周玉敏，徐自警

（湖北生態(tài)職業(yè)技術(shù)學院，武漢 430200）

三色堇（ViolatricolorL.），堇菜科堇菜屬多年生草本植物，在其雜交制種和不育系繁殖過程中，父本花粉的產(chǎn)量及其質(zhì)量是確定群體種植比例的主要依據(jù)之一［1］。筆者采用I－KI染色法、醋酸洋紅染色法TTC染色法、過氧化物酶沉淀法、培養(yǎng)基離體萌發(fā)試驗法對三色堇進行花粉生活力的測定，以期篩選出最佳測定方法，為三色堇大規(guī)模制種和貯藏花粉的生活力鑒定提供可靠依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料的采集和處理

實驗用花粉采集于學院苗圃地栽培的三色堇，于2011年2月6日上午8：00采摘已開花尚未散粉的三色堇花供測定用。選了5種花色的品種即：一花三色的品種1、純黃的品種2、黃紫相間的品種3、花瓣邊緣呈波浪狀的品種4、重瓣形的品種5。將采集來的材料放入4℃冰箱中預(yù)處理2h，取出花藥，放入準備好的墊有濾紙的培養(yǎng)皿上，放進恒溫干燥箱，溫度保持在22～25℃中，讓其干燥散粉，以待備用［2］。

1.2 試驗方法

1.2.1 I－KI染色法。取準備好的花藥，置于載玻片上，滴1小滴I－KI（0.1%）溶液，輕輕擠壓花藥，涂于載玻片上，蓋上蓋玻片，迅速在顯微鏡下觀察，有活力的花粉被染成藍色。

1.2.2 TTC染色法。取準備好的花藥適量放在一個小玻璃皿內(nèi)，加入適量TTC溶液，輕輕擠壓花藥，使花粉粒散在TTC溶液中，放在25℃恒溫箱中15min，然后在顯微鏡下觀察。有活力的花粉被染成紅色。

1.2.3 醋酸洋紅染色法。取準備好的花藥，置于載玻片上，滴1滴醋酸洋紅溶液，輕輕擠壓花藥，置于載玻片上，蓋上蓋玻片，片刻后在顯微鏡下觀察。有活力的花粉被染色紅色。

1.2.4 過氧化物酶沉淀法

首先將以下試劑配好：①0.5%聯(lián)苯胺；②0.5%a－蔡酚；③0.25%碳酸鈉；④0.3%過氧化氫。試驗前再將溶液①、②、③各10m L混合成試劑I，溶液④為試劑II，在干潔載玻片上放少量準備的花粉，然后加試劑I、II各1小滴，攪勻后蓋上蓋玻片。30℃條件下10min后在低倍顯微鏡下觀察。有活力的花粉被染成紅色。

1.2.5 培養(yǎng)基萌發(fā)試驗法

①培養(yǎng)基溶液的配制。將0.8g瓊脂放入盛有少量蒸餾水的100m L小燒杯中加熱、攪拌至充分溶解后分成多份，再在其中加入蔗糖和硼酸，分別配成A、B兩組培養(yǎng)基溶液：A組為蔗糖濃度不變（質(zhì)量濃度為30mg／L）而硼酸濃度變化（質(zhì)量濃度分別為0、1.0、1.5、2.0、2.5mg／L）的5種培養(yǎng)基濃度；B組為硼酸濃度不變（質(zhì)量濃度為2.0mg／L）而蔗糖濃度變化（質(zhì)量濃度分別為0、10、15、20、25、30mg／L）的6種培養(yǎng)基溶液。

②花粉接種。在超凈工作臺將配制好的培養(yǎng)基均勻地倒入凹玻片中，使與玻片齊平，待凝固后，用消毒過的頭發(fā)絲將已準備好的花粉接種到所設(shè)定的培養(yǎng)基凹玻片上。標注花粉種類、培養(yǎng)基配方號、采集時間和接種時間，放于20～25℃的恒溫箱內(nèi)。

③鏡檢和花粉萌發(fā)率統(tǒng)計。接種花粉2h后開始觀察花粉萌發(fā)情況，了解花粉的萌發(fā)速度和花粉管的生長情況。以花粉管長度超過1／2花粉直徑的為有活力的萌發(fā)花粉［3］。

花粉萌發(fā)率的計算公式：花粉萌發(fā)率（%）＝（萌發(fā)花粉粒／總花粉粒數(shù)）×100%

1.2.6 綜合比較試驗。將準備好的花粉分別按照5種方法測定花粉生活力，每處理3個重復(fù)，每重復(fù)觀察10個視野，取平均值計算［4］。

2 結(jié)果與分析

2.1 三色堇花粉的染色率和萌發(fā)率

2.1.1 幾種染色方法對三色堇花粉粒的染色結(jié)果。通過顯微觀察，三色堇花粉粒近長柱形，具5孔溝，兩極有近圓形的平面，中部粗糙，外壁光滑。實驗結(jié)果表明，與培養(yǎng)基萌發(fā)試驗法相比，I－KI染色法、醋酸洋紅染色法、TTC法的效果較差，均不適合三色堇花粉生活力的測定，而過氧化物酶沉淀法的測定結(jié)果與培養(yǎng)基萌發(fā)法的測定結(jié)果十分相近。過氧化物酶沉淀法更為準確，是三色堇花粉生活力測定中最理想的測定方法。

