馬懷良，龔振杰，柴軍紅，彌春霞，孫佳琦，郭文學(xué)

（1.牡丹江師范學(xué)院生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，黑龍江 牡丹江 157012；2.牡丹江市綠珠果蔬技術(shù)開(kāi)發(fā)有限責(zé)任公司，黑龍江 牡丹江 157000）

我國(guó)黑木耳產(chǎn)量居世界之首位，占世界總產(chǎn)量的90%以上，每年產(chǎn)生大量的菌糠，除一小部分被用作飼料、餌料及燃料外，絕大部分被丟棄，造成資源浪費(fèi)并嚴(yán)重污染環(huán)境[1]。據(jù)研究，黑木耳菌糠中含有一定量纖維素酶[2]和木聚糖酶[3]，因此開(kāi)發(fā)黑木耳菌糠中的纖維素酶和木聚糖酶，對(duì)于提高黑木耳行業(yè)收入，促進(jìn)黑木耳行業(yè)良性發(fā)展具有重要意義。目前，提取黑木耳菌糠的纖維素酶和木聚糖酶常采用緩沖液浸提法[2]、水浸提法[3]或改良的水浸提法[4]。緩沖液浸提法由于成本高，不適于規(guī)?；a(chǎn)。水浸提法浸提效率低，由于浸提時(shí)間較長(zhǎng)，可能會(huì)造成酶水解；改良的水浸提法用高速組織搗碎機(jī)，菌糠內(nèi)含物釋放較多，黏度高，增加了后續(xù)處理的難度，同樣不利于規(guī)?；a(chǎn)。針對(duì)這種情況，本研究采用超聲波浸提法，優(yōu)化了浸提條件，并對(duì)粗酶液中的纖維素酶、木聚糖酶部分酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了研究，旨在提高浸提效率，為黑木耳菌糠中的纖維素酶和木聚糖酶規(guī)?；a(chǎn)及應(yīng)用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

新鮮黑木耳（Auricularia auricula）菌糠（采收3茬后）由牡丹江市綠珠果蔬技術(shù)開(kāi)發(fā)有限責(zé)任公司提供。黑木耳栽培基質(zhì)為：木屑80%，麩皮10%，米糠6%，玉米粉2%，石膏1%，石灰1%。隨機(jī)取100袋黑木耳菌糠，脫去菌袋，摘掉菌渣表面的菇蕾，用拌料機(jī)攪拌30 min，使其混合均勻。

1.2 主要儀器、試劑及配制方法

722N分光光度計(jì)（上海精密科學(xué)儀器有限公司）；VCX－130型超聲波破碎儀（輸出功率130W）（美國(guó)Sonics公司）；巧生牌中速定量濾紙；羧甲基纖維素鈉（CMC－Na）（Sigma公司）；山毛櫸木聚糖（Sigma公司）；其余試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。pH為5.5的0.1 mol·L－1乙酸－乙酸鈉緩沖溶液、1 mg·mL－1的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液、1mg·mL－1木糖標(biāo)準(zhǔn)溶液、1%羧甲基纖維素鈉溶液、1%山毛櫸木聚糖溶液配制方法參考文獻(xiàn)[6]；3，5－二硝基水楊酸（DNS）溶液配制參見(jiàn)文獻(xiàn)[7]。

1.3 超聲條件

1.3.1 單因素試驗(yàn)

以羧甲基纖維素酶活為指標(biāo)，在25℃、工作時(shí)間為15 s、間歇時(shí)間5 s條件下，設(shè)定液料比40∶1，超聲時(shí)間20 min，超聲波振幅（Amplitude）為60%、70%、80%、90%、100%；其它條件不變，設(shè)定液比40∶1，振幅90%，超聲時(shí)間為10、15、20、25、30 min；其它條件不變，設(shè)定振幅90%，超聲時(shí)間為15 min，液料比為20∶1、30∶1、40∶1、50∶1、60∶1。每處理設(shè)三次重復(fù)，計(jì)算平均酶活。

1.3.2 正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，以羧甲基纖維素酶活為指標(biāo)，對(duì)振幅、超聲時(shí)間和液料比進(jìn)行三因素三水平正交試驗(yàn)，每試驗(yàn)號(hào)組合設(shè)置3次重復(fù)，測(cè)定羧甲基纖維素酶活和木聚糖酶活，經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析得出最佳浸提條件。

1.3.3 對(duì)比試驗(yàn)

