影響。

2.5 其他融合方式

分子酶工程、蛋白質工程、結構生物學的發(fā)展，以及對新酶、新蛋白質的開發(fā)和發(fā)現(xiàn)，都推動著融合酶分子設計的快速發(fā)展，以上只是針對其中較為系統(tǒng)的幾種融合酶分子設計策略進行介紹，此外還有很多值得關注的設計策略，如對嗜熱酶的使用[3,23-24]、功能多肽的應用[7-8,71]、以及對連接肽二級結構的設計等[72-73]，都能為融合酶的設計提供很好的工具。但這些方法目前成功的研究案例有限，需要更多的深入細致的研究。

3 融合酶的應用研究進展

融合酶可以把原屬多個不同酶 (或蛋白) 的功能整合到一個酶中，除了能實現(xiàn)酶的多功能化集成外，另一個明顯的優(yōu)勢是可以改變多個酶(結構域) 之間的空間組織關系 (一般指距離和取向)，這在由多個酶依次催化的順序反應(Sequential reactions) 中尤為重要。其中，通過改變多個酶 (結構域) 的空間距離產(chǎn)生協(xié)同效應(空間靠近效應) 的研究案例近年快速增多。多酶空間靠近效應主要可能優(yōu)勢是這種融合酶促進了“底物傳遞”效應，即催化過程中一個反應的產(chǎn)物作為下一反應的底物 (中間產(chǎn)物) 在這兩個催化活性位點之間的直接傳遞，減少了中間產(chǎn)物向體系主體相的擴散，從而增加了中間產(chǎn)物的局部濃度，提高反應效率 (很多反應其 Km值遠大于底物在主體相中的平衡濃度)；底物傳遞也能防止中間產(chǎn)物流向其他競爭反應，或者防止酶的活性位點被其他非目標底物所占據(jù)；兩個活性位點間傳遞時間的縮短也能減少中間產(chǎn)物因自身不穩(wěn)定導致的降解。下面對融合酶在一些實際體系中的應用研究進展進行總結。

3.1 木質纖維素等生物質多糖降解上的應用

地球上每年都會產(chǎn)生數(shù)量驚人的多糖類生物質，如通過植物光合作用每年就能產(chǎn)生多達4×1010t的纖維素，同時其他多糖如木質素、淀粉、木聚糖的生產(chǎn)量也非常大[74]。生物質多糖是一類碳氫化合物，通過一定的加工過程可以轉化成燃料、化工原料、化學品、醫(yī)藥制品等非常有應用價值的一系列產(chǎn)品，因此在石油等不可再生資源日益匱乏的今天，對多糖等生物質的開發(fā)和利用是非常有意義的。然而由于多糖的復雜結構，很難對其直接進行利用，一般只能先對多糖進行必要的預處理，降解成小分子的糖才能加以利用。多糖的降解可以通過物理法、化學法以及生物法實現(xiàn)，但生物法有著其他兩者不可比擬的優(yōu)勢 (如條件溫和，環(huán)境友好，單位能耗低，副產(chǎn)物少等)，能滿足當今社會可持續(xù)發(fā)展的需求，其應用日益廣泛。生物法一般是通過酶的作用對多糖進行降解，由于纖維素等多糖結構的復雜性以及酶作用的專一性，需要多種酶的共同作用才能完成，如纖維素水解需要葡聚糖內(nèi)切酶、葡聚糖外切酶、β-糖苷酶等。與各個酶單獨作用相比，融合酶具有更高的催化效率，這也是自然界中進化的一個方向。An等通過順序融合構建了熱纖梭菌Clostridium thermocellum的木聚糖酶 (Xyn)和菊果膠桿菌Pectobacterium chrysanthemi的纖維素酶 (Cel) 的融合酶，他們發(fā)現(xiàn)當Cel融合在Xyn下游時，兩個酶的活性都能保持，但當Xyn融合在Cel下游時，卻導致了兩者活性的喪失[74]。Lu 等通過構建解淀粉芽胞桿菌 Bacillus amyloliquefaciens的葡聚糖酶和枯草芽胞桿菌Bacillus subtilis的木聚糖酶的融合酶，并在大腸桿菌中成功表達。融合酶同時具有葡聚糖酶和木聚糖酶兩種活性，與單獨表達的酶相比，葡聚糖酶催化效率提高了3.15倍，但木聚糖酶催化效率下降了 31% (kcat/Km)。通過進一步對兩結構域之間的連接肽進行優(yōu)化，Lu等發(fā)現(xiàn)在連接肽為(GGGGS)2時，融合酶的葡聚糖酶和木聚糖酶的催化效率分別提高了326%和43% (與單獨酶相比)[25,31]。這些例子顯示出融合酶在生物質多糖水解上的應用價值以及融合策略的重要性。另外，也可以通過將多糖降解和下游轉化的酶進行融合，提高從多糖生產(chǎn)其他化學品的效率。Wang等構建了兩個 β-淀粉酶 (BA) 和海藻糖合成酶(TS) 的融合酶 (TSBA和BATS)，BA能把淀粉降解成小分子的麥芽糖，后者能被海藻糖合成酶作為底物利用，從而實現(xiàn)一步法從淀粉生產(chǎn)海藻糖。與單酶混合相比，融合酶TSBA和BATS的催化效率分別提高了3.4和2.4倍[15]，顯示出了融合酶技術應用在順序催化反應的優(yōu)勢。

