孟 杰， 陳 輝， 樊子雙， 陳曉寧， 田喜鳳

(1.承德護理職業(yè)學院， 河北 承德 067000 2.河北省承德市醫(yī)學情報站， 河北 承德 067000 3.承 德 醫(yī) 學 院， 河北 承德 067000 4.河北聯(lián)合大學生命科學學院， 河北 唐山 063000)

肺孢子菌(Pneumocystis)是一種機會致病性病原體，于1909年被Chagas首次在豚鼠體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的，曾被命名為卡氏肺孢子蟲(Pneumocystis carinii)［1］簡稱肺孢子蟲。隨著分子水平的研究，20世紀80年代以后，此蟲被更名為肺孢子菌［2］，由其引起的肺炎仍稱為肺孢子菌肺炎(Pneumocystis carinii pneumonia，PCP)。隨著AIDS的出現(xiàn)、惡性腫瘤患者放、化療及器官移植的廣泛開展，PCP發(fā)病率呈明顯上升趨勢，引起國內(nèi)外廣泛的關(guān)注。本文就PCP的實驗室診斷現(xiàn)狀展開綜述。

1 肺孢子菌生活史

肺孢子菌生活史包括滋養(yǎng)體、囊前期和包囊三個時期。①滋養(yǎng)體:早期呈球形或卵圓形，逐漸變大并呈多態(tài)。長徑1－5μm。②囊前期:是滋養(yǎng)體與包囊的中間階段，多為卵圓形，直徑4－6μm，主要位于細胞核附近。③包囊:圓形或橢圓形，直徑6－7μm，由三層構(gòu)成，內(nèi)層為單位膜，中間為電子透明層，最外層為電子致密層。成熟包囊內(nèi)含有8個囊內(nèi)小體，少數(shù)包囊囊內(nèi)小體缺失［3］，特別是艾滋病人在經(jīng)SMZ治療后，肺孢子菌囊壁破裂或囊壁不完整甚至消失，肺孢子菌可呈現(xiàn)復雜形態(tài)。

2 標本采集

2.1 痰液:痰液是檢測PC最易獲得的標本，而且沒有損傷，但臨床PCP患者常表現(xiàn)為干咳、少痰和無痰，收集足量痰液標本存在困難，因此檢出率很低。為收集到足量痰液，有人采用3%－5%的高滲鹽水超聲霧化吸入誘導排痰［4］。因痰中常混有大量粘液，可用NaOH 于 37℃水浴消化 0.5－1h后離心，4000－5000轉(zhuǎn)/min，然后取沉淀物涂片染色鏡檢。盡管其檢出率、敏感性高低不一，且臨床實際操作及染色過程有待改進，但仍然為目前診斷PCP的安全快速的方法。

2.2 口腔含漱液:當PCP病人痰液標本較少，而超聲霧化誘導排痰又要求在特殊房間進行，為防止病原體通過空氣播散，Helweg－Larsen［5］等對 28 例 AIDS 合并PCP的患者同時做了口腔含漱液與支氣管肺泡灌洗液的檢測，經(jīng)PCR方法檢測口腔含漱液敏感性為71%，特異性為100%;支氣管肺泡灌洗液的敏感性和特異性分別為96%、100%。因此他們認為口腔含漱液可作為臨床標本為PCP的診斷提供依據(jù)。

2.3 支氣管肺泡灌洗液:支氣管肺泡灌洗液是一種通過纖維支氣管鏡，向肺內(nèi)灌入無菌生理鹽水，反復多次回收灌洗液約10－30mL，經(jīng)4000轉(zhuǎn)/min離心20min，取沉淀物檢查的方法。BALF被廣泛應用于細胞學與病原體檢查，因此BALF標本檢查的陽性率比較高［6］。但BALF操作既要求患者能夠耐受，又要求操作人員技術(shù)高超，因此通常是在臨床患者治療需要和條件成熟情況下進行的。

2.4 肺組織活檢:肺組織活檢包括纖維支氣管鏡組織活檢、胸部穿刺和開胸肺組織活檢。在病原體檢測方面較少采用，因為既對患者身體健康存在較大的危害，又對操作人員技術(shù)要求很高。但在必要時還得應用此法，尤其是在動物模型研究方面采用最多［7］，因為肺組織活檢標本的檢出率最高。

