李美蓉，汪小波，黃英，黃堅(jiān)麗，梁甲元，黃日波,3，杜麗琴，韋宇拓

1 廣西大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，廣西 南寧 530004

2 亞熱帶農(nóng)業(yè)生物資源保護(hù)與利用國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 南寧 530004

3 廣西科學(xué)院，廣西 南寧 530004

普魯蘭酶 (Pullulanase) (EC3.2.1.41) 是能專(zhuān)一性分解普魯蘭糖 (Pullulan)、淀粉、支鏈淀粉和相應(yīng)的低聚糖中側(cè)支分支點(diǎn)的 α-l,6糖苷鍵的一種異淀粉酶 (或稱(chēng)枝切淀粉酶)，能使支鏈淀粉型多糖的分支鏈脫離主鏈形成一系列鏈長(zhǎng)不一的直鏈淀粉[1]。而最近發(fā)現(xiàn)的新普魯蘭酶兼有糖苷水解酶和糖基轉(zhuǎn)移酶催化活性，能水解α-l,6-和α-l,4-糖苷鍵，是一種多功能水解淀粉酶[2]，將該酶與淀粉酶、糖化酶等配合使用，能加速淀粉充分糖化，提高淀粉質(zhì)原料利用率、降低糧耗，在淀粉加工、制糖工業(yè)及啤酒和酒精生成行業(yè)中有著重要的用途和良好的市場(chǎng)前景。目前國(guó)內(nèi)普魯蘭酶研究?jī)H限于實(shí)驗(yàn)室，所篩選獲得的菌種的性能還遠(yuǎn)不能滿(mǎn)足工業(yè)需求，國(guó)內(nèi)外工業(yè)用普魯蘭酶市場(chǎng)長(zhǎng)期被國(guó)外大公司所壟斷，且價(jià)格昂貴，因此探索獲得優(yōu)良的新型普魯蘭酶基因，為實(shí)現(xiàn)普魯蘭酶國(guó)產(chǎn)化具有重要的意義。本研究從一株產(chǎn)中溫中性普魯蘭酶的菌株 Bacillus cereus GXBC-3 中克隆獲得了pulA、pulB和 pulC 3個(gè)普魯蘭酶基因，利用pSE380表達(dá)系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)了其在大腸桿菌中的表達(dá)，研究分析了重組酶的性質(zhì)，為該酶下一步研究應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑

限制性?xún)?nèi)切酶NcoⅠ、PstⅠ、EcoRⅠ、Prime STAR HS DNA聚合酶、T4 DNA連接酶等購(gòu)自TaKaRa公司；金屬鎳親和層析介質(zhì)購(gòu)自Phamacia公司；麥芽糖、麥芽三糖為色譜純，其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.1.2 菌株和質(zhì)粒

蠟樣芽胞桿菌Bacillus cereus GXBC-3、宿主大腸桿菌Escherichia coli XL10-Gold 菌株和表達(dá)載體pSE380由本實(shí)驗(yàn)室保藏。

1.2 方法

1.2.1 普魯蘭酶基因的克隆

根據(jù) GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中已公布的 Bacillus cereus假定的Ⅰ型和Ⅱ型普魯蘭酶基因序列，并進(jìn)行了信號(hào)肽預(yù)測(cè)，設(shè)計(jì)引物 (表1)，以Bacillus cereus GXBC-3總DNA為模板，用Prime STAR HS DNA聚合酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增目的基因，PCR退火溫度45 ℃，延伸2 min 40 s。

1.2.2 重組質(zhì)粒的構(gòu)建及目的蛋白的表達(dá)和純化

將目的基因連接到表達(dá)載體 pSE380上，經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證后，轉(zhuǎn)化到E. coliXL10-Gold進(jìn)行IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，收集菌體在冰浴條件下超聲波破胞，收集上清，使用金屬鎳親和層析法進(jìn)行純化，利用 SDS-PAGE凝膠電泳來(lái)檢測(cè)純化效果。

