黃家豪 曹云飛 高楓

（廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院結(jié)直腸肛門(mén)外科 廣西南寧 530021）

結(jié)直腸癌（Colorectal cancer，CRC）是臨床上常 見(jiàn)的消化系統(tǒng)腫瘤，每年在全世界范圍內(nèi)的新增病例約為945，000例，死亡人數(shù)達(dá)492，000人／年，同時(shí)也是我國(guó)常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，嚴(yán)重威脅著人們的身心健康［1］。結(jié)直腸癌強(qiáng)調(diào)以手術(shù)為主的綜合治療，但總體治療效果不盡人意［1］。近年來(lái)，越來(lái)越多的研究圍繞結(jié)直腸癌患者的免疫狀態(tài)及其機(jī)制展開(kāi)，而免疫學(xué)的研究成果將為腫瘤生物治療提供新的思路與途徑。

腫瘤的進(jìn)展包括宿主的細(xì)胞免疫與腫瘤通過(guò)多種分子機(jī)制互相作用的過(guò)程。研究表明，包含多種免疫細(xì)胞類型的宿主細(xì)胞免疫體系以復(fù)雜的方式與腫瘤細(xì)胞進(jìn)行作用，進(jìn)而發(fā)揮最重要的腫瘤防御機(jī)制［3，4］。盡管結(jié)直腸腫瘤組織及癌旁組織內(nèi)有大量免疫細(xì)胞浸潤(rùn)，但免疫低應(yīng)答或無(wú)應(yīng)答時(shí)常發(fā)生在結(jié)直腸癌患者身上［5～8］。

本研究通過(guò)流式細(xì)胞技術(shù)觀察結(jié)直腸癌患者與健康人外周血CD4＋T輔助細(xì)胞（helper T cell，Th細(xì)胞）亞群Th1細(xì)胞和Th2細(xì)胞比例的變化；采用實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄－聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative Real-time RT-PCR）的方法，從 mRNA 水平檢測(cè)轉(zhuǎn)錄因子T-bet／GATA-3表達(dá)量的變化；并利用液相芯片技術(shù)檢測(cè)結(jié)直腸癌患者和健康人群血漿中IFN-γ、TNF-α、IL-1β、IL-4、IL-6、IL-13和IL-15的表達(dá)水平，以期發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸癌進(jìn)展過(guò)程中免疫功能的變化，有利于完善結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展的腫瘤免疫機(jī)制，并為腫瘤疫苗提供潛在的治療靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象 選取廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院結(jié)直腸外科2011年3月至2011年10月初次行手術(shù)治療的43例結(jié)直腸癌患者（腸癌組）。所有樣本均符合人體實(shí)驗(yàn)倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)，征得外周血標(biāo)本提供者知情同意并簽署知情同意書(shū)，年齡40～86歲，中位年齡58.20歲。男24例，女19例，男女比例為1.26∶1。Dukes分期：A期13例，B期10例，C期14例，D期6例。根據(jù)腸癌患者有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移分為淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陰性結(jié)直腸癌患者（Dukes A期＋Dukes B期）與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽(yáng)性結(jié)直腸癌患者（Dukes C期＋Dukes D期）。組織學(xué)分型：腺癌41例，黏液腺癌2例。所切除標(biāo)本均經(jīng)病理學(xué)診斷證實(shí)?；颊咄庵苎槿∏拔捶梅晴摅w類抗炎藥（NSAID），并未經(jīng)任何化學(xué)治療或放射治療。收集同時(shí)期體檢健康者30例（對(duì)照組），年齡53.24±12.46歲，男女比例為1.5∶1。受檢者均無(wú)免疫系統(tǒng)性疾病。

1.2 標(biāo)本采集 腸癌組入院后次日清晨6時(shí)取肘靜脈血6m L，肝素鈉抗凝，對(duì)照組于體檢時(shí)取血1次（6m L）。腸癌組和對(duì)照組抽取的6m L肘靜脈血中，2m L用于流式細(xì)胞檢測(cè)，4m L用于實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄PCR與血漿細(xì)胞因子濃度測(cè)定。