3 診斷方法

3.1 病原學診斷

3.1.1 六亞甲基四胺銀染色法(GMS):六亞甲基四胺銀染色液主要成分包括六亞甲基四胺與硝酸銀，溫度穩(wěn)定在60℃，染色效果會比較好。溫度過高，染色液易被氧化變混濁，影響染色效果;溫度過低，染色反應會變慢，染色時間長。背景為淡綠色，肺孢子菌包囊，呈圓形或不規(guī)則形，囊壁染成黑色或棕褐色，部分包囊可見括弧樣結(jié)構(gòu)，或可見核狀物及條索狀結(jié)構(gòu)，囊內(nèi)小體不著色［8］。GMS染色法對包囊有特異的染色特性，但不能識別滋養(yǎng)體與囊內(nèi)小體。是一種簡便快捷的染色方法，現(xiàn)在而被廣泛應用于肺組織印片的染色。

3.1.2 甲苯胺藍染色(TBO):甲苯胺藍染色液主要成分是甲苯胺藍，是一種人工合成染料。背景為淡藍色，包囊壁被染成紫紅色或深藍色，鏡下包囊呈圓形或橢圓型，囊內(nèi)小體不著色，滋養(yǎng)體不著色。此法操作快捷，但PC內(nèi)部結(jié)構(gòu)看不清楚［9］，且易受溫度時間因素影響，故現(xiàn)在很少應用此染色法。

3.1.3 吉姆薩染色法(Giesma):吉姆薩染液是由吉氏染粉，甲醇和甘油配成原液，在經(jīng)磷酸二氫鉀與磷酸氫二鈉配成的緩沖液進行1:20稀釋成為應用染液。方法是將消化離心痰液或BALF經(jīng)甲醇固定后，滴加吉氏染液，靜置30min后油鏡下觀察，包囊內(nèi)小體和滋養(yǎng)體被染成紫紅色，包囊壁不著色。

3.1.4 瑞一姬氏染液復染法(Wright－Giema’s stain):肺孢子菌的滋養(yǎng)體形狀不規(guī)則，散在分布或聚集成群。滋養(yǎng)體的細胞核被染成紫紅色，細胞質(zhì)被染成淡藍色。肺孢子菌的包囊呈圓形或橢圓形，囊壁薄，呈淡藍色，內(nèi)含5－8個囊內(nèi)小體。囊內(nèi)小體呈塊狀或新月形，具有紫紅色的細胞核和淺藍色的細胞質(zhì)。該方法染色步驟簡單、時間短，值得在PCP的診斷中推廣應用。

3.1.5 熒光染色方法:熒光標記染色液法主要原理為標記了經(jīng)純化孢子菌抗體熒光染料，染色時抗體與孢子菌特異結(jié)合，利用熒光顯微鏡觀查到熒光物質(zhì)，進而證明孢子菌的存在。Baselski等［10］使用熒光染色迅速檢查出標本中肺孢子菌的包囊。但該檢查法所需的熒光顯微鏡價格昂貴，難易在國內(nèi)普通實驗室推廣。

3.2 免疫學診斷

3.2.1 乳膠凝聚試驗:在特定條件下將PC抗原與乳膠相連接，使成為顆粒型抗原。這種抗原與PCP患者血清中特異性抗體結(jié)合后，形成抗原-抗體復合物，在有適當電解質(zhì)存在的條件下，經(jīng)過一定時間，乳膠顆粒即凝聚在一起，顯示肉眼可見的凝聚團塊，即為陽性反應，否則為陰性反應。

3.2.2 酶聯(lián)免疫吸附試驗:酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)包括酶標記抗免疫球蛋白測定抗體法(間接法)和雙抗體測定抗原法(夾心法)。正常人血清內(nèi)普遍存在PC天然抗體，況且PCP一般都是發(fā)生在免疫力極其低下或免疫缺陷的病人身上，因此血清抗體的檢測對于早期診斷PCP的價值不大。Yasuoka A［11］等學者報道過一種定量檢測肺孢子蟲抗原標記的血清學方法，稱患者血清中肺孢子蟲囊壁β－葡聚糖水平明顯升高，經(jīng)治療后，β－葡聚糖水平也隨之下降。

3.2.3 免疫熒光法:包括直接免疫熒光抗體試驗(DFA)與間接免疫熒光抗體試驗(IFA)。Rigole［12］比較了DFA和Giemsa、GMS染色的區(qū)別，認為DFA是可信賴的高敏感性和高特異性的方法;Chatterton等使用鼠源性抗原，特別是滋養(yǎng)體抗原，用IFA檢測血清中的PC IgG、IgM、IgA，結(jié)果表明，IFA是檢測血清PC IgG最有效的試驗［13］。此外，Arasteh等研究認為 IFA是診斷HIV陽性患者是否合并PCP的最恰當方法［14］。

