姜濤 姜峰奇 金日明 朱躍坤 朱安龍 樸大勛

（哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬一院結(jié)直腸外科 黑龍江哈爾濱 150001）

腸道屏障功能已成為判斷危重患者預(yù)后的一個(gè)重要指標(biāo)，對腸道屏障功能的研究已成為當(dāng)今醫(yī)學(xué)領(lǐng)域研究的一個(gè)重要課題 。腸道不僅是消化吸收器官，腸黏膜本身也是一道十分重要的防御屏障［1］。20世紀(jì)60年代Ravin等首先提出胃腸道是無明確感染灶患者多器官功能衰竭前發(fā)生膿毒癥的潛在致病源。20世紀(jì)80年代Border等進(jìn)一步提出腸源膿毒血癥（GOS）的概念。臨床上死于膿毒癥的多器官功能不全綜合征（MODS）患者30%找不到感染灶，但經(jīng)血培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)血中存在與腸道常駐菌相似的細(xì)菌。已有研究證明腸道在全身炎癥反應(yīng)綜合征（SIRS）、膿毒癥、多器官功能不全綜合征的連續(xù)發(fā)生發(fā)展中起重要作用，因此人們認(rèn)為腸道不僅是MODS的靶器官，更是MODS的啟動(dòng)者［2］。隨著人民生活水平的提高及飲食結(jié)構(gòu)的改變，結(jié)腸癌比例亦逐漸增多，通過實(shí)驗(yàn)分析不同營養(yǎng)素對腸道屏障功能的影響情況全面揭示PPARa通路的形成與腸道屏障功能的內(nèi)在聯(lián)系，并且在臨床可以解釋不同飲食對腸道屏障的影響并給予指導(dǎo)應(yīng)用。本實(shí)驗(yàn)的研究方向目前在國內(nèi)處于領(lǐng)先，為今后腸道屏障功能研究開辟了一條新的思路。

1 資料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 50只哈爾濱醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室培育的wistar雄性大鼠，體重約在124～150g。將50只wistar雄性大鼠在本實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)7d（恒溫恒濕，標(biāo)準(zhǔn)鼠食喂養(yǎng)）后隨機(jī)分為三組，對照組、靜脈營養(yǎng)組、腸內(nèi)營養(yǎng)組，每組為13只。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分籠飼養(yǎng)于20±2℃明暗各12h的清潔級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室內(nèi)，自由飲水與進(jìn)食3周。

1.2 試劑及儀器 兔抗PPARa抗體（哈爾濱杰恩來舶科技有限公司）、DBA顯色試劑盒，乳酸測定試劑盒，PBS，4%甲醛（哈爾濱醫(yī)科大學(xué)），普通飼料，（哈爾濱醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室），高脂腸內(nèi)營養(yǎng)飼料能全力（紐迪希亞制藥無錫有限公司），5%水合氯醛，肝素。

石蠟切片機(jī)（Leitz，德國），微量加樣器。p 1-20（Eppendorf，德國），微波爐（格蘭仕，廣東），電熱恒溫箱（SC-505，浙江），PHS-25型酸度計(jì)（上海），BHZ型雙筒顯微鏡（Olympus，日本），數(shù)碼醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)軟件，多聚乙烯導(dǎo)管，金屬彈簧管，注射泵。

1.3 營養(yǎng)液配制 靜脈營養(yǎng)組以50%葡萄糖、10.3% 復(fù)方支鏈氨基酸和20%脂肪乳劑為基本液體，腸內(nèi)營養(yǎng)組以能全力（每2092KJ溶液含蛋白質(zhì)Protein 20g，脂肪Fat 19.5g，碳水化合物Carbohydrate61.5g，膳食纖維Fibre7.5g，礦物質(zhì) Minerals 2.5g，維生素Vits 150mg）腸內(nèi)營養(yǎng)制劑為基本液體，加入一定量的50% 葡萄糖，使二組營養(yǎng)液的熱量及含氮量符合標(biāo)準(zhǔn)。