1.2.3 酶活的測(cè)定

酶活性的測(cè)定采用 3,5-二硝基水楊酸(DNS) 試劑顯色法[3]，取500 μL不同濃度的葡萄糖溶液，加入500 μL DNS，沸水浴5 min。置于冰上冷卻至室溫后，稀釋3倍，測(cè)可見(jiàn)光OD520值來(lái)繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。酶活的測(cè)定完全依據(jù)制作葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的方法進(jìn)行。酶的活力單位定義為在最適溫度及最適pH條件下，按上述反應(yīng)，每min生成1 μmol還原糖所需的酶量為一個(gè)酶活單位(1 U)。

1.2.4 重組酶含量及比活力測(cè)定

按照《蛋白質(zhì)技術(shù)手冊(cè)》中的Bradford測(cè)定方法[4]來(lái)計(jì)算蛋白質(zhì)濃度。根據(jù)國(guó)際酶學(xué)委員會(huì)規(guī)定比活力=活力U/mg蛋白。

1.2.5 HPLC分析條件

色譜柱：lltima Amino 100A 5u柱 (4.6 mm× 250 mm)；檢測(cè)器：Alltech 2000ES型蒸發(fā)光散射檢測(cè)器；流動(dòng)相∶水相=65∶35；流速：1 mL/min；柱溫：28 ℃。

表1 普魯蘭基因引物序列Table 1 Primer sequences of pullulanase genes

2 結(jié)果與分析

2.1 普魯蘭酶基因的克隆

取5 μL PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果如圖1所示，泳道1、2、3分別為基因pulA (2 124 bp)、pulB (2 478 bp) 和pulC (2 484 bp)。在Signal IP和TMpred serve進(jìn)行進(jìn)行信號(hào)肽和疏水跨膜區(qū)預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)3個(gè)基因均無(wú)信號(hào)肽，為胞內(nèi)分泌表達(dá)。

圖1 瓊脂糖凝膠電泳分析普魯蘭酶基因 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物Fig. 1 PCR product of pullulanases gene. M: W2003 DNA marker; 1: pulA; 2: pulB; 3: pulC.

2.2 普魯蘭酶基因的表達(dá)與純化

將構(gòu)建好的基因工程菌按 2%接種量于 LB (含100 mg/L的Amp) 中，37 ℃搖瓶培養(yǎng)至菌體濃度 OD600約 0.6，用終濃度為 0.5 mmol/L的IPTG于37 ℃搖床誘導(dǎo)表達(dá)10 h后，收集菌體、破胞、收集上清，用金屬鎳親和層析法純化目的蛋白，取 20 μL蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳。結(jié)果如圖2所示，圖中泳道 3、5、7分別表示為純化重組普魯蘭酶PulA、PulB和 PulC，其蛋白表達(dá)量和相對(duì)分子量見(jiàn)表2。

2.3 重組酶酶學(xué)性質(zhì)研究

2.3.1 重組酶底物特異性分析

用pH 7.0的磷酸鹽緩沖液配制1%濃度的不同底物溶液與重組酶反應(yīng)，測(cè)繪底物-相對(duì)酶活力的曲線(xiàn)，分析重組酶底物特異性。比較重組酶PulA、PulB和PulC對(duì)不同底物相對(duì)水解速度，可得3種酶的最適底物均為普魯蘭糖，經(jīng)HPLC分析只產(chǎn)生麥芽三糖；重組酶PulA還可水解可溶性淀粉產(chǎn)生麥芽糖和麥芽三糖的混合物；而重組酶PulB和PulC不水解可溶性淀粉。綜上可得，重組酶PulA能水解α-l,6-和α-l,4-糖苷鍵，為Ⅱ型普魯蘭酶；重組酶PulB和PulC只水解α-l,6-糖苷鍵，為Ⅰ型普魯蘭酶。

圖2 純化后的重組普魯蘭酶SDS-PAGE分析Fig. 2 SDS-PAGE analysis of the purified reconbinant pullulanases. M: standard protein maker; 1: reconbinant E. coli XL10-Goldcontaining pSE380; 2: reconbinant E. coli XL10-Gold containing pSE380-pulA; 3: recombinant pullulanase PulA purified on nickel column; 4: reconbinant E. coli XL10-Gold containing pSE380-pulB; 5: recombinant pullulanase PulB purified on nickel column; 6: reconbinant E. coli XL10-Gold containing pSE380-pulC; 7: recombinant pullulanase PulC purified on nickel column.