此外，一些在醫(yī)藥和臨床領域上具有重要意義的生物多糖如肝素和硫酸軟骨素等，其降解產(chǎn)生的低分子量產(chǎn)物被證實具有比其降解前的大分子形式更強的藥理活性、更好的療效、更容易被人體吸收等諸多優(yōu)勢，因此低分子量肝素和硫酸軟骨素的生產(chǎn)方法逐漸成為研究的熱點[45,75-76]。其中，酶法降解具有反應條件溫和、清潔、高效、特異性強、安全性高等優(yōu)點，是其他方法所不能比擬的[45,76]。然而降解肝素和硫酸軟骨素所需的肝素酶和硫酸軟骨素酶目前主要從野生菌中分離提取，其產(chǎn)量低、質量不穩(wěn)定、純化難度大、成本高，無法實現(xiàn)酶的高效生產(chǎn)。本研究組利用MBP蛋白具有分子伴侶作用，能促進與之融合的蛋白的可溶表達等特點，構建了肝素酶Ⅰ (HepA) 和MBP的融合酶，成功克服了肝素酶異源表達中容易形成包涵體等問題，首次實現(xiàn)了HepA的高效可溶異源表達[77]。同時，利用MBP的親和吸附特性，HepA能實現(xiàn)便捷、高效的一步純化，大大降低了酶分離提取的難度與成本[6]。進一步，通過構建HepA，MBP和GFP的三重融合蛋白，利用GFP的熒光能快速定量HepA的酶活，從而實現(xiàn)HepA的生產(chǎn)、純化、檢測和催化的過程集成，進一步降低了HepA酶制劑的生產(chǎn)和應用成本[11,45,78-82]。另外，本研究組對肝素酶Ⅱ、Ⅲ，以及硫酸軟骨素酶和MBP的融合蛋白也進行了深入的研究，通過采取構建融合酶的策略，也成功實現(xiàn)了這些酶的高效生產(chǎn)、純化和催化，表明融合酶在肝素、硫酸軟骨素等多糖裂解上具有重要的研究與應用價值[83-84]。