2.1.2 不同濃度的蔗糖對三色堇花粉萌發(fā)的影響。蔗糖濃度是影響花粉萌發(fā)率的重要因素之一，三色堇品種1的備用花粉在B組培養(yǎng)基上培養(yǎng)24h后，對應(yīng)于蔗糖質(zhì)量濃度為0、10、15、20、25、30mg／L的培養(yǎng)基上的萌發(fā)率分別為0、8.67%、15.88%、35.04%、19.21%、13.12%。萌發(fā)率隨著蔗糖質(zhì)量濃度的變化而變化，當蔗糖質(zhì)量濃度為20mg／L時，萌發(fā)率達到最大值35.04%。

2.1.3 不同濃度的硼酸對三色堇花粉萌發(fā)的影響。硼酸濃度對三色堇花粉萌發(fā)也有一定的促進作用。三色堇品種1的備用花粉在A組培養(yǎng)基上培養(yǎng)24h后，對應(yīng)于硼酸質(zhì)量濃度為0、1.0、1.5、2.0、2.5mg／L的培養(yǎng)基上的萌發(fā)率分別為0、15.11%、38.24%、20.10%、11.48%。隨著硼酸質(zhì)量濃度的增加，花粉的萌發(fā)率呈現(xiàn)先上升后降的趨勢。當硼酸質(zhì)量濃度為1.5mg／L時，萌發(fā)率達最大值38.24%。

2.1.4 五個花色三色堇花粉萌發(fā)率的比較。五個花色三色堇備用花粉粒在含質(zhì)量濃度分別為20mg／L、1.5mg／L的蔗糖和硼酸的瓊脂培養(yǎng)基上的萌發(fā)情況見表1。從表中看出，5個花色三色堇中，一花三色的品種1的花粉生活力最強，其次是花色為純黃的品種2，重瓣形的品種5花粉的生活力最差。

表1 三色堇花粉的萌發(fā)情況

2.2 低溫儲藏后三色堇花粉的染色率和萌發(fā)率

三色堇花粉在溫度為2～5℃，空氣濕度為30%～50%的條件下貯藏2～5天后，再次對其進行染色試驗和萌發(fā)試驗。試驗結(jié)果顯示：其染色率與備用花粉沒有大的變化，但在含質(zhì)量濃度分別為20mg／L、1.5mg／L的蔗糖和硼酸的瓊脂培養(yǎng)基上的萌發(fā)率有明顯變化。培養(yǎng)14h后，5個花色三色堇的花粉都有明顯的萌發(fā)；培養(yǎng)24h后，品種1、品種2、品種3、品種4、品種5五個花色三色堇花粉的萌發(fā)率分別為90.5%、84.1%、80，2%、78.5%、80.2%。但是隨著貯藏時間的繼續(xù)延長而花活生活力下降。

3 小結(jié)

3.1 在實驗所進行的5種試驗方法中，I－KI染色法、醋酸洋紅染色法和TTC染色法效果不明顯，不適用于三色堇花粉生活力的測定，這主要是由于三色堇的花粉壁較厚，染色物質(zhì)不容易進入造成的。過氧化物酶沉淀法和培養(yǎng)基萌發(fā)試驗法，表現(xiàn)出對三色堇花粉快速、準確地染色效果，故可認為其是測定三色堇花粉生活力的最佳染色方法。

3.2 蔗糖起著維持花粉與培養(yǎng)基之間滲透平衡的作用，也是花粉萌發(fā)的營養(yǎng)物質(zhì)和能量來源。蔗糖濃度對花粉萌發(fā)有明顯影響。不同植物花粉萌發(fā)的適宜蔗糖濃度有所不同。本次試驗發(fā)現(xiàn)蔗糖質(zhì)量濃度為20mg／L時能較好地促進三色堇花粉萌發(fā)；硼酸可以促進糖的吸收與代謝，增加氧的吸收，參與果膠的合成，有利于花粉管在生長壁中的建造。本次試驗發(fā)現(xiàn)硼酸質(zhì)量濃度為1.5mg／L時對三色堇花粉萌發(fā)有較好的促進作用。

3.3 花粉貯藏時，隨著貯藏時間的增加，花粉內(nèi)貯藏物質(zhì)的消耗增多，酶活性下降，水分逐步流失，花粉的生活力會逐漸下降。因此，花粉的貯藏環(huán)境與花粉生活力密切相關(guān)，即保存的花粉比新鮮花有更高的離體萌發(fā)率。這個發(fā)現(xiàn)對于花粉的貯藏具有很大的意義。

［1］ 王孝鵬，孫曉梅.三色堇花粉生活力最佳測定方法的篩選［J］.安微農(nóng)業(yè)科學，2008，36（7）：2756－2769.

［2］ 賈文慶，劉宇.紫薇花粉生活力的測定［J］.陜西農(nóng)業(yè)科學，2007（1）：46－48.

［3］ 張志良.植物生理學實驗指導(dǎo)［M］.北京：高等教育出版社，2000：240－242.

［4］ 張亞利，曾憲寶.梅花花粉生活力的測定和比較［J］.湖北農(nóng)業(yè)科學，2005（6）：84－86.