1.3 主要試劑 總RNA提取試劑盒為中國(guó)天根公司產(chǎn)品；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒為美國(guó)Fermentas公司產(chǎn)品；實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)SYBR Green熒光Mix為瑞士Roche公司產(chǎn)品；分離單個(gè)核細(xì)胞所需密度梯度分離液為瑞典Pharmacia公司產(chǎn)品；血漿細(xì)胞因子檢測(cè)使用美國(guó)Bio-Rad公司的Bio-Plex系統(tǒng)以及相應(yīng)的細(xì)胞因子檢測(cè)試劑盒；流式細(xì)胞檢測(cè)樣本準(zhǔn)備所需溶血素、破膜劑、細(xì)胞表面抗體CD3／CD8、細(xì)胞內(nèi)抗體IFN－γ／IL-4為美國(guó) BD 公司產(chǎn)間；佛波酯（Phorbol myristate acetate，PMA）、離子霉素（Ionomycin）和蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)抑制劑（Golgistop，內(nèi)含莫能霉素）為美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品。

1.4 流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)外周血中Th1／Th2細(xì)胞的比例 取兩支10m L試管，分別為實(shí)驗(yàn)測(cè)定管和陰性對(duì)照管。每管加入肝素抗凝全血400μL和RPMI－1640培養(yǎng)基363μL。加入刺激劑PMA 20μL（1μg／m L），離子霉素（Ionomycin）16μL（50μg／m L）和蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)抑制劑1μL?；靹蚝笾糜?7℃5%CO2培養(yǎng)箱孵育5h。從培養(yǎng)箱內(nèi)取出后做小幅度振蕩混勻，加入2μL APC標(biāo)記的抗人CD3單抗和2μL PerCP標(biāo)記的抗人CD8，室溫避光孵育15min。加2m L 1X溶血素裂解紅細(xì)胞，室溫下避光孵育10min，2100rpm離心5min棄上清，用磷酸鹽緩沖液（Phosphate buffered saline，PBS）洗滌1次。加入1m L 1X破膜劑進(jìn)行細(xì)胞打孔利于細(xì)胞因子單抗進(jìn)入細(xì)胞，離心棄上清后用200μL RPMI-1640培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，繼而進(jìn)行胞內(nèi)細(xì)胞因子染色。測(cè)定管中加入2μL FITC標(biāo)記的IFN－γ和PE標(biāo)記的IL-4聯(lián)合抗體，對(duì)照管加入相應(yīng)的熒光標(biāo)記同型對(duì)照抗體，室溫避光孵育30min，PBS洗滌1次后使用300μL 1%多聚甲醛固定后上機(jī)檢測(cè)。應(yīng)用美國(guó)BD公司FACS-Calibur流式細(xì)胞儀進(jìn)行數(shù)據(jù)獲取和分析，根據(jù)前向散射光和側(cè)向散射光為淋巴細(xì)胞群設(shè)門(mén)，對(duì)CD3＋CD8－細(xì)胞分泌的Th1型細(xì)胞因子IFN-γ和Th2型細(xì)胞因子IL-4進(jìn)行檢測(cè)。

1.5 實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄－聚合酶鏈反應(yīng)檢測(cè)轉(zhuǎn)錄因子 T-bet／GATA-3表達(dá)量的變化

1.5.1 標(biāo)本處理 取15m L離心管，將5m L Ficoll-Hypaque液置離心管低層，將4m L肝素抗凝的外周血緩慢加至上層，注意不要破壞兩者形成的層面，以2500rpm X 20min作密度梯度離心。離心后上層為血漿，分裝后置-80℃冰箱保存待用。在血漿與Ficoll-Hypaque液之間的界面上收獲的細(xì)胞懸液，即為外周血單個(gè)核細(xì)胞（Peripheral blood mononuclear cell，PBMC）。用PBS液洗1次（2100rpm離心5min），加入381μL RPMI-1640完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，加入PMA 10μL（1μg／m L），離子霉素8μL（50μg／ml）和蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)抑制劑1μL，置于37℃5%CO2培養(yǎng)箱孵育5h，收集細(xì)胞，按照總RNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取總RNA。