3.2 手性催化-輔酶再生偶聯(lián)體系中的應用

氧化還原酶的一個重要應用是通過其不對稱氧化/還原，從前手性化合物生成相應的手性化合物，這些手性化合物很多是具有商業(yè)價值的醫(yī)藥中間體、工業(yè)有機材料以及農(nóng)用化學品[38,85-86]。大部分氧化還原酶的催化都需要輔酶 (如NADH，NADPH)，然而考慮到輔酶昂貴的價格，要實現(xiàn)經(jīng)濟可行的工業(yè)催化就必須要有高效的原位輔酶再生方法。目前最常用的方法是通過和另外一個氧化還原酶偶聯(lián)，利用廉價的底物對輔酶進行再生[87-88]。通過構建手性催化和輔酶再生的融合酶，可以大大縮短輔酶在兩個催化中心之間傳遞的時間，減少輔酶在體系的擴散和降解，提高其局部有效濃度，從而可以提高手性催化和輔酶再生的效率[89-90]，近年來有不少這方面的相關報道。亞磷酸脫氫酶 (PTDH) 能以廉價的亞磷酸鹽作為底物實現(xiàn) NADPH的再生，Torres Pazmi?o等構建了一系列B-V單加氧酶 (BVMOs)和PTDH的融合酶，在NADP濃度只有5 μmol/L時，仍能實現(xiàn)苯丙酮到乙酸芐酯的有效轉化(79%，3 h)，同時融合后各個酶都能保持天然酶的催化活性，表明了通過融合酶進行手性催化的可行性[90]。H?lsch等構建了甲酸脫氫酶(FDH) 和3-酮?；?ACP還原酶 (KR) 的融合酶進行手性醇生產(chǎn)，與兩個酶混合物相比，初始催化速度提高了 2倍，底物轉化率能達到99.97%，并且具有極高的光學選擇性 (99.9% (S) -1- (pentafuorophenyl) ethanol)[38]。本研究組也曾報道過利用手性醇脫氫酶 (ReADH) 與甲酸脫氫酶 (CbFDH) 構建融合蛋白以高效生產(chǎn)手性芳基醇的研究，并對ReADH和CbFDH的不同融合順序進行了研究和探討。研究結果表明，融合位點和融合順序對于ReADH和CbFDH的活性都有很大影響，其中CbFDH的C端融合會導致活性喪失，而N端融合則對活性沒有顯著影響；ReADH的C端融合和N端融合都能保持一定的活性，但N端融合時活性最高。特別地，當ReADH的C端和CbFDH的N端進行融合時(ReADH-CbFDH)，融合蛋白同時具有兩者的活性，能實現(xiàn)催化與輔酶再生的雙重功能[88]。

3.3 代謝途徑調控中的應用

在利用微生物細胞工廠進行化學品生產(chǎn)中，通過對細胞內(nèi)的代謝流進行有目的的調控，能夠顯著地提高底物的轉化率和目標產(chǎn)物的產(chǎn)量[91-94]。其中，通過構建合成途徑中多個酶的融合酶，可對催化多步反應的酶在細胞內(nèi)的空間組織進行改造 (如使酶相互靠近或調整其相互取向)，這已經(jīng)成為對細胞內(nèi)代謝流進行調控的重要手段[3,89,95-97]。合成途徑上各個酶的空間靠近性 (Enzyme proximity) 對中間產(chǎn)物的流向有著重要的影響，特別是在以下幾種情況中：1) 中間產(chǎn)物有其他競爭反應；2) 中間產(chǎn)物不穩(wěn)定；3) 中間產(chǎn)物對細胞有毒性或者對酶存在反饋抑制；4) 其他非目的底物對酶有競爭[13]。在這些情況中，通過構建融合酶，拉近合成途徑中的兩個 (或多個) 酶的空間距離，減少中間產(chǎn)物的流失，可以有效提高產(chǎn)物的產(chǎn)量、產(chǎn)率和底物轉化率。

Albertsen等在釀酒酵母中引入來自廣藿香Pogostemon cablin的廣藿香醇合成酶 (PTS)，利用酵母細胞內(nèi)產(chǎn)生的法尼基焦磷酸 (FPP) 作為起始物生產(chǎn)廣藿香醇。但因為酵母內(nèi)的FPP會被細胞內(nèi)多個其他代謝途徑競爭，導致流向廣藿香醇生產(chǎn)的FPP通量很少。通過在胞內(nèi)過量表達法尼基焦磷酸合酶 (FPPS) 和PTS的融合酶，能增加FPP流向PTS的通量，從而使得廣藿香醇的產(chǎn)量提高為原來的2倍[13]。