2.3.2 重組酶最適溫度及熱穩(wěn)定性

取50 μL稀釋酶液與450 μL 1%普魯蘭糖/可溶性淀粉溶液在15 ℃~70 ℃下每隔5 ℃反應(yīng)10 min后測(cè)定酶活，以酶活最高者作為100%，繪制溫度-酶活力的影響曲線(xiàn)。重組酶PulA的普魯蘭酶和淀粉酶 (Amy A) 最適溫度分別為40 ℃、50 ℃，重組普魯蘭酶PulB和PulC的最適溫度均為45 ℃ (圖3)。

圖3 重組酶的最適溫度Fig. 3 Optimal temperature of recombinant enzymes.

在各溫度梯度下，將稀釋酶液分別保溫處理30 min，于最適溫度下反應(yīng)10 min后測(cè)定殘余酶活力，以未保溫處理的酶活為100%，繪制溫度-相對(duì)殘余酶活力曲線(xiàn)。低于40 ℃時(shí)，3種重組酶相對(duì)殘余活力均高于80%，熱穩(wěn)定性較好；高于40 ℃時(shí)，3種重組酶相對(duì)殘余活力均急劇下降，熱穩(wěn)定性差 (圖4)。

2.3.3 重組酶最適pH及pH穩(wěn)定性

取50 μL稀釋酶液與450 μL 1%的普魯蘭糖/可溶性淀粉溶液在pH 4.5~9.0內(nèi)，每隔0.5個(gè)梯度，于最適溫度反應(yīng)10 min后測(cè)定酶活，以酶活最高者作為100%，繪制pH-酶活力的影響曲線(xiàn)。重組酶 PulA的普魯蘭酶和淀粉酶 (AmyA)最適pH分別為6.5、7.0，重組酶PulB和PulC的普魯蘭酶最適pH分別為7.0、6.5 (圖5)。

用不同pH緩沖液稀釋純化重組酶，于4 ℃處理4 h，于最適條件下反應(yīng)測(cè)定殘余酶活力，以未經(jīng)酸處理的酶活為100%，繪制pH-相對(duì)殘余酶活力曲線(xiàn)。3種重組酶在pH 5.5~8.0范圍內(nèi)相對(duì)殘余活力較高，pH穩(wěn)定性較好，其中適度的pH條件對(duì)PulC有較弱激活作用 (圖6)。

圖4 重組酶的熱穩(wěn)定性Fig. 4 Thermal stability of recombinant enzymes.

圖5 重組酶的最適pHFig. 5 Optimal pH of recombinant enzymes.

2.3.4 Ca2+對(duì)重組酶熱穩(wěn)定性的影響

將Ca2+終濃度分別為0~10 mmol/L的稀釋酶液液于4 ℃處理12 h，于40 ℃保溫30 min，在最適條件下反應(yīng)后測(cè)繪 Ca2+濃度-相對(duì)酶活力曲線(xiàn)。在2~10 mmol/L范圍內(nèi)，Ca2+對(duì)重組酶PulA、PulC普魯蘭酶熱穩(wěn)定性有較明顯抑制作用；在0~10 mmol/L范圍內(nèi)，Ca2+對(duì)重組酶PulA淀粉酶(AmyA) 與 PulB普魯蘭酶熱穩(wěn)定性有較明顯激活作用，且分別在2、4 mmol/L時(shí)激活作用最強(qiáng)(圖7)。

圖7 Ca2+對(duì)重組酶熱穩(wěn)定性的影響Fig. 7 Effect of Ca2+ on thermal stability of recombinant enzymes.