熒光定量PCR檢測(cè)引物均由大連Ta KaRa公司合成，引物序列及目的基因擴(kuò)增范圍見(jiàn)表1。

表1 Real-time RT-PCR 引物序列

1.5.2 逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng) 取12μL RNA模板做逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，反應(yīng)體系及加樣順序如下（在冰上混合下列成分），RNA模板12μL，特異性下游引物0.5μL，5X逆轉(zhuǎn)錄Buffer 4μL，RNA酶抑制劑0.5μL，d NTP 1μL，逆轉(zhuǎn)錄酶1μL，總20μL體系。反應(yīng)條件：42℃60min，然后70℃5min。

1.5.3 熒光定量PCR反應(yīng)

（1）目的基因標(biāo)準(zhǔn)品及其濃度梯度的構(gòu)建（標(biāo)準(zhǔn)曲線定量法）：①目的基因標(biāo)準(zhǔn)品的制備。以所合成的cDNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增體系：cDNA模板1μL，上游引物0.5μL，下游引物0.5μL，去離子水（dd H20）8μL，Roche熒光 Mix 10μL。對(duì)PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物經(jīng)過(guò)1.5%低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠電泳（使用Gold ViewⅠ進(jìn)行染色，用TAE緩沖液配制凝膠），在長(zhǎng)波紫外光下，切下目的條帶。用膠回收試劑盒（普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒，中國(guó)天根）回收純化。測(cè)定OD值＞1.8，表明純度合格。用Nano Drop 2000測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)品濃度（ng／μL），即為陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品。②陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品梯度的制備：取陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品1μL，按10倍稀釋（加滅菌雙蒸水9μL，并充分混勻），依次準(zhǔn)確稀釋，制備成陽(yáng)性定量標(biāo)準(zhǔn)品梯度（不少于5個(gè)濃度梯度）。

（2）應(yīng)用 Applied Biosystems Step OneTMPlus熒光定量PCR儀，采用相對(duì)定量法檢測(cè)目的基因m RNA的表達(dá)水平，SYBR Green法檢測(cè)熒光，以GAPDH作為管家基因。待測(cè)樣本和陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品按以下反應(yīng)體系進(jìn)行。模板1μL，上游引物0.5μL，下游引物0.5μL，去離子水（dd H20）8μL，Roche熒光Mix 10μL，總體積20μL。反應(yīng)條件95℃預(yù)變性10min，然后95℃變性15s，60℃退火60s，共40個(gè)循環(huán)。溶解曲線部分：95℃15s，60℃60s，95℃15s。

（3）數(shù)據(jù)分析。若目的基因與內(nèi)參基因滿足擴(kuò)增效率均接近100%，且相對(duì)偏差不超過(guò)5%，根據(jù)基因相對(duì)表達(dá)倍數(shù)＝2－ΔΔCt，得到結(jié)果是通過(guò)經(jīng)內(nèi)參基因表達(dá)水平校準(zhǔn)的實(shí)驗(yàn)組樣本中目標(biāo)基因相對(duì)于對(duì)照組樣本的增加或減少的倍數(shù)。其中：ΔΔCT＝ΔCt（腸癌組）－ΔCt（對(duì)照組），ΔCt＝Ct（目的基因）－Ct（內(nèi)參基因，GAPDH）。Ct值是PCR擴(kuò)增產(chǎn)物產(chǎn)生可檢測(cè)的熒光信號(hào)時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。

1.6 液相芯片技術(shù)定量檢測(cè)人血漿細(xì)胞因子

1.6.1 標(biāo)準(zhǔn)品的制備 使用Bio-Plex標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液配制8個(gè)濃度的標(biāo)準(zhǔn)品以及空白對(duì)照。