香葉基香葉醇 (GGOH) 是一種昂貴的香水和醫(yī)藥品的原材料，Tokuhiro等為了利用酵母細胞生產(chǎn)GGOH，構建了其合成途徑上的香葉基香葉基焦磷酸合酶 (BTS1) 和甘油二酯焦磷酸磷酸酶 (DPP1) 的融合酶BTS1-DPP1。與同時單獨過表達 BTS1和 DPP1相比，過表達融合酶BTS1-DPP1能更有效地提高細胞內(nèi)GGOH的產(chǎn)量。他們進一步過表達融合酶 BTS1-ERG20 (ERG20為法尼基焦磷酸合酶，是GGOH合成途徑上的另一個關鍵酶)，發(fā)現(xiàn)原來的主產(chǎn)物鯊烯產(chǎn)量從191.9 mg/L下降到6.5 mg/L，而目標產(chǎn)物GGOH則從0.2 mg/L上升到228.8 mg/L。最后，通過同時過表達 HMG1，BTS1-DPP1和 BTS1-ERG20，使得 GGOH產(chǎn)量能進一步達到3.31 g/L[98]。

Zhou等對具有轉化香葉基香葉基焦磷酸(GGPP) 合成丹參酮前體二萜化合物次丹參酮二烯的功能的兩個酶SmCPS和SmKSL進行融合表達，發(fā)現(xiàn)在酶靠近的情況下，合成最終代謝產(chǎn)物的通量更大。進一步，對 SmCPS和 SmKSL融合酶的結構進行了分子模擬，發(fā)現(xiàn)不同融合方式導致催化中心空間距離差異，為解釋代謝途徑的性能提供了理論支持[99]。SmCPS和SmKSL都是多亞基蛋白，該研究開啟了多亞基代謝融合酶在微生物代謝工程中應用的新方向。

這些例子表明，通過構建代謝途徑上的融合酶，是調控途徑通量的有效手段，已經(jīng)成為代謝工程的一個重要工具。同時，結合傳統(tǒng)代謝調控的手段，利用融合酶技術能成為進一步提高產(chǎn)品產(chǎn)量的有力方法[13]。

另外，當目標產(chǎn)物是一種對細胞有毒性的物質時，往往產(chǎn)率很低甚至很難通過微生物細胞進行直接生產(chǎn)。通過構建具有催化產(chǎn)物生成和產(chǎn)物轉化功能的融合酶，可以迅速將產(chǎn)物轉化為毒性較少或者無毒的衍生物，最大限度地減少了產(chǎn)物毒性的影響 (與兩種酶單獨表達相比)，從而提高細胞生產(chǎn)效率。香蘭素是目前工業(yè)過程生產(chǎn)的最重要的芳香化合物之一，在細胞內(nèi)生產(chǎn)香蘭素最大的問題是即使很低濃度的香蘭素都能對細胞產(chǎn)生明顯的毒性。為了減少香蘭素的毒性，Albertsen在細胞內(nèi)過表達氧甲基轉移酶 (OMT，催化香蘭素合成途徑最后一步的酶) 和 UDP-糖基轉移酶 (UGT，對香蘭素進行糖基化修飾以解除毒性) 的融合酶。與同時單獨表達 OMT和 UGT相比，香蘭素的糖基化產(chǎn)物VG在細胞內(nèi)的積累速度明顯加快，香蘭素胞內(nèi)濃度則減少了40%，使得細胞生長速率提高了14%，表明融合酶的手段能有效解除產(chǎn)物 (或中間產(chǎn)物) 的毒性，提高細胞生產(chǎn)效率[100]。