2.3.5 EDTA對(duì)重組酶活性的影響

將EDTA終濃度分別為0~500 mmol/L的稀釋酶液于4 ℃處理12 h，在最適條件下與底物反應(yīng)后分別測(cè)繪EDTA濃度-相對(duì)酶活力曲線(xiàn)。在10~40 mmol/L內(nèi)對(duì)重組酶PulA普魯蘭酶活性有較顯著激活作用，且激活作用隨EDTA濃度增大而減弱；在50~500 mmol/L內(nèi)對(duì)重組酶PulA普魯蘭酶活性有較顯著抑制作用，且抑制作用隨其濃度增大而增強(qiáng)。在50~500 mmol/L內(nèi)對(duì)重組酶PulB普魯蘭酶活性有較顯著抑制作用，且抑制作用隨其濃度增大而增強(qiáng)。在10~500 mmol/L內(nèi)對(duì)重組酶 PulB普魯蘭酶活性有顯著抑制作用，且抑制作用隨濃度增大而增強(qiáng)。在10~500 mmol/L內(nèi)對(duì)重組酶PulA淀粉酶 (AmyA) 活性有較顯著抑制作用，且其抑制作用隨濃度增大無(wú)明顯改變(圖8)。

2.3.6 金屬離子對(duì)重組酶活性的影響

用終濃度為2 mmol/L的不同金屬氯化物稀釋酶液，于4 ℃處理12 h，在最適條件下與底物反應(yīng)后分別測(cè)繪金屬離子-相對(duì)酶活力曲線(xiàn)。Mg2+、Mn2+對(duì)重組酶PulA普魯蘭酶活性有顯著激活作用，而Cu2+、Zn2+、Fe2+對(duì)其有顯著抑制作用；Cu2+、Zn2+、Mg2+、Mn2+、Ba2+對(duì)重組酶PulB普魯蘭酶活性有顯著激活作用，而 Fe2+對(duì)其有顯著抑制作用；Zn2+、Mg2+、Mn2+、Ba2+對(duì)重組酶 PulC普魯蘭酶活性有顯著激活作用，而Ca2+、Cu2+、Fe2+、Fe3+對(duì)其有顯著抑制作用；Ca2+、Mg2+、Ba2+、 Fe3+對(duì)重組酶PulA淀粉酶(AmyA) 活性有顯著激活作用，而Zn2+對(duì)其有微弱抑制作用 (圖9)。

圖8 EDTA對(duì)重組酶活性的影響Fig. 8 Effect of EDTA on recombinant enzyme activities.

圖9 金屬離子對(duì)重組酶活性的影響Fig. 9 Effect of metal ions on recombinant enzyme activities.

2.4 重組酶比活力及Km、Vmax測(cè)定

按照1.2.4方法測(cè)定各重組酶比活力。在最適條件下取不同濃度的普魯蘭糖/可溶性淀粉[S]，測(cè)得反應(yīng)速度V，計(jì)算出1/V與1/[S]，通過(guò)Lineweaver-Burk雙倒數(shù)作圖法求得各重組酶對(duì)普魯蘭糖/可溶性淀粉的Km值和Vmax，結(jié)果見(jiàn)表2。

3 討論

普魯蘭酶根據(jù)對(duì)底物的特異性一般可分為Ⅰ型和Ⅱ型普魯蘭酶，Ⅰ型普魯蘭酶又稱(chēng)脫支酶，特異性水解α-1,6-糖苷鍵，形成麥芽三糖和線(xiàn)性的以α-1,4-糖苷鍵連接的多聚物；Ⅱ型普魯蘭酶又稱(chēng)amylo-pullulanse，既能水解α-1,6-糖苷鍵，又能水解α-1,4-糖苷鍵。不同來(lái)源的普魯蘭酶的分子量有很大差異，從76~150 kDa不等；但它們都含有幾個(gè)保守區(qū)，包括細(xì)菌普魯蘭酶相關(guān)區(qū)域、普魯蘭酶N-端區(qū)域及α-淀粉酶亞家族等，使之形成特定的空間結(jié)構(gòu)以行使其水解功能[5]。本研究首次實(shí)現(xiàn)了在同一株Bacillus cereus GXBC-3中克隆并成功表達(dá)了3個(gè)、兩種不同類(lèi)型的普魯蘭酶基因pulA、pulB和pulC。其中pulA為Ⅱ型普魯蘭酶基因，其表達(dá)的酶PulA能同時(shí)水解α-l,6-和α-l,4-糖苷鍵，它可能與來(lái)源于環(huán)狀芽胞桿菌Bacillus circulans F-2的Ⅱ型普魯蘭酶相似，其酶中心結(jié)構(gòu)域含兩個(gè)不同活性位點(diǎn)[6]。pulB和pulC為Ⅰ型普魯蘭酶基因，其表達(dá)的酶PulB和PulC只水解α-l,6-糖苷鍵。目前發(fā)現(xiàn)的大多數(shù)普魯蘭酶比活力較低，如比較來(lái)源其他Bacillus cereus的普魯蘭酶性質(zhì)見(jiàn)表3[7-9]，這些普魯蘭酶活力較低；其他如來(lái)源環(huán)狀芽胞桿菌Bacillus circulans F-2[6]、 嗜 堿 芽 胞 桿 菌alkalophilic Bacillus sp. KSM-1378[10]和嗜熱芽胞桿菌thermophilic Bacillus sp. AN-7[11]的Ⅱ型普魯蘭酶比活力分別為133.6 U/mg、83.1 U/mg和151.5 U/mg。而本研究中Ⅱ型普魯蘭酶 PulB和PulC的比活力均接近230 U/mg，明顯優(yōu)于其他同類(lèi)研究中發(fā)現(xiàn)的Ⅱ型普魯蘭酶。