1.4 營養(yǎng)輸注方法 靜脈營養(yǎng)組：將大鼠一側(cè)頸部去毛消毒、解剖，分離出頸內(nèi)靜脈長約10mm，遠(yuǎn)心端結(jié)扎，切一個(gè)小口，立即將充滿肝素（25U／m L）等滲鹽水的多聚乙烯導(dǎo)管置入頸內(nèi)靜脈至上腔靜脈，結(jié)扎固定，導(dǎo)管經(jīng)皮下隧道從頸背部引出，外套金屬背心彈簧管保護(hù)，縫合切口。將大鼠置于代謝籠內(nèi)，導(dǎo)管與籠外的微量注射泵相連接，大鼠清醒后可在籠內(nèi)自由活動(dòng) 。

腸內(nèi)營養(yǎng)組：能全力。

對照組：普通飼養(yǎng)。

1.5 腸道缺血－再灌注動(dòng)物模型建立及標(biāo)本采集5%水合氯醛按2.5m L／kg腹腔內(nèi)注射麻醉，無菌條件下，腹部正中切口進(jìn)腹，在腹膜后右腎上方找出腸系膜上動(dòng)脈，肝素（100U／100g）靜脈注射，3min后夾閉腸系膜上動(dòng)脈，觀察2min待腸壁蒼白，血搏動(dòng)消失，放回腹腔。1h后恢復(fù)血供，此時(shí)腸壁變紅潤，血管出現(xiàn)搏動(dòng)，再灌注后取回腸組織作病理學(xué)檢查。

1.6 普通光鏡檢測（包括結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)） 距回盲瓣5cm處，切取一段3cm長的回腸，石蠟包埋切片，HE染色。觀察腸壁粘膜上皮結(jié)構(gòu)，有無充血、壞死及異常淋巴細(xì)胞浸潤等。每張切片用半自動(dòng)圖像分析儀隨機(jī)檢測絨毛高度、黏膜厚度、隱窩深度及絨毛表面積測量（絨毛表面積＝2πrh，r為絨毛的半徑，h為絨毛的高度），取平均值 。

1.7 免疫組化步驟 ①載玻片防脫片處理。選用APES，撈片后置烤箱60℃60min以使切片緊密粘附。②切片常規(guī)脫蠟至水。③熱修復(fù)抗原。將切片浸入0.01M枸櫞酸鹽緩沖液（p H6.0），微波爐加熱至沸騰后斷電，間隔10min后，反復(fù)2次。冷卻后PBS（p H 7.2～7.6）洗滌2次。④30%H2O21份加蒸餾水10份混合，室溫10min滅活內(nèi)源性酶。蒸餾水洗3次。⑤滴加5%BSA封閉液，室溫20min。甩去多余液體，不洗。⑥滴加適當(dāng)稀釋的一抗（兔IgG，1：50），4℃過夜。PBS（p H7.2～7.6）洗2min×3次。⑦滴加生物素化山羊抗兔IgG，37℃30min。PBS（p H7.2～7.6）洗2min×3次。⑧滴加試劑SABC，37℃25min。PBS（p H7.2～7.6）洗5min×4次。⑨DAB顯色：使用DAB顯色試劑盒（AR1022）。取1m L蒸餾水，加試劑盒中A、B、C試劑各1滴，混勻后加至切片。室溫顯色，鏡下控制反應(yīng)時(shí)間5min，蒸餾水洗滌。⑩蘇木素輕度復(fù)染，蒸餾水洗滌，酒精梯度脫水，二甲苯透明后，中型樹膠封片。顯微鏡觀察?！?1利用顯微攝影器材對染色切片進(jìn)行拍攝?！?2每批染色以PBS溶液代替一抗做空白對照，以排除假陽性結(jié)果。用已知陽性切片做為陽性對照，以排除假陰性結(jié)果。陽性切片是在預(yù)實(shí)驗(yàn)中反復(fù)染色一些組織切片，它的陽性染色為棕黃色斑塊樣，陽性表達(dá)的部位與抗原理論上應(yīng)在的位置一致，并且反復(fù)染色的切片陽性反應(yīng)無變化，非特異反應(yīng)小的組織切片。

1.8 D-乳酸測定 采用改良的酶學(xué)分光光度循環(huán)D2乳酸法檢測（試劑采用Randox公司乳酸測定試劑盒）。

1.9 光鏡下根據(jù)Chiu腸黏膜損傷評分方法對小腸黏膜損傷進(jìn)行分級(jí) Chiu分度標(biāo)準(zhǔn)：0度，正常絨毛；Ⅰ度，絨毛頂端下間歇增寬；Ⅱ度，絨毛頂端上皮脫落、破潰；Ⅲ度，絨毛頂端破壞擴(kuò)展到基底部；Ⅳ度，上皮完全脫落；Ⅴ度，固有膜崩潰，出現(xiàn)潰瘍及出血點(diǎn)。