應(yīng)用兩種方法浸提黑木耳菌糠中的纖維素酶和木聚糖酶：一種采用超聲波法，按1.3.2得出的最佳浸提條件進(jìn)行操作；一種采用水浸提法（對(duì)照），液料比為60∶1，置于恒溫振蕩培養(yǎng)箱中，溫度設(shè)為25 ℃，轉(zhuǎn)速100 r·min－1，浸提24 h。以上兩種方法均設(shè)置5次重復(fù)，測(cè)定羧甲基纖維素酶活和木聚糖酶活。

1.4 粗酶液制備

浸提結(jié)束后，將浸提液在4 000 r·min－1離心20 min后得到的上清液即為粗酶液。

1.5 酶活測(cè)定

羧甲基纖維素酶活（CMCase activity）和濾紙酶活（FPA）測(cè)定方法參見(jiàn)文獻(xiàn)[7]；木聚糖酶活（Xylanase activity）測(cè)定方法在羧甲基纖維素酶活基礎(chǔ)上，將底物換為1%山毛櫸木聚糖溶液、葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液換為木糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，其余相同。

酶活定義：1 g黑木耳菌糠（干重）在50℃、pH 5.5條件下，1 min水解纖維素或木聚糖生成1 μmol葡萄糖或木糖的酶量定義為一個(gè)酶活單位，（IU·g－1）表示。

1.6 部分酶學(xué)性質(zhì)

1.6.1 pH對(duì)纖維素酶和木聚糖酶活的影響

配制pH 4.0～7.2的磷酸氫二鈉－檸檬酸緩沖液[8]，并用pH計(jì)標(biāo)定。在50℃條件下，分別測(cè)定粗酶液不同pH的FPA、羧甲基纖維素酶和木聚糖酶的活力。1.6.2 溫度對(duì)纖維素酶和木聚糖酶活的影響

在1.6.1最佳pH條件下，分別測(cè)定粗酶液不同溫度（30～90℃）的FPA、羧甲基纖維素酶和木聚糖酶的活力。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 振幅對(duì)浸提纖維素酶的影響

如圖1所示，振幅在60%～90%之間，隨著振幅增大，超聲波破碎菌糠菌絲細(xì)胞壁作用增加，有助于纖維素酶溶出。振幅為100%時(shí)，羧甲基纖維素酶活下降，其原因可能是超聲波劇烈振動(dòng)破壞部分纖維素酶結(jié)構(gòu)；另外，超聲作用進(jìn)一步加速了浸提液的流動(dòng)，從而減少了物料在超聲場(chǎng)中的停留時(shí)間，破壁作用也就隨之減弱[5]。

圖1 振幅對(duì)浸提羧甲基纖維素酶活性的影響Fig.1 Effects of amplitude on extracting CMCase

2.1.2 超聲時(shí)間對(duì)浸提纖維素酶的影響

如圖2所示，時(shí)間在5～15 min之間，隨著時(shí)間延長(zhǎng)，菌絲細(xì)胞壁破碎度增加，羧甲基纖維素酶溶出量增加。當(dāng)時(shí)間長(zhǎng)于15 min，羧甲基纖維素酶活下降，這可能是時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，導(dǎo)致雜質(zhì)溶出較多，抑制了酶活；或者超聲波機(jī)械剪切作用破壞了酶分子結(jié)構(gòu)。

2.1.3 液料比對(duì)浸提纖維素酶的影響

如圖3所示，當(dāng)液料比小于50∶1時(shí)，隨著液料比增加，羧甲基纖維素酶活呈增加的趨勢(shì)，原因是浸提液體積越大，溶劑與菌糠接觸越充分，在相同時(shí)間內(nèi)溶解出更多的酶。當(dāng)液料比高于50∶1時(shí)，羧甲基纖維素酶活下降，這可能是液料比過(guò)大，會(huì)消耗更多的時(shí)間和能量，增加超聲波破碎細(xì)胞的阻力，使細(xì)胞破碎程度下降[5]，使酶的得率減少；也可能是液料比過(guò)大，浸提液中酶的濃度下降，致使降解底物速率較慢，導(dǎo)致酶活下降。

圖2 超聲時(shí)間對(duì)浸提羧甲基纖維素酶活性的影響Fig.2 Effects of processing time on extracting CMCase

圖3 液料比對(duì)浸提羧甲基纖維素酶活性的影響Fig.3 Effects of liquid-material ratio on extracting CMCase