將3個(gè)普魯蘭酶在SMART serve進(jìn)行功能結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)分析，發(fā)現(xiàn)其均隸屬于淀粉酶13家族 (GH 13) 普魯蘭酶亞科，除含中心結(jié)構(gòu)域Aamy外，均含一具脫枝功能的N端結(jié)構(gòu)域pfmCBM-48；而普魯蘭酶PulB和PulC還含一普魯蘭糖-蛋白互作N端結(jié)構(gòu)域Pfm PUD，具有普魯蘭糖綁定功能，與底物特異性有關(guān)。Martin Machovi?和?tefan Jane?ek研究表明，最近新建立的GH13普魯蘭酶亞科CBMs家族同時(shí)具有α-淀粉酶、普魯蘭酶活性，或單具普魯蘭酶活性；而且所有這些酶均是多域蛋白質(zhì)，至少具有一個(gè)代表酶的特異性的結(jié)構(gòu)域[12]。推測(cè)在具有Aamy和pfm CBM-48而無(wú)pfm PUD時(shí)，普魯蘭酶不單只與普魯蘭糖綁定，水解 α-l,6-糖苷鍵；還可作用于可溶性淀粉，水解 α-l,4-糖苷鍵。而在同時(shí)具有Aamy、pfm CB M-48和pfm PUD時(shí)，普魯蘭酶只與普魯蘭糖綁定，水解α-l,6-糖苷鍵。另外普魯蘭酶 PulC還含有一個(gè)與酶熱穩(wěn)定性有關(guān)的C端結(jié)構(gòu)域pfm Alpha-amyC。Kim等刪除來(lái)源植物乳桿菌 Lacto-bacillus plantarum L137的amylo-pullulanase的結(jié)構(gòu)域C，酶活力雖然減弱，但pH穩(wěn)定性、熱穩(wěn)定性和對(duì)底物親和力都明顯增強(qiáng)[13]。而Lin等發(fā)現(xiàn)把來(lái)源嗜熱厭氧乙醇桿菌Thermoanaerobacter ethanolicus 39E的普魯蘭酶C-端的100個(gè)氨基酸殘基刪除，酶的空間結(jié)構(gòu)和酶活性沒(méi)有變化[14]。所以不同普魯蘭酶的C端結(jié)構(gòu)域的功能還不能確定，需要進(jìn)一步研究。

表2 重組酶活力測(cè)定Table 2 Activities of recombinant enzymes

表3 其他Bacillus cereus的普魯蘭酶性質(zhì)Table 3 Pullulanase properties from other Bacillus cereus

相信隨著更多的Ⅰ、Ⅱ型普魯蘭酶的發(fā)現(xiàn)[15-16]，和其分子結(jié)構(gòu)和結(jié)構(gòu)域功能的深入研究，就可以通過(guò)表達(dá)系統(tǒng)的優(yōu)化和對(duì)普魯蘭酶進(jìn)行分子改造，提高酶表達(dá)量，增強(qiáng)酶活力，改造酶的底物特異性和溫度、pH耐受性，使酶學(xué)特性更適合工業(yè)應(yīng)用。

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