4 結論與展望

隨著分子生物學以及相關技術的發(fā)展，融合酶的構建策略早已打破順序融合的單一局面，并且產(chǎn)生出多元化的發(fā)展趨勢，如連接肽、插入融合、分枝融合等；新的融合策略的出現(xiàn)和發(fā)展，結合各自的優(yōu)勢，擴大了融合酶的應用領域，同時也在原有的應用領域上帶來了新的變革。

縱觀融合酶領域的現(xiàn)狀，融合酶的發(fā)展方向主要集中在兩方面。一是多功能化。具有特殊功能的新酶或者融合伴侶 (多肽或者蛋白) 的發(fā)現(xiàn)，推動融合酶在多功能化方面的發(fā)展，從而使得更加多樣化的功能可以在目標蛋白上實現(xiàn)；另外，對極端微生物資源的開發(fā)和利用，以及蛋白質工程的發(fā)展，有可能給融合酶性能帶來飛躍，使融合酶的應用更加廣泛。二是多結構域化。僅僅通過酶的過量表達已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)不足以使得外源途徑成為細胞的主導途徑，融合酶能通過控制(原本獨立的) 多個酶之間的空間組織，實現(xiàn)代謝途徑的調控 (空間靠近效應)，無論在in vitro還是in vivo體系都具有明顯的優(yōu)勢。然而目前蛋白的融合一般停留在兩個單亞基酶的組合，對途徑調控的復雜性和力度有限，而且也不能滿足對多亞基酶的調控。最近，有一些研究小組開始進行多亞基酶以及多個酶的融合，并取得了重要的成果[62-63, 99, 101]。

雖然相比于天然酶 (單一酶或者多種酶混合)，融合酶的構建能帶來功能上和應用上的眾多優(yōu)勢，但在其構建和應用過程中，往往會出現(xiàn)蛋白不能表達、蛋白不能正確折疊、蛋白不穩(wěn)定以及酶原來的活性受到損失甚至喪失等問題。這些問題的根源在于目前對融合酶各個結構域之間的相互影響及其分子機理還缺乏足夠的認識。通過選擇不同的融合策略能在一定程度上調整結構域之間的空間關系，從而改變?nèi)诤厦阜肿又薪Y構域之間的相互作用情況以解決問題；但這些手段只能實現(xiàn)有限的幾種調整，且不能實現(xiàn)較為精細的調控 (在多結構域的復雜融合體系中尤為重要)。同時，對于融合策略的選擇尚沒有可靠的理論指導，目前只能采取試錯辦法。因此融合酶今后的發(fā)展方向在于兩方面。一方面，可以利用分子動力學模擬對融合酶進行分子設計和機理解析。雖然目前還難以對大分子進行精確的模擬[99]，但隨著算法和計算能力的發(fā)展，其在預測和研究結構域相互作用中將會發(fā)揮越來越重要的作用，為融合酶構建策略提供理論指導。另一方面，連接肽在各種融合方式中都是關鍵元件，且其可變性遠大于酶本身，并能對融合酶性能產(chǎn)生重大影響[40-41]，是融合酶分子設計的重要方面。通過對連接肽進行改造 (連接肽工程，linker engineering)[41]，有望能實現(xiàn)對融合酶結構域之間空間組織關系的精細調控。但其問題的關鍵在于：1) 需要對連接肽性質對結構域空間組織關系的影響進行系統(tǒng)研究。借助圓二色光譜、X射線小角度散射、X射線衍射和NMR等研究立體結構的工具，結合分子動力學模擬，有希望在這方面取得突破，進而實現(xiàn)對連接肽進行理性設計。2) 需要擴展能不同程度、不同方面 (如距離、角度、取向等) 改變結構域空間組織關系的連接肽種類，為理性設計提供豐富的元件和模塊。可以預見，在解決了以上兩個關鍵問題的基礎上，人們能實現(xiàn)連接肽的理性設計，并能實現(xiàn)預期的空間組織結構，這將為融合酶設計，特別是多結構域的復雜融合體系的設計提供強大的支撐作用。

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