孟 杰， 陳 輝， 樊子雙， 陳曉寧， 田喜鳳

(1.承德護(hù)理職業(yè)學(xué)院， 河北 承德 067000 2.河北省承德市醫(yī)學(xué)情報(bào)站， 河北 承德 067000 3.承 德 醫(yī) 學(xué) 院， 河北 承德 067000 4.河北聯(lián)合大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院， 河北 唐山 063000)

肺孢子菌(Pneumocystis)是一種機(jī)會(huì)致病性病原體，于1909年被Chagas首次在豚鼠體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的，曾被命名為卡氏肺孢子蟲(chóng)(Pneumocystis carinii)［1］簡(jiǎn)稱肺孢子蟲(chóng)。隨著分子水平的研究，20世紀(jì)80年代以后，此蟲(chóng)被更名為肺孢子菌［2］，由其引起的肺炎仍稱為肺孢子菌肺炎(Pneumocystis carinii pneumonia，PCP)。隨著AIDS的出現(xiàn)、惡性腫瘤患者放、化療及器官移植的廣泛開(kāi)展，PCP發(fā)病率呈明顯上升趨勢(shì)，引起國(guó)內(nèi)外廣泛的關(guān)注。本文就PCP的實(shí)驗(yàn)室診斷現(xiàn)狀展開(kāi)綜述。

1 肺孢子菌生活史

肺孢子菌生活史包括滋養(yǎng)體、囊前期和包囊三個(gè)時(shí)期。①滋養(yǎng)體:早期呈球形或卵圓形，逐漸變大并呈多態(tài)。長(zhǎng)徑1－5μm。②囊前期:是滋養(yǎng)體與包囊的中間階段，多為卵圓形，直徑4－6μm，主要位于細(xì)胞核附近。③包囊:圓形或橢圓形，直徑6－7μm，由三層構(gòu)成，內(nèi)層為單位膜，中間為電子透明層，最外層為電子致密層。成熟包囊內(nèi)含有8個(gè)囊內(nèi)小體，少數(shù)包囊囊內(nèi)小體缺失［3］，特別是艾滋病人在經(jīng)SMZ治療后，肺孢子菌囊壁破裂或囊壁不完整甚至消失，肺孢子菌可呈現(xiàn)復(fù)雜形態(tài)。

2 標(biāo)本采集

2.1 痰液:痰液是檢測(cè)PC最易獲得的標(biāo)本，而且沒(méi)有損傷，但臨床PCP患者常表現(xiàn)為干咳、少痰和無(wú)痰，收集足量痰液標(biāo)本存在困難，因此檢出率很低。為收集到足量痰液，有人采用3%－5%的高滲鹽水超聲霧化吸入誘導(dǎo)排痰［4］。因痰中常混有大量粘液，可用NaOH 于 37℃水浴消化 0.5－1h后離心，4000－5000轉(zhuǎn)/min，然后取沉淀物涂片染色鏡檢。盡管其檢出率、敏感性高低不一，且臨床實(shí)際操作及染色過(guò)程有待改進(jìn)，但仍然為目前診斷PCP的安全快速的方法。

2.2 口腔含漱液:當(dāng)PCP病人痰液標(biāo)本較少，而超聲霧化誘導(dǎo)排痰又要求在特殊房間進(jìn)行，為防止病原體通過(guò)空氣播散，Helweg－Larsen［5］等對(duì) 28 例 AIDS 合并PCP的患者同時(shí)做了口腔含漱液與支氣管肺泡灌洗液的檢測(cè)，經(jīng)PCR方法檢測(cè)口腔含漱液敏感性為71%，特異性為100%;支氣管肺泡灌洗液的敏感性和特異性分別為96%、100%。因此他們認(rèn)為口腔含漱液可作為臨床標(biāo)本為PCP的診斷提供依據(jù)。

2.3 支氣管肺泡灌洗液:支氣管肺泡灌洗液是一種通過(guò)纖維支氣管鏡，向肺內(nèi)灌入無(wú)菌生理鹽水，反復(fù)多次回收灌洗液約10－30mL，經(jīng)4000轉(zhuǎn)/min離心20min，取沉淀物檢查的方法。BALF被廣泛應(yīng)用于細(xì)胞學(xué)與病原體檢查，因此BALF標(biāo)本檢查的陽(yáng)性率比較高［6］。但BALF操作既要求患者能夠耐受，又要求操作人員技術(shù)高超，因此通常是在臨床患者治療需要和條件成熟情況下進(jìn)行的。