1.10 腸黏膜PPARa蛋白的表達(dá) 取末端回腸和結(jié)腸組織冰凍切片，采用常規(guī)免疫組化SP法染色檢測腸黏膜PPARa蛋白的表達(dá)。山羊抗小鼠PPARa蛋白抗體1∶200，PBS代替一抗作為陰性對照。使用HPIAS1000高清晰度彩色圖文病理報(bào)告分析系統(tǒng)，在相同放大倍數(shù)下，于各組每張切片中隨機(jī)選5個(gè)視野，光密度法測定每視野相應(yīng)細(xì)胞PPARa蛋白密度，以陽性顯色面積占測量窗內(nèi)百分比作為半定量指標(biāo)。

1.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 所有數(shù)據(jù)均采用spss13.0統(tǒng)計(jì)軟件分析軟件進(jìn)行處理，計(jì)量資料采用單因素方差分析。P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 三組觀察指標(biāo)的比較 見表1。

表1 三組觀察指標(biāo)的比較（X±SD）

三組絨毛膜表面積組間比較P＜0.01，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。三組D-乳酸組間比較P＜0.01，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。三組PPARa蛋白面積組間比較P＜0.01，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1顯示，腸內(nèi)營養(yǎng)組絨毛表面積顯著高于對照組和靜脈營養(yǎng)組，腸內(nèi)營養(yǎng)組D－乳酸顯著低于對照組和靜脈營養(yǎng)組，腸內(nèi)營養(yǎng)組PPARa蛋白表達(dá)的面積顯著高于對照組和靜脈營養(yǎng)組，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

3 討 論

腸道屏障由腸上皮細(xì)胞層、黏液層、腸道正常菌群、腸道免疫系統(tǒng)、腸－肝軸等組成。具有機(jī)械屏障、化學(xué)屏障、微生物屏障、免疫屏障等功能。前3種功能屬機(jī)體固有免疫功能，后者則屬機(jī)體的適應(yīng)性免疫范疇。這些功能具有相對特有的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)和不同的分子調(diào)控機(jī)制，同時(shí)又通過一定的信號(hào)通路有機(jī)結(jié)合在一起，共同防御腸道內(nèi)細(xì)菌和內(nèi)毒素易位，以及外來抗原物質(zhì)對機(jī)體的侵襲。造成腸黏膜組織結(jié)構(gòu)損傷的因素很多，諸如炎性腸道疾病、放療、化療及某些藥物等；而嚴(yán)重創(chuàng)傷、感染、燒傷和休克等應(yīng)激可使腸黏膜組織缺血、缺氧，腸黏膜結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，腸黏膜通透性增加致血漿中D-乳酸及腸黏膜中的PPARa蛋白表達(dá)改變。

本實(shí)驗(yàn)通過對大鼠的缺血再灌注模型建立，觀察在光鏡下腸黏膜及血漿中D－乳酸水平，腸黏膜的PPARa蛋白表達(dá)，結(jié)果顯示三組絨毛膜表面積組間比較差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。腸內(nèi)營養(yǎng)組黏膜形態(tài)明顯好于靜脈營養(yǎng)組，標(biāo)明腸內(nèi)營養(yǎng)對腸屏障功能的保護(hù)作用，而靜脈營養(yǎng)則易損傷腸道屏障功能（見圖1）。因此，可以認(rèn)為腸內(nèi)營養(yǎng)對腸道缺血再灌注有更好的保護(hù)作用。腸內(nèi)營養(yǎng)更符合生理要求，進(jìn)行胃腸內(nèi)營養(yǎng)時(shí)，食物刺激胃腸道相關(guān)細(xì)胞分泌各種激素參與腸道的適應(yīng)性變化，激活腸道神經(jīng)內(nèi)分泌軸，調(diào)節(jié)胃、膽、胰腺分泌，促進(jìn)胃腸蠕動(dòng)和黏膜生長，促進(jìn)胃腸正常菌叢的平衡，并對維持腸壁免疫組織及S-Ig A的生成有重要作用。消化道術(shù)后患者不僅可耐受早期腸內(nèi)營養(yǎng)，而且腸內(nèi)營養(yǎng)還能促進(jìn)腸蠕動(dòng)功能的恢復(fù)，表現(xiàn)為肛門恢復(fù)排氣的時(shí)間明顯提前，個(gè)別患者在早期腸內(nèi)營養(yǎng)后可出現(xiàn)腹脹、嘔吐等癥狀，主要發(fā)生在腸內(nèi)營養(yǎng)的早期。因此，我們體會(huì)應(yīng)該循序漸進(jìn)，腸內(nèi)營養(yǎng)量由少到多，速度由慢到快，經(jīng)1～2d過度到全量。