1.6.2 血漿樣品的制備 使用Bio-Plex樣品稀釋液對(duì)待測(cè)血漿進(jìn)行1∶4稀釋。

1.6.3 分析操作方法 使用分析緩沖液配制1X稀釋微球混合物（避光）。濾板上各孔加入100μL分析緩沖液預(yù)濕，真空抽濾去除液體，每孔加入50μL稀釋微球混合物，用洗板機(jī)洗板2次后加入50μL標(biāo)準(zhǔn)品、待測(cè)血漿標(biāo)本，室溫避光振蕩孵育30min。真空抽濾，每孔用100μL洗滌液洗去微球上未結(jié)合的物質(zhì)，隨后每孔加入25μL生物素標(biāo)記抗體，以形成抗體三明治復(fù)合體。室溫避光振蕩孵育30min。同前抽濾并洗滌3次，除去過(guò)量的檢測(cè)抗體后，每孔加入25μL藻紅蛋白標(biāo)記的鏈酶親和素（SA-PE）溶液，室溫避光振蕩孵育10min。再次抽濾并洗滌3次后，每孔加入125μL洗滌液重懸微球，在Bio-Plex系統(tǒng)上檢測(cè)出SA-PE發(fā)出的熒光量以及待測(cè)樣品濃度。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以EM表示，組間比較采用t檢驗(yàn)或秩和檢驗(yàn)，變量之間的相關(guān)分析使用Spearman等級(jí)相關(guān)進(jìn)行研究，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α＝0.05。

2 結(jié) 果

2.1 Th2細(xì)胞在結(jié)直腸癌患者外周血中比例增加

由于CD4在不同的細(xì)胞亞型之間可出現(xiàn)交叉表達(dá)（既表達(dá)在Th細(xì)胞上，也表達(dá)在單核細(xì)胞上），因此單獨(dú)用CD4設(shè)門(mén)無(wú)法將Th1和Th2細(xì)胞區(qū)分開(kāi)。采用CD3和CD8設(shè)門(mén)則可解決這一問(wèn)題，因CD8不受PMA刺激的影響，且絕大多數(shù)的CD3＋CD8－細(xì)胞都是CD3＋CD4＋的細(xì)胞。本研究中我們利用流式細(xì)胞技術(shù)，通過(guò)對(duì)CD3＋CD8－細(xì)胞群中IFN-γ和IL-4的陽(yáng)性表達(dá)率來(lái)分析Th1／Th2細(xì)胞的表達(dá)水平。腸癌組與對(duì)照組外周血Th1和Th2細(xì)胞比例如表2所示。腸癌組外周血中Th1細(xì)胞（CD3＋CD8－IFN-γ＋）占 CD4＋T 細(xì)胞比例與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05；圖1）；Th2細(xì)胞（CD3＋CD8－IL-4＋）占 CD4＋T細(xì)胞比例顯著高于對(duì)照組（P＜0.05；圖2）。Th1細(xì)胞比例與結(jié)直腸癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系：淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陰性結(jié)直腸癌患者（Dukes A期＋Dukes B期）外周血Th1比例與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽(yáng)性的結(jié)直腸癌患者（Dukes C期＋Dukes D期）間無(wú)明顯差異（P＞0.05）。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陰性／陽(yáng)性的結(jié)直腸癌患者外周血Th2細(xì)胞比例均顯著高于健康對(duì)照組（P均＜0.05），但淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陰性／陽(yáng)性的結(jié)直腸癌患者之間外周血Th2細(xì)胞的比例無(wú)顯著差異（P＞0.05）。

表2 腸癌組與對(duì)照組Th1細(xì)胞和Th2細(xì)胞占CD4＋T細(xì)胞比例

圖1 腸癌組與對(duì)照組外周血Th1細(xì)胞（CD3＋CD8＋I(xiàn)FN-γ＋）比例

圖2 腸癌組與對(duì)照組外周血Th2細(xì)胞（CD3＋CD8＋I(xiàn)L-4＋）比例

Th1細(xì)胞和Th2細(xì)胞相關(guān)性如圖3所示：在結(jié)直腸癌患者外周血中Th1細(xì)胞與Th2細(xì)胞具有明顯正相關(guān)性（r＝0.686，P＜0.01，圖3），而在正常人兩者的相關(guān)性則不明顯（r＝0.311，P＞0.05）。

2.2 結(jié)直腸癌患者外周血 T-bet／GATA-3mRNA的相對(duì)基因表達(dá)量 GAPDH、T-bet和 GATA－3的擴(kuò)增曲線：實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增結(jié)果顯示，GAPDH、T-bet和GATA-3的熔解曲線未見(jiàn)雜峰，表明擴(kuò)增特異性較好（圖4a、5a、6a）；標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率、截距、相關(guān)系數(shù)、擴(kuò)增效率均能滿足使用公式“相對(duì)值＝2－△△CT”計(jì)算實(shí)驗(yàn)組相對(duì)于對(duì)照組中目的基因的相對(duì)表達(dá)倍數(shù)（圖4b、5b、6b）。