2.4 肺組織活檢:肺組織活檢包括纖維支氣管鏡組織活檢、胸部穿刺和開(kāi)胸肺組織活檢。在病原體檢測(cè)方面較少采用，因?yàn)榧葘?duì)患者身體健康存在較大的危害，又對(duì)操作人員技術(shù)要求很高。但在必要時(shí)還得應(yīng)用此法，尤其是在動(dòng)物模型研究方面采用最多［7］，因?yàn)榉谓M織活檢標(biāo)本的檢出率最高。

3 診斷方法

3.1 病原學(xué)診斷

3.1.1 六亞甲基四胺銀染色法(GMS):六亞甲基四胺銀染色液主要成分包括六亞甲基四胺與硝酸銀，溫度穩(wěn)定在60℃，染色效果會(huì)比較好。溫度過(guò)高，染色液易被氧化變混濁，影響染色效果;溫度過(guò)低，染色反應(yīng)會(huì)變慢，染色時(shí)間長(zhǎng)。背景為淡綠色，肺孢子菌包囊，呈圓形或不規(guī)則形，囊壁染成黑色或棕褐色，部分包囊可見(jiàn)括弧樣結(jié)構(gòu)，或可見(jiàn)核狀物及條索狀結(jié)構(gòu)，囊內(nèi)小體不著色［8］。GMS染色法對(duì)包囊有特異的染色特性，但不能識(shí)別滋養(yǎng)體與囊內(nèi)小體。是一種簡(jiǎn)便快捷的染色方法，現(xiàn)在而被廣泛應(yīng)用于肺組織印片的染色。

3.1.2 甲苯胺藍(lán)染色(TBO):甲苯胺藍(lán)染色液主要成分是甲苯胺藍(lán)，是一種人工合成染料。背景為淡藍(lán)色，包囊壁被染成紫紅色或深藍(lán)色，鏡下包囊呈圓形或橢圓型，囊內(nèi)小體不著色，滋養(yǎng)體不著色。此法操作快捷，但PC內(nèi)部結(jié)構(gòu)看不清楚［9］，且易受溫度時(shí)間因素影響，故現(xiàn)在很少應(yīng)用此染色法。

3.1.3 吉姆薩染色法(Giesma):吉姆薩染液是由吉氏染粉，甲醇和甘油配成原液，在經(jīng)磷酸二氫鉀與磷酸氫二鈉配成的緩沖液進(jìn)行1:20稀釋成為應(yīng)用染液。方法是將消化離心痰液或BALF經(jīng)甲醇固定后，滴加吉氏染液，靜置30min后油鏡下觀察，包囊內(nèi)小體和滋養(yǎng)體被染成紫紅色，包囊壁不著色。

3.1.4 瑞一姬氏染液復(fù)染法(Wright－Giema’s stain):肺孢子菌的滋養(yǎng)體形狀不規(guī)則，散在分布或聚集成群。滋養(yǎng)體的細(xì)胞核被染成紫紅色，細(xì)胞質(zhì)被染成淡藍(lán)色。肺孢子菌的包囊呈圓形或橢圓形，囊壁薄，呈淡藍(lán)色，內(nèi)含5－8個(gè)囊內(nèi)小體。囊內(nèi)小體呈塊狀或新月形，具有紫紅色的細(xì)胞核和淺藍(lán)色的細(xì)胞質(zhì)。該方法染色步驟簡(jiǎn)單、時(shí)間短，值得在PCP的診斷中推廣應(yīng)用。

3.1.5 熒光染色方法:熒光標(biāo)記染色液法主要原理為標(biāo)記了經(jīng)純化孢子菌抗體熒光染料，染色時(shí)抗體與孢子菌特異結(jié)合，利用熒光顯微鏡觀查到熒光物質(zhì)，進(jìn)而證明孢子菌的存在。Baselski等［10］使用熒光染色迅速檢查出標(biāo)本中肺孢子菌的包囊。但該檢查法所需的熒光顯微鏡價(jià)格昂貴，難易在國(guó)內(nèi)普通實(shí)驗(yàn)室推廣。