3.3 分子生物學診斷

表1 常用引物名稱與堿基序列

3.3.1 聚合酶鏈反應:聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction，PCR)的基本原理是:在人工合成的上、下游各一條由20－30個核苷酸組成的序列特異引物的引導下，以靶DNA為模板，通過變性和退火處理，在DNA聚合酶的作用下，以單核苷酸為原料合成一對引物之間的DNA片段。引物的質(zhì)量是PCR方法成敗的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一。以診斷為目的的PCR反應，一般應選擇待檢測病原體具有特異性的DNA序列。引物序列可人工設計，或用計算機軟件輔助設計。引物設計應遵循具有靶DNA序列特異性、G+C含量適當、引物序列內(nèi)無二級結(jié)構(gòu)形成、一對引物間無互補序列等基本原則。自wakefield等［15］1990年首次報道應用PCR技術(shù)檢測肺孢子蟲以來，由于其具有無創(chuàng)、和很高的陽性率及敏感性，而逐步得到廣泛研究。綜合目前文獻，PCR檢測PC DNA常用的引物名稱與堿基序列見表1。

陳盛霞等［16］以 PAZl02E、PAZl02H 為引物，采用PCR檢測PCP大鼠支氣管肺泡灌洗液PC并與傳統(tǒng)Giesma病原染色法相比較，認為其檢出率較后者高。Nuchprayoon S等學者［17］采用PCR技術(shù)檢測免疫功能受累者是否并發(fā)PCP，認為其可作為早期診斷PCP的實驗室方法。

巢氏PCR即采用兩對引物的兩步PCR，張小娟等學者［18］經(jīng)研究認為巢氏PCR比普通PCR具有更高的敏感性和特異性。在第1對引物引導的擴增反應結(jié)束后，第2對引物結(jié)合在第1次PCR產(chǎn)物內(nèi)部進行第2輪擴增，這使得如果第1次擴增產(chǎn)生了錯誤片斷，則第2次能在錯誤片段上進行引物配對并擴增的概率極低，進一步保證了結(jié)果的可靠性。

Real－time PCR即熒光定時定量PCR，于1966年發(fā)明。Real－time PCR技術(shù)是將熒光基團加入PCR反應體系中，利用熒光信號積累實時監(jiān)測整個PCR過程，對未知模板進行定量分析。與常規(guī)PCR相比，其靈敏性與特異性均更高、更強。目前已廣泛應用于醫(yī)學研究領域。

3.3.2 核酸探針技術(shù):核酸探針技術(shù)，又稱DNA分子雜交技術(shù)，也是以兩條互補的DNA鏈的變性和復性反應為基礎，其中一條鏈為目的DNA鏈，另一條為標記有指示物的探針鏈。這樣，通過一定方式檢測指示物的存在與否，就可獲知標本中目的DNA的有無。

作為探針的 DNA有多種類型，可源自基因組DNA，也可用基因重組法制備，或是人工合成的寡核苷酸。當獲得DNA模板后，即對他們進行指示物的標記，標記物可以是放射性物質(zhì)，也可是生物素、地高辛等非放射性物質(zhì)。不同的標記物要求相應的顯示方法。用放射性核素標記的探針，需用放射自顯影曝光在X線片上;生物素標記探針可通過ABC系統(tǒng)以酶反應顯色底物指示;地高辛標記探針則是用酶標抗地高辛抗體結(jié)合地高辛后，最終也是以顯色底物指示。

核酸分子雜交的主要方法包括Southern雜交、斑點雜交、Northern 雜交和原位雜交等。Hayashi［19］等以PC rRNA作為分子雜交的靶核酸，設計合成與之互補的生物素化的寡核苷酸探針用于原位雜交，來檢測患者肺組織中的肺孢子菌，結(jié)果其敏感性與特異性都較高，是傳統(tǒng)染色法的有力補充。此后Graves［20］等學者用狹縫雜交檢測肺孢子菌也很敏感。

總之，目前，肺孢子菌肺炎的實驗室診斷方法包括病原學診斷、免疫學診斷和分子生物學診斷三種方法。比較各種檢測肺孢子菌的檢查手段，病原學染色法敏感性最低，檢出率比較低;血清抗體檢測因健康人群普遍攜帶PC抗體而無臨床診斷價值;PCR方法的敏感性最高，能補充傳統(tǒng)染色和免疫組化法，有助于PCP的早期診斷，同時，也為PC的分子水平研究提供了一種有效的手段。但是，PCR檢測技術(shù)可能受到實驗室環(huán)境與操作者經(jīng)驗的影響，可能出現(xiàn)假陽性結(jié)果，需要臨床醫(yī)生根據(jù)病人的臨床表現(xiàn)、胸部X線、血氣分析及肺功能測定等多方面資料來診斷和治療PCP。隨著分子生物學診斷技術(shù)的不斷完善，PCR檢測技術(shù)將對肺孢子菌肺炎的診斷與預防等方面起著積極重要的作用。

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