圖3 Th1細(xì)胞與Th2細(xì)胞相關(guān)性分析

圖4 GAPDH標(biāo)準(zhǔn)品熒光PCR擴(kuò)增效果

腸癌組和對(duì)照組外周血T-bet和GATA-3的mRNA表達(dá)：相對(duì)于對(duì)照組，腸癌組外周血的T-bet mRNA表達(dá)水平顯著降低（P ＜0.05，圖7），而腸癌組外周血 GATA-3的mRNA表達(dá)則顯著高于對(duì)照組（P＜0.05，圖7）。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽(yáng)性與陰性結(jié)直腸癌患者的T-bet的m RNA表達(dá)量均顯著低于對(duì)照組（P＜0.05，圖8／圖9），而Th2細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子GATA-3的mRNA表達(dá)量在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽(yáng)性與陰性的結(jié)直腸癌患者的表達(dá)情況則相反：在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陰性結(jié)直腸癌患者中表達(dá)量較對(duì)照組顯著降低（P＜0.05，圖8），而在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽(yáng)性患者中表達(dá)量較對(duì)照組顯著升高（P＜0.05，圖9）。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽(yáng)性／陰性結(jié)直腸癌患者之間T-bet和GATA-3的表達(dá)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

2.3 結(jié)直腸癌患者血漿Th1／Th2相關(guān)細(xì)胞因子的變化腸癌組和對(duì)照組血漿細(xì)胞因子表達(dá)水平見(jiàn)表3。腸癌組與對(duì)照組血漿細(xì)胞因子 TNF－α、IL-1β、IL-13和IL－15表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)直腸癌患者血漿細(xì)胞因子的表達(dá)水平與腫瘤進(jìn)展相關(guān)：淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陰性結(jié)直腸癌患者血漿IFN-γ濃度顯著高于淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽(yáng)性的結(jié)直腸癌患者（P＜0.05）。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽(yáng)性的結(jié)直腸癌患者較對(duì)照組IL-4降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)直腸癌患者隨著Dukes分期的升高，IL-6有逐漸降低的趨勢(shì)：淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陰性的結(jié)直腸癌患者較淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽(yáng)性患者的血漿IL-6表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05）。腸癌組和對(duì)照組血漿細(xì)胞因子濃度見(jiàn)表2。

圖7 腸癌組與對(duì)照組T-bet和GATA-3的相對(duì)基因表達(dá)量

表3 血漿細(xì)胞因子濃度［（EM），pg／ml］細(xì)胞因子

表3 血漿細(xì)胞因子濃度［（EM），pg／ml］細(xì)胞因子

注：腸癌組以及腸癌組淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陰性者／陽(yáng)性者分別與對(duì)照組進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)比較。根據(jù)數(shù)據(jù)的分布類型使用t檢驗(yàn)或U檢驗(yàn)。＊t檢驗(yàn)；＊＊U檢驗(yàn)；＃腸癌組淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陰性者／陽(yáng)性者存在顯著差異

細(xì)胞因子 對(duì)照組 腸癌組 腸癌組淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陰性者腸癌組淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽(yáng)性者TNF-α＊ 147.06±51.70 486.63±75.09368.02±132.17＃ 115.43±24.58＃NS NS NS IFN-γ＊＊ 150.54±29.84 186.43±20.30 235.90±31.43＃ 129.15±17.39＃NS NS NS IL-1β＊ 7.57±2.20 8.17±3.90 12.53±7.04 2.88±0.74NS NS NS IL-4＊＊ 0.78±0.24 0.58±0.36 0.85±0.64 0.25±0.08NS NS P＜0.05IL-6＊＊ 46.79±12.51 91.50±22.26 140.93±37.00＃ 31.66±10.31＃NS P ＜0.05 NS IL-13＊ 2.78±1.12 1.41±0.15 1.45±0.20 1.00±0.23NS NS NS IL-15＊ 25.77±8.77 41.43±12.77 55.62±22.56 24.08±3.71NS NS NS