3.2 免疫學(xué)診斷

3.2.1 乳膠凝聚試驗(yàn):在特定條件下將PC抗原與乳膠相連接，使成為顆粒型抗原。這種抗原與PCP患者血清中特異性抗體結(jié)合后，形成抗原-抗體復(fù)合物，在有適當(dāng)電解質(zhì)存在的條件下，經(jīng)過(guò)一定時(shí)間，乳膠顆粒即凝聚在一起，顯示肉眼可見(jiàn)的凝聚團(tuán)塊，即為陽(yáng)性反應(yīng)，否則為陰性反應(yīng)。

3.2.2 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn):酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)包括酶標(biāo)記抗免疫球蛋白測(cè)定抗體法(間接法)和雙抗體測(cè)定抗原法(夾心法)。正常人血清內(nèi)普遍存在PC天然抗體，況且PCP一般都是發(fā)生在免疫力極其低下或免疫缺陷的病人身上，因此血清抗體的檢測(cè)對(duì)于早期診斷PCP的價(jià)值不大。Yasuoka A［11］等學(xué)者報(bào)道過(guò)一種定量檢測(cè)肺孢子蟲(chóng)抗原標(biāo)記的血清學(xué)方法，稱患者血清中肺孢子蟲(chóng)囊壁β－葡聚糖水平明顯升高，經(jīng)治療后，β－葡聚糖水平也隨之下降。

3.2.3 免疫熒光法:包括直接免疫熒光抗體試驗(yàn)(DFA)與間接免疫熒光抗體試驗(yàn)(IFA)。Rigole［12］比較了DFA和Giemsa、GMS染色的區(qū)別，認(rèn)為DFA是可信賴的高敏感性和高特異性的方法;Chatterton等使用鼠源性抗原，特別是滋養(yǎng)體抗原，用IFA檢測(cè)血清中的PC IgG、IgM、IgA，結(jié)果表明，IFA是檢測(cè)血清PC IgG最有效的試驗(yàn)［13］。此外，Arasteh等研究認(rèn)為 IFA是診斷HIV陽(yáng)性患者是否合并PCP的最恰當(dāng)方法［14］。

3.3 分子生物學(xué)診斷

表1 常用引物名稱與堿基序列

3.3.1 聚合酶鏈反應(yīng):聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)的基本原理是:在人工合成的上、下游各一條由20－30個(gè)核苷酸組成的序列特異引物的引導(dǎo)下，以靶DNA為模板，通過(guò)變性和退火處理，在DNA聚合酶的作用下，以單核苷酸為原料合成一對(duì)引物之間的DNA片段。引物的質(zhì)量是PCR方法成敗的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一。以診斷為目的的PCR反應(yīng)，一般應(yīng)選擇待檢測(cè)病原體具有特異性的DNA序列。引物序列可人工設(shè)計(jì)，或用計(jì)算機(jī)軟件輔助設(shè)計(jì)。引物設(shè)計(jì)應(yīng)遵循具有靶DNA序列特異性、G+C含量適當(dāng)、引物序列內(nèi)無(wú)二級(jí)結(jié)構(gòu)形成、一對(duì)引物間無(wú)互補(bǔ)序列等基本原則。自wakefield等［15］1990年首次報(bào)道應(yīng)用PCR技術(shù)檢測(cè)肺孢子蟲(chóng)以來(lái)，由于其具有無(wú)創(chuàng)、和很高的陽(yáng)性率及敏感性，而逐步得到廣泛研究。綜合目前文獻(xiàn)，PCR檢測(cè)PC DNA常用的引物名稱與堿基序列見(jiàn)表1。

陳盛霞等［16］以 PAZl02E、PAZl02H 為引物，采用PCR檢測(cè)PCP大鼠支氣管肺泡灌洗液PC并與傳統(tǒng)Giesma病原染色法相比較，認(rèn)為其檢出率較后者高。Nuchprayoon S等學(xué)者［17］采用PCR技術(shù)檢測(cè)免疫功能受累者是否并發(fā)PCP，認(rèn)為其可作為早期診斷PCP的實(shí)驗(yàn)室方法。

巢氏PCR即采用兩對(duì)引物的兩步PCR，張小娟等學(xué)者［18］經(jīng)研究認(rèn)為巢氏PCR比普通PCR具有更高的敏感性和特異性。在第1對(duì)引物引導(dǎo)的擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后，第2對(duì)引物結(jié)合在第1次PCR產(chǎn)物內(nèi)部進(jìn)行第2輪擴(kuò)增，這使得如果第1次擴(kuò)增產(chǎn)生了錯(cuò)誤片斷，則第2次能在錯(cuò)誤片段上進(jìn)行引物配對(duì)并擴(kuò)增的概率極低，進(jìn)一步保證了結(jié)果的可靠性。