三組D-乳酸組間比較差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。靜脈營養(yǎng)組比腸內(nèi)營養(yǎng)組D－乳酸水平高，所以靜脈營養(yǎng)組在應(yīng)激狀態(tài)下腸黏膜通透性比腸內(nèi)營養(yǎng)組的通透性高，導(dǎo)致細(xì)菌代謝產(chǎn)物吸收增加。在機(jī)體發(fā)生嚴(yán)重創(chuàng)傷休克，腸道發(fā)生缺血等損傷時(shí)，一方面腸道內(nèi)細(xì)菌大量繁殖，發(fā)酵產(chǎn)生大量代謝終產(chǎn)物，D-乳酸含量明顯增加；另一方面，腸絨毛頂端上皮脫落，腸黏膜通透性增加。兩方面作用使得大量D-乳酸進(jìn)入血循環(huán)，在外周血中可見D-乳酸水平升高。故監(jiān)測血中D－乳酸水平可及時(shí)反映腸黏膜損害程度和通透性變化及腸缺血的標(biāo)記物。建立大鼠腸缺血再灌注模型發(fā)現(xiàn)D－乳酸升高水平與小腸黏膜損害程度密切相關(guān)。

腸內(nèi)營養(yǎng)組，PPARa蛋白主要沿腸黏膜上皮細(xì)胞膜的頂端分布，表達(dá)呈棕褐色線狀信號(hào)，但與對照組比較，可見部分棕褐色陽性信號(hào)有所減弱。而腸外營養(yǎng)組腸黏膜細(xì)胞陽性表達(dá)數(shù)明顯減少（見圖2）。三組PPARa蛋白面積組間比較差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。腸內(nèi)營養(yǎng)組PPARa蛋白表達(dá)面積顯著高于靜脈營養(yǎng)組。本研究結(jié)果顯示，腸內(nèi)營養(yǎng)組的PPARa蛋白表達(dá)水平明顯高于腸外營養(yǎng)組，電鏡下觀察也證實(shí)腸內(nèi)營養(yǎng)組大鼠腸道黏膜形態(tài)良好、緊密連接完整從而表明高脂腸內(nèi)營養(yǎng)劑與PPARa蛋白密切相關(guān)，并促進(jìn)腸屏障功能的恢復(fù)，反映了腸道屏障的維持與恢復(fù)程度，具有可靠的說服力。但其中的具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

全腸外營養(yǎng)應(yīng)用于臨床后，在很大程度上改善了腸道不能消化吸收營養(yǎng)的問題。遺憾的是長期腸外營養(yǎng)的患者可出現(xiàn)某些并發(fā)癥，不能供給腸黏膜營養(yǎng)、不能維持腸黏膜屏障尤為其主要缺點(diǎn)。而腸內(nèi)營養(yǎng)不但有供給營養(yǎng)的作用，且能改善腸黏膜的屏障功能，這是單純腸外營養(yǎng)所不能比擬的。

綜上所述，接受腸內(nèi)營養(yǎng)組的大鼠，其腸道黏膜上皮細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)、完整性明顯優(yōu)于腸外營養(yǎng)組，而且與對照組無明顯差異，表明經(jīng)腸道內(nèi)給予營養(yǎng)素有助于維護(hù)應(yīng)激狀態(tài)下腸道黏膜結(jié)構(gòu)。腸內(nèi)營養(yǎng)可能通過維護(hù)應(yīng)激狀態(tài)下腸黏膜完整性從而減少腸道細(xì)菌移位的發(fā)生，進(jìn)而減少內(nèi)源性感染的發(fā)生。提示腸內(nèi)營養(yǎng)在維持腸道黏膜屏障、改善微生態(tài)環(huán)境和維護(hù)機(jī)體細(xì)胞免疫功能方面具有積極作用。

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