3 討 論

T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫在機(jī)體的抗腫瘤效應(yīng)中起重要作用，其中CD4＋T細(xì)胞、CD8＋T細(xì)胞及γδT細(xì)胞是主要參與抗瘤效應(yīng)的T細(xì)胞亞群。具有抗原特異的CD4＋T輔助細(xì)胞對(duì)機(jī)體的特異性免疫／非特異性免疫，以及細(xì)胞免疫／體液免疫均有重要的調(diào)節(jié)作用，既能促進(jìn)其他T細(xì)胞的分化成熟，也能協(xié)助B細(xì)胞產(chǎn)生抗體，是機(jī)體內(nèi)一類重要的免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞。另外，Th細(xì)胞也是評(píng)估機(jī)體免疫狀態(tài)和免疫能力的重要指標(biāo)，對(duì)評(píng)估腫瘤的預(yù)后、復(fù)發(fā)、治療效果等方面有重要作用。

為進(jìn)一步研究Th細(xì)胞亞群在結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展中的變化及其相關(guān)機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)使用流式細(xì)胞技術(shù)對(duì)43名結(jié)直腸癌患者和30名健康人外周血CD4＋T細(xì)胞亞群Th1細(xì)胞和Th2細(xì)胞的分布進(jìn)行檢測(cè)，運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR對(duì)Th1和Th2細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子（T-bet和GATA-3）m RNA的相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行分析，利用液相芯片技術(shù)對(duì)Th1／Th2細(xì)胞亞群分泌的細(xì)胞因子進(jìn)行定量檢測(cè)，得到了重要發(fā)現(xiàn)。①結(jié)直腸癌患者外周血Th2細(xì)胞占CD4＋T細(xì)胞的比例與健康人相比顯著升高，而Th1細(xì)胞占CD4＋T細(xì)胞的比例在結(jié)直腸癌患者與健康人中無(wú)顯著性差異。②Th1和Th2細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子的m RNA表達(dá)量在結(jié)直腸癌患者與健康人之間差異顯著。結(jié)果顯示，與健康人相比T-bet m RNA的表達(dá)量在結(jié)直腸癌患者外周血中顯著降低，GATA-3的mRNA表達(dá)量則在腸癌組中顯著升高。③盡管腸癌組與對(duì)照組血漿各細(xì)胞因子的濃度差異不總存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但各細(xì)胞因子的濃度與對(duì)應(yīng)的特異性細(xì)胞因子mRNA的表達(dá)趨勢(shì)相類似。液相芯片的檢測(cè)結(jié)果證實(shí)Th1細(xì)胞相關(guān)的細(xì)胞因子表達(dá)水平在兩組間的表達(dá)水平相當(dāng)。結(jié)直腸癌患者外周血Th2細(xì)胞相關(guān)的細(xì)胞因子表達(dá)水平與疾病的進(jìn)展程度密切相關(guān)。

