聶祝青 田小林 朱小寶

（桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院胃腸外科 廣西桂林 541001）

結(jié)直腸癌是常見惡性腫瘤，發(fā)病率以平均每年4.2%的速度上升［1］。研究發(fā)現(xiàn)，凋亡抑制蛋白家族成員中，survivin是最強(qiáng)的凋亡抑制因子［2］，其選擇性表達(dá)于癌組織中，且在正常組織中幾乎不表達(dá)［3］。國內(nèi)外針對此因子與結(jié)直腸癌物學(xué)特性及臨床特點(diǎn)之間的關(guān)系的研究較多，絕大部分是運(yùn)用免疫組織化學(xué)方法，其結(jié)論尚不一致。本次實(shí)驗(yàn)旨在通過檢測survivin m RNA在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)情況，探討其與結(jié)直腸癌發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 一般資料 標(biāo)本取自2010年6月至2011年6月在桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院住院行根治性手術(shù)的60例原發(fā)性結(jié)直腸癌患者，所有標(biāo)本均有明確的病理診斷結(jié)果，術(shù)前均未經(jīng)化療、放療或免疫治療。其中男27例，女33例；結(jié)腸癌35例，直腸癌25例；低分化癌24例，中高分化癌36例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移29例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移31例；Dukes A期12例，B期19例，C期26例，D期3例。并取40例患者癌旁正常組織（距腫瘤邊緣10cm以上）各1塊。取下組織后用DEPC水處理，并立即置于液氮中冷凍，再轉(zhuǎn)移至－80℃低溫冰箱中保存。

1.2 試劑 RNA提取試劑盒和反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自北京艾德萊生物科技有限公司，RT-PCR檢測試劑盒購自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司。

1.3 引物的設(shè)計(jì)及合成 參見表1。

表1 引物序列

1.4 總RNA的提取 從－80℃冰箱取出組織，約50mg，在液氮中快速研磨成粉末狀，再轉(zhuǎn)移至EP管中，按RNA抽提試劑盒說明抽提總RNA。取部分RNA測定OD值，檢測其濃度。并行RNA瓊脂糖凝膠電泳，以檢測RNA純度及完整性。100例標(biāo)本經(jīng)檢測后，OD值均在1.8以上。可以進(jìn)行下步實(shí)驗(yàn)。

1.5 cDNA合成 取1ug總RNA，以 Oligo（d T）18為引物，按反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明在TUREEscript HRTase作用下合成cDNA。

1.6 survivin基因及β-actin的擴(kuò)增 參見表2。

表2 survivin擴(kuò)增條件

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件對結(jié)果進(jìn)行方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 結(jié)直腸癌組織與正常組織survivin m RNA表達(dá)情況 將擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖電泳，經(jīng)熒光成像系統(tǒng)分析。結(jié)果現(xiàn)示：60例結(jié)直腸癌標(biāo)本中，survivin mRNA陽性表達(dá)58例，陽性率為96.7%，而癌旁正常組織標(biāo)本中幾乎不表達(dá)，癌組織表達(dá)水平較正常組織明顯升高，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（見表3）。所有標(biāo)本中，β-actin均穩(wěn)定表達(dá)（見圖1）。

表3 結(jié)直腸癌組織與正常組織survivin mRNA表達(dá)

圖1 正常組織及癌組織survivin m RNA PCR電泳結(jié)果

2.2 survivin基因表達(dá)與結(jié)直腸癌臨床病理特征的相關(guān)性 經(jīng)統(tǒng)計(jì)軟件spss17.0統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果顯示：結(jié)直腸癌組織中survivin基因的表達(dá)與患者性別、腫瘤大小、腫瘤部位及組織學(xué)分化程度均無明顯相關(guān)性（P＞0.05），而與Dukes分期及有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)（P＜0.05，見表4）。

表4 結(jié)直腸癌組織中survivin mRNA表達(dá)與臨床病理關(guān)系

3 討 論

survivin基因不僅具有細(xì)胞保護(hù)性，同時(shí)對細(xì)胞分裂也有基本的保護(hù)作用。在體外實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，survivin直接與染色體轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白相互作用，例如：aurora-B激酶、著絲粒內(nèi)蛋白等。這些蛋白相互作用，在有絲分裂時(shí)候形成一個(gè)復(fù)合體，染色體轉(zhuǎn)運(yùn)復(fù)合物。這個(gè)復(fù)合物是染色體運(yùn)動(dòng)、紡錘體固有點(diǎn)檢測和細(xì)胞分裂所需要的［4］。survivin在腫瘤中過度表達(dá)可能會(huì)使這些細(xì)胞凋亡檢測點(diǎn)消失，讓已經(jīng)發(fā)生不同程度改變的細(xì)胞順利完成分裂、增殖。研究發(fā)現(xiàn)，survivin過度表達(dá)與腫瘤的侵襲性相關(guān)，并且能減少患者的存活時(shí)間［5］。

目前，運(yùn)用免疫組織化學(xué)技術(shù)對survivin在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)的研究結(jié)論尚未取得一致［6～8］。本次實(shí)驗(yàn)應(yīng)用RT-PCR 技術(shù)測得60例結(jié)直腸癌組織標(biāo)本和40例癌旁正常組織標(biāo)本中survivin基因的表達(dá)情況。統(tǒng)計(jì)學(xué)結(jié)果顯示：①survivin在結(jié)直腸癌組織中表達(dá)顯著升高，而在癌旁正常組織中幾乎不表達(dá)。但Suga［9］等通過研究發(fā)現(xiàn)60%正常組織有該基因表達(dá)。我們可以從本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果再次證明survivin與結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展有著密切關(guān)系，并且在結(jié)直腸癌的演變過程中發(fā)揮重要作用。②survivin在不同性別、不同年齡、不同部位腫瘤及不同分化程度的表達(dá)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但與腫瘤的Dukes分期及淋巴結(jié)是否轉(zhuǎn)移有關(guān)（P＜0.05），且 A、B、C、D四期survivin表達(dá)依次升高（P＜0.05）。有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的病例，survivin表達(dá)明顯高于對照組。進(jìn)而我們可以推斷：survivin的表達(dá)可能與結(jié)直腸癌的生物學(xué)特性有關(guān)。

綜上所述，survivin在結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用，通過檢測survivin的表達(dá)，可為判斷預(yù)后提供一定的依據(jù)。

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