Real－time PCR即熒光定時(shí)定量PCR，于1966年發(fā)明。Real－time PCR技術(shù)是將熒光基團(tuán)加入PCR反應(yīng)體系中，利用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR過(guò)程，對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析。與常規(guī)PCR相比，其靈敏性與特異性均更高、更強(qiáng)。目前已廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域。

3.3.2 核酸探針技術(shù):核酸探針技術(shù)，又稱DNA分子雜交技術(shù)，也是以兩條互補(bǔ)的DNA鏈的變性和復(fù)性反應(yīng)為基礎(chǔ)，其中一條鏈為目的DNA鏈，另一條為標(biāo)記有指示物的探針鏈。這樣，通過(guò)一定方式檢測(cè)指示物的存在與否，就可獲知標(biāo)本中目的DNA的有無(wú)。

作為探針的 DNA有多種類型，可源自基因組DNA，也可用基因重組法制備，或是人工合成的寡核苷酸。當(dāng)獲得DNA模板后，即對(duì)他們進(jìn)行指示物的標(biāo)記，標(biāo)記物可以是放射性物質(zhì)，也可是生物素、地高辛等非放射性物質(zhì)。不同的標(biāo)記物要求相應(yīng)的顯示方法。用放射性核素標(biāo)記的探針，需用放射自顯影曝光在X線片上;生物素標(biāo)記探針可通過(guò)ABC系統(tǒng)以酶反應(yīng)顯色底物指示;地高辛標(biāo)記探針則是用酶標(biāo)抗地高辛抗體結(jié)合地高辛后，最終也是以顯色底物指示。

核酸分子雜交的主要方法包括Southern雜交、斑點(diǎn)雜交、Northern 雜交和原位雜交等。Hayashi［19］等以PC rRNA作為分子雜交的靶核酸，設(shè)計(jì)合成與之互補(bǔ)的生物素化的寡核苷酸探針用于原位雜交，來(lái)檢測(cè)患者肺組織中的肺孢子菌，結(jié)果其敏感性與特異性都較高，是傳統(tǒng)染色法的有力補(bǔ)充。此后Graves［20］等學(xué)者用狹縫雜交檢測(cè)肺孢子菌也很敏感。

總之，目前，肺孢子菌肺炎的實(shí)驗(yàn)室診斷方法包括病原學(xué)診斷、免疫學(xué)診斷和分子生物學(xué)診斷三種方法。比較各種檢測(cè)肺孢子菌的檢查手段，病原學(xué)染色法敏感性最低，檢出率比較低;血清抗體檢測(cè)因健康人群普遍攜帶PC抗體而無(wú)臨床診斷價(jià)值;PCR方法的敏感性最高，能補(bǔ)充傳統(tǒng)染色和免疫組化法，有助于PCP的早期診斷，同時(shí)，也為PC的分子水平研究提供了一種有效的手段。但是，PCR檢測(cè)技術(shù)可能受到實(shí)驗(yàn)室環(huán)境與操作者經(jīng)驗(yàn)的影響，可能出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果，需要臨床醫(yī)生根據(jù)病人的臨床表現(xiàn)、胸部X線、血?dú)夥治黾胺喂δ軠y(cè)定等多方面資料來(lái)診斷和治療PCP。隨著分子生物學(xué)診斷技術(shù)的不斷完善，PCR檢測(cè)技術(shù)將對(duì)肺孢子菌肺炎的診斷與預(yù)防等方面起著積極重要的作用。

［1］ Redhead SA，Cushion MT，F(xiàn)renkel JK，et al.Pneumocystis and Trypanosomacruzi:nomenclature and typifications［J］.Eukalyot Microbiol，2006，53(1):2－11.

［2］ Edman JC，Kovacs JA，Masur H，et al.Ribosomal RNA sequence shows Pneumocystis carinii to be a member of the fungi［J］.Nature，1988，334(8):519－522.

［3］ 王建成，郭增柱.卡氏肺孢子蟲(chóng)肺炎實(shí)驗(yàn)室診斷研究進(jìn)展［J］.臨床和實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2002，1(3):193－196.