Th1和Th2細(xì)胞都是由初始T細(xì)胞誘導(dǎo)分化而來(lái)，而Th1與Th2的比例與生理情況和臨床狀態(tài)有關(guān)［9～11］。Tabata及其研究團(tuán)隊(duì)報(bào)道腫瘤患者體內(nèi)出現(xiàn)Th1／Th2細(xì)胞漂移，從而導(dǎo)致Th2細(xì)胞占主導(dǎo)的免疫狀態(tài)［12］。本研究的結(jié)果顯示，Th2細(xì)胞占CD4＋T細(xì)胞的比例在腸癌組外周血中與對(duì)照組相比顯著升高，而Th1細(xì)胞占CD4＋T細(xì)胞的比例在兩組之間無(wú)明顯差異。因此Th1和Th2細(xì)胞的比例可作為體內(nèi)免疫狀態(tài)轉(zhuǎn)換的一個(gè)指標(biāo)，也在一定程度上與Tabata的報(bào)道情況相一致。Th1相關(guān)T-bet mRNA的表達(dá)水平在腸癌組外周血顯著低于對(duì)照組，但是沒(méi)有流式細(xì)胞計(jì)數(shù)和血清學(xué)的結(jié)果支持：Th1細(xì)胞比例和其相關(guān)的細(xì)胞因子IFN-γ與TNF-α在外周血的表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。我們運(yùn)用流式細(xì)胞技術(shù)對(duì)Th2細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞表面抗體與胞內(nèi)抗體的標(biāo)記，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Th2細(xì)胞占CD4＋T細(xì)胞比例在外周血的增高。實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)到與Th2轉(zhuǎn)錄相關(guān)的GATA-3mRNA表達(dá)量升高也證實(shí)了流式細(xì)胞的結(jié)果。Th1細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子T-bet m RNA在結(jié)直腸癌組表達(dá)量較對(duì)照組顯著降低，而同時(shí)Th2細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子GATA-3的m RNA表達(dá)量較對(duì)照組顯著升高，則提示Th1／Th2細(xì)胞平衡在轉(zhuǎn)錄因子水平上被打破，朝Th2細(xì)胞偏移。GATA-3m RNA的高表達(dá)一方面通過(guò)上調(diào)Th2類細(xì)胞因子而促進(jìn)Th0細(xì)胞向Th2細(xì)胞方向分化，另一方面則可能通過(guò)抑制IL-12和IFN-γ的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)來(lái)抑制Thl細(xì)胞發(fā)育，使Th1／Th2比例極化，向Th2細(xì)胞偏移，抗腫瘤免疫應(yīng)答受到限制，機(jī)體無(wú)法徹底清除腫瘤細(xì)胞，最終發(fā)生腫瘤進(jìn)展。因此我們認(rèn)為結(jié)直腸癌患者處于激活狀態(tài)的Th2相關(guān)細(xì)胞通路可能與免疫逃逸的發(fā)生相關(guān)。

細(xì)胞因子是由免疫細(xì)胞與非免疫細(xì)胞共同分泌的調(diào)節(jié)性蛋白。促炎性的細(xì)胞因子環(huán)境可以影響包括結(jié)直腸癌在內(nèi)的多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展［13，14］。本研究中，我們運(yùn)用液相芯片技術(shù)定量檢測(cè)結(jié)直腸癌患者與健康對(duì)照組血漿中Th1／Th2細(xì)胞因子的表達(dá)水平。結(jié)果 顯示，腸癌組與對(duì)照組血漿Th1相關(guān)細(xì)胞因子IFN－γ和TNF－α的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與Pellegrini等人報(bào)道的結(jié)直腸癌患者與對(duì)照組外周血IFN－γ和TNF－α表達(dá)水平無(wú)顯著差異的結(jié)果相一致［13］。IFN-γ通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞的活性，而在啟動(dòng)細(xì)胞免疫和抑制腫瘤等方面起著至關(guān)重要的作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽(yáng)性結(jié)直腸癌患者血漿IFN-γ濃度與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陰性結(jié)直腸癌患者相比顯著降低，這從側(cè)面反映了機(jī)體抗腫瘤免疫功能的缺陷程度隨著腫瘤進(jìn)展逐漸加重。血漿Th2相關(guān)細(xì)胞因子IL-4和IL-6與腫瘤分期密切相關(guān)：IL-4在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽(yáng)性結(jié)直腸癌患者與正常對(duì)照組相比顯著降低，這與Shibata檢測(cè)結(jié)直腸癌患者外周血IL-4所得出的結(jié)果未達(dá)到一致［15］。病情進(jìn)展與IL-6的表達(dá)水平密切相關(guān)：淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陰性腸癌患者血漿IL-6濃度顯著高于淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽(yáng)性腸癌患者。因此，根據(jù)血漿細(xì)胞因子在疾病不同階段濃度存在差異性，可將細(xì)胞因子的濃度作為提示疾病狀態(tài)的生物學(xué)指標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，血漿IL-1β、IL-13和IL-15濃度在腸癌組與對(duì)照組的差異無(wú)顯著性差異。

結(jié)直腸癌患者外周血中Th1細(xì)胞比例變化不明顯而Th2細(xì)胞比例升高。結(jié)直腸癌患者血漿細(xì)胞因子的不平衡表達(dá)可作為機(jī)體免疫狀態(tài)轉(zhuǎn)換與病情判斷的指標(biāo)。

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