馬亞紅 鐘力生 胡慧玉

(西安交通大學電力設(shè)備電氣絕緣國家重點實驗室 西安 710049)

1 引 言

隨著生命科學研究的深入發(fā)展，特別是醫(yī)學上活體組織器官移植的發(fā)展，使細胞、組織和器官的保存成為現(xiàn)代科學研究的一個重要領(lǐng)域，生物材料的低溫保存技術(shù)也已成為重要課題?？焖賰鼋Y(jié)和添加低溫保護劑是目前生物材料低溫保存的有效方法［1-2］，能夠明顯抑制冰晶的形成，但是這些方法在具體實現(xiàn)中有很大的困難，同時存在一些問題［3］，如通過快速凍結(jié)實現(xiàn)玻璃化保存需要極快速的降溫速率(＞106℃/min)，生物材料熱容、熱導的各向異性導致降溫速率的不均勻性，低溫保護劑對細胞的毒害性等，特別是對于體積性對較大的生物體，常規(guī)的低溫保存方法無法達到生物材料低溫保存的目的。

生物體中含有大量的生物溶液，它屬于稀釋電解質(zhì)溶液，其中含有許多種類的離子，如:K+、Na+、Ca2+、Mg2+、Cl－、I－等離子，生理鹽水(0.9%NaCl溶液)在生物溶液中占主要成分。在電解質(zhì)溶液中，離子是水化的，溶液中的部分水分子與離子緊密結(jié)合，形成水化離子，其余則為自由水分子［4］。水化離子模型如圖1所示。

圖1 電解質(zhì)溶液中水化離子模型示意圖Fig.1 Schematic of hydration ions in electrolyte solution

水分子是一種強極性分子結(jié)構(gòu)，固有電偶極距為1.87D。分子動力學模擬研究結(jié)果顯示，電場作用能夠引起水分子排列結(jié)構(gòu)的變化［5］;一些研究結(jié)果也表明電場對冰晶的形成具有顯著的影響［6-10，15］。本文以雞血紅細胞懸液為研究模型，在其低溫保存過程中引入交變電場，研究交變電場對細胞懸液凍存特性的影響，為生物材料低溫保存技術(shù)提供參考。

2 實驗樣品制備

選取雞血紅細胞用于低溫冷凍保存實驗研究。選用雞血紅細胞因為其具有完整成形的細胞核易于顯微觀察，而人和哺乳動物的成熟紅細胞無細胞核和細胞器。制備雞血紅細胞懸液的步驟如下:

(1)用注射器在雞翼下靜脈取雞血5 mL，即時使用。制備過程不添加抗凝劑，以免影響實驗結(jié)果。

(2)取細胞懸液1 mL，移入10 mL離心管，加入4 mL0.9%生理鹽水混勻，2 000 r/min，離心 5 min。

(3)棄上清液(用吸管吸去)，加0.9%生理鹽水至5 mL?；靹蚝笠? 000 r/min速度離心5 min。

(4)重復上述條件，再離心洗滌1次。

(5)收集最后1次離心沉淀的血細胞，加入適量的0.9%生理鹽水，直到紅細胞在懸液中的濃度達到適合觀測的數(shù)量。本次試驗配置的細胞懸浮液濃度為2.05×107±7.52×105/mL。

3 實驗設(shè)備及方法

3.1 實驗設(shè)備

顯微觀察實驗系統(tǒng)主要由7部分組成，分別為:正弦波信號發(fā)生器、信號監(jiān)測、低溫環(huán)境、光學顯微鏡、數(shù)字圖象采集、實驗微電極系統(tǒng)、計算機。顯微觀察系統(tǒng)的組成結(jié)構(gòu)如圖2所示。

圖2 紅細胞凍存顯微觀察系統(tǒng)Fig.2 Microscopic system for observating red blood cell after freezing

在樣品冷凍過程中，正弦波信號發(fā)生器提供一個正弦波電壓信號，并通過銅電極系統(tǒng)作用于樣品，為其提供干擾凍結(jié)過程的交變電場。正弦波信號發(fā)生器的型號為TFG-2001B，性能參數(shù)如下:輸出波形:正弦波;頻率范圍:40 mHz—40 MHz;電壓范圍:100 mVp-p—20 Vp-p;

信號監(jiān)測用于實時監(jiān)測作用于實驗樣品上的正弦波電壓信號的頻率和幅值，采用TDS220型數(shù)字示波器對正弦波電壓信號進行實時監(jiān)測，數(shù)字示波器的性能參數(shù)為:頻帶寬度:100 MHz;采樣速率:1 GS/s。

溫度控制系統(tǒng)包括熱臺、液氮瓶、加熱升溫裝置、熱電阻測溫裝置，可以提供－180—600℃的溫度范圍。

光學顯微鏡型號為Olympus BX-51偏光顯微鏡，放大倍數(shù):40—2 000。

實驗電極采用叉指梳狀微電極結(jié)構(gòu)，上層和下層為直徑16 mm的圓形石英玻璃載玻片，相對其它絕緣材料，其軟化點較高，導熱系數(shù)較大，光學性能優(yōu)良。下層載玻片通過磁控濺射和激光刻蝕制作形成如圖3所示的微電極結(jié)構(gòu)［11-12］。金具有良好的導電性和化學惰性，可以消除電極表面雙電層效應提高試驗結(jié)果精確度，但由于金膜與玻璃基片的附著性較差，直接鍍上后會部分脫落，因而需在金和石英玻璃間加入過渡金屬。常采用的連接金屬有鉻，鉻在大氣中有很強的鈍化能力，對多種酸和堿都具有很好的耐腐蝕性能，化學穩(wěn)定性好，還有高硬度的特點。鉻膜在多復合導電膜中常作為一種“過渡”［13-14］，本微電極采用的基片及金屬膜的立體結(jié)構(gòu)如圖4所示，其中鉻膜為50 nm，金膜為80 nm，薄膜電阻率為6.175×10－8Ω·m。