［4］ Wakefield AE，Guiver L，Miller RF，et al.DNA amplification on induced sputum samples for diagnosis of Pneumocystis carinii pneumonia［J］.Lancet，1991，337:1378－1379.

［5］ Helweg－Larsen J，Jensen JS，Benfield T，et al.Diagnostic use of PCR for detection of Pneumocystis carinii in oral wash samples［J］.Clin Microbiol，1998，36:2068－2072.

［6］ Ribes JA，Limper AH，Espy MJ，et al.PCR detection of Pneumocystis carinii in bronchoalveolar lavage specimens:analysis of sensitivity and specificity［J］.Clin Microbiol，1997，35:830－835.

［7］ 周永華，高琪，胡玉紅，等.大鼠肺孢子蟲(chóng)肺炎動(dòng)物模型的實(shí)驗(yàn)研究［J］.中國(guó)血吸蟲(chóng)病防治雜志，2006，18(5):374－377.

［8］ 周必英，戴曉煌，萬(wàn)啟惠.肺孢子蟲(chóng)六胺銀染色方法的改進(jìn)［J］.遵義醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2005，28(2):177－178.

［9］ 陳敬捷，何晗，蘇凌松，等.艾滋病合并肺孢子蟲(chóng)肺炎的實(shí)驗(yàn)室診斷方法進(jìn)展［J］.中國(guó)臨床新醫(yī)學(xué)，2011，4(6):

570－573.

［10］ Baselski VS，Robison MK，Pifer LW.Rapid detection of Pneumocystis carinii in bronchoalveolar lavage samples by using cellufluor staining［J］.Clin Microbiol，1992，30(3):754.

［11］ Yasuoka A，Tachikawa N，Shimada K，et al.Beta－D－glucan as a quantitative serological marker for Pneumocystis carinii pneumonia［J］.Clin Diagn Lab Immunol，1996，3(2):197－199.

［12］ Riqole P，Basset D，Dedet JP.Biological diagnosis of pneumocystis infection.Evaluation and value of a new direct immunofluorescent technique［J］.Pathol Biol Paris，1997，45(1):19－23.

［13］ Chaterton JMW，Joss AWL，Pennington TH，et a1.Usefulness of rat－derived antigen in the serodiagnosis of Pneumocystis carinii infection［J］.Med Microbiol，1999，48(7):681－688.

［14］ Arasteh KN，Simmon Y，Musch R，et a1.Sensitivity and specificity of indirect immunofluorescence and Grocot－technique in comparision with immunocytology(alkaline phosphatase anti alkaline phosphatase=APAAP)for the diagnosis of Pneumocystis carinii in broncho－alveolar lavage(BAL)［J］.Eur Med Res，1998，3(12):559－560.

［15］ Wakefield AE，Pixley FJ，Banerji S，et al.Detection of Pneumocystis carinii with DNA amplification［J］.Lancet，1990，336(8):451－453.

［16］ 陳盛霞，姜旭，徐會(huì)娟，等.PCR檢測(cè)大鼠卡氏肺孢子蟲(chóng)的研究［J］.中國(guó)人獸共患病雜志，2004，20(10):891－893.

［17］ Nuchprayoon S，Saksirisampant W，Jaijakul S，et al.Flinders Technology Associates(FTA)filter paper－based DNA extraction with polymerase chain reaction(PCR)for detection of Pneumocystis jirovecii from respiratory specimens of immunocompromised patients［J］.Clin Lab Anal，2007，21(6):382－386.

［18］ 張小娟，楊芳芳，歐陽(yáng)頤，等.巢氏PCR早期檢測(cè)實(shí)驗(yàn)大鼠卡氏肺孢子蟲(chóng)［J］.國(guó)際醫(yī)學(xué)寄生蟲(chóng)病雜志，2011，38(1):10－13.

［19］ Hayashi Y，Watanbe J，Nakata K，et al.A novel diagnostic method of Pneumocystis carinii.In situ hybridization of ribosomal ribonucleic acid with biotinylated oligonucleotide probes［J］.Lab Invest，1990，63(4):576－580.

［20］ Graves DC，Chary－Reddy S，Becker－Hapak M，et al.Detection of Pneumocystis carinii in induced sputa from immunocompromised patients using a repetitive DNA probe［J］.Mol Cell Probes，1997，11(1):1－9.