實驗過程中，實驗樣品用移液管滴在微電極區(qū)域，上面蓋上蓋玻片自然形成單層細胞懸液。操作過程中避免氣泡的產(chǎn)生。正弦信號通過電極提供一個交變電場作用于實驗樣品，電場強度由正弦波電壓和電極之間距離決定，本實驗裝置在理想情況下實驗電極之間產(chǎn)生的最大電場強度僅為E=2×105V/m，頻率為1 MHz。

3.2 實驗方法

采用對比試驗法，觀察交變電場對細胞懸液凍存特性的影響。配置好濃度為2.05×107±7.52×105/mL初始細胞懸浮液保存在室溫(25℃左右)環(huán)境中，另外3組分別施加不同條件在顯微鏡熱臺上以同樣的降溫速率5℃/min冷凍至－100℃，其中第一組施加1 MHz交變電場，第二組加入質(zhì)量分數(shù)為3.3%的二甲基亞砜作為低溫保護劑，第三組既不添加低溫保護劑也不施加交變電場。冷凍結(jié)束后，并使其在室溫(25℃左右)環(huán)境下自然解凍直接用偏光顯微鏡觀察。

4 實驗結(jié)果

圖4是對照組和3組實驗樣品在1 000倍顯微鏡下的觀察結(jié)果。圖4a對初始細胞顯微觀察結(jié)果顯示，紅細胞形態(tài)完好，幾乎所有細胞膜和細胞核均清晰可見。圖4b冷凍過程中施加1 MHz交變電場作用的顯微觀察結(jié)果顯示，部分紅細胞因低溫冷凍而造成細胞膜破損，但是還有少量紅細胞幸免;從圖中可以看出，經(jīng)過冷凍而幸免的紅細胞，其細胞形態(tài)基本保持完好，細胞膜沒有因低溫冷凍而遭到破壞，細胞存活率為23.4% ±1.43%，比對照組明顯提高。圖4c添加質(zhì)量分數(shù)為3.3%的低溫保護劑二甲基亞砜顯微結(jié)果中可以看出，低溫保護劑具有保護細胞免遭低溫損傷的作用，經(jīng)過低溫冷凍后，部分細胞還是保持了完好的形態(tài)結(jié)構(gòu)，細胞存活率為37.2% ±2.81%。圖4d為對照組，冷凍過程中沒有任何外加條件的顯微觀察結(jié)果顯示，紅細胞經(jīng)過低溫冷凍后細胞膜幾乎全部破損，紅細胞破損后留下的細胞核清晰可見。對照圖4b和圖4c電場同質(zhì)量分數(shù)為3.3%的低溫保護劑(二甲基亞砜)的低溫保存效果相比還較差。通過該組對比實驗結(jié)果表明交變電場對于低溫無損保存生物材料具有一定的促進作用。但是還是需要進一步研究最佳電場條件以提高低溫保存效率。

5 分析及結(jié)論

本實驗中雞血紅細胞懸液中主要成分為紅細胞、水分子、Na+、Cl–，慢速降溫保存過程中交變電場的影響本文從水分子的偶極轉(zhuǎn)向極化和離子位移極化兩個方面分析，探討交變電場影響生物材料低溫保存過程的本質(zhì)。

圖4 顯微觀察圖像(1 000倍)Fig.4 Microscopic image(1 000 times)

(1)水分子偶極轉(zhuǎn)向極化。由于水分子是一種強極性分子，當交變電場頻率小于水分子的松弛頻率時，在電場作用下水分子的電偶極矩μ0將產(chǎn)生趨向外電場方向的重定向，電偶極矩μ0指向電場方向重定向的水分子具有最穩(wěn)定的狀態(tài)，水分子沿電場方向所具有的穩(wěn)定狀態(tài)為在過冷水中誘發(fā)冰核形成提供了有利條件，因此交變電場具有在過冷水中誘發(fā)冰核形成的作用。

(2)離子的電遷移運動。外加電場為交變電場，離子將在其自身的熱平衡位置上隨著電場變化產(chǎn)生不停的往復運動。離子在外加電場作用下產(chǎn)生的離子電遷移運動破壞了溶液中的電荷平衡，造成電荷密度的變化，從而引起局部強電場的出現(xiàn)，而強電場具有在過冷水中誘發(fā)冰核形成的作用。另外“離子碰撞假說［15］提出了在含鹽水溶液中離子在電場中獲得能量，并與冰晶產(chǎn)生碰撞，吸附在生長界面的水分子受到離子碰撞的沖擊而脫離生長界面重新回到液相狀態(tài)，生長界面上水分子濃度減小，減緩冰晶的生長速度，從而抑制了冰晶的生長。

通過對本實驗結(jié)果的分析可以得到，在冷凍過程中施加1 MHz的交變電場能夠抑制雞血紅細胞懸液中純水冰晶的形成、離子偏析大幅減少，促進含鹽冰結(jié)構(gòu)的形成，從而避免紅細胞在慢速冷凍過程中“溶質(zhì)損傷”［16］。因此生物材料低溫保存過程中施加一定頻率的交變電場對保持細胞完整無損是非常有益的。將交變電場應用于生物材料的低溫保存將是一種生物材料低溫保存中的創(chuàng)新技術(shù)，開拓了電介質(zhì)物理新的應用前景。

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