2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果

以羧甲基纖維素酶活和木聚糖酶活為指標(biāo)，對(duì)振幅、超聲時(shí)間和液料比進(jìn)行L9（33）正交試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表1。極差分析結(jié)果表明，影響浸提的主次順序?yàn)椋阂毫媳龋菊穹緯r(shí)間。從多重比較結(jié)果來(lái)看，超聲波浸提黑木耳菌糠纖維素酶和木聚糖酶的最佳條件為：振幅90%、時(shí)間15 min、液料比為60∶1。

2.3 對(duì)比試驗(yàn)

采用超聲波法浸提的纖維素酶活為平均值為7.500 IU·g－1，木聚糖酶活平均值為 4.921 IU·g－1；采用水浸提的纖維素酶活平均值為3.542 IU·g－1，木聚糖酶活平均值為1.818 IU·g－1。因此，超聲法浸提黑木耳菌糠纖維素酶和木聚糖酶酶活明顯優(yōu)于水浸提法（P＜0.01）。

表1 正交試驗(yàn)結(jié)果Table 1 Results of orthogonal experiments

2.4 部分酶學(xué)性質(zhì)

2.4.1 pH對(duì)纖維素酶和木聚糖酶活的影響

結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 pH對(duì)纖維素酶和木聚糖酶活性的影響Fig.4 Effects of pH on cellulase and xylanase acitivities

如圖4所示，羧甲基纖維素酶在pH4.0～5.2具有較高的酶活，最適pH為4.4，pH＞4.4時(shí)，酶活下降，至pH 6.4時(shí)酶活喪失；濾紙酶活在5.2、6.4及6.8時(shí)酶活較高，最適pH為5.2；木聚糖酶在4.0、4.8～6.8具有較高的酶活，說(shuō)明此酶pH穩(wěn)定范圍較寬，最適pH為4.8。

2.4.2 溫度對(duì)纖維素酶和木聚糖酶活的影響

結(jié)果見(jiàn)圖5。

圖5 溫度對(duì)纖維素酶和木聚糖酶活性的影響Fig.5 Effects of temperature on cellulase and xylanase acitivities

如圖5所示，羧甲基纖維素酶活（pH 4.4）和濾紙酶活（pH 5.2）在40～80℃酶活較高，最適溫度為60℃；木聚糖酶活（pH 4.8）在30～60℃酶活較高，最適溫度為50℃。

3 討論與結(jié)論

超聲波浸提黑木耳中的菌糠纖維素酶和木聚糖酶最佳條件為：振幅90%、時(shí)間15 min、液料比為60∶1；影響浸提的主次順序?yàn)橐毫媳龋菊穹緯r(shí)間；從浸提時(shí)間和酶活來(lái)看，超聲波浸提明顯高于水浸提法，具有較大的應(yīng)用價(jià)值，適于規(guī)?；⒐S化生產(chǎn)。

黑木耳浸提液中纖維素酶和木聚糖酶部分酶學(xué)性質(zhì)為：羧甲基纖維素酶最適pH為4.4、最適溫度為60℃；濾紙酶最適pH為5.2、最適溫度為60℃；木聚糖酶最適pH為4.8、最適溫度為50℃。

粗酶液中木聚糖酶在pH 4.0、4.8～6.8范圍內(nèi)，其酶活比較穩(wěn)定，應(yīng)用粗酶液時(shí)只需調(diào)整濾紙酶的pH即可，十分有利于粗酶液應(yīng)用；濾紙酶在pH 5.2、6.4、6.8，酶活較高，特別是pH 6.8接近于中性，應(yīng)用時(shí)可節(jié)省調(diào)節(jié)pH的化學(xué)藥品，可進(jìn)一步降低成本。

在本研究中，濾紙酶具有較高的酶活，表明黑木耳菌糠纖維素酶分解天然纖維素的能力較強(qiáng)，特別是當(dāng)pH≥6.4時(shí)，羧甲基纖維素酶活降為零，而濾紙酶活仍然較高，因此有必要對(duì)黑木耳菌糠纖維素酶系間協(xié)同效應(yīng)進(jìn)行研究探討。

目前在生產(chǎn)及應(yīng)用時(shí)，評(píng)價(jià)纖維素酶活的高低，常以羧甲基纖維素酶為主要指標(biāo)，但從本研究來(lái)看，纖維素酶活測(cè)定應(yīng)以濾紙酶活為主[9]。

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[8]劉葉青.生物分離工程實(shí)驗(yàn)[M].北京：高等教育出版社,2007:187－188.

[9]馬懷良,郭文學(xué),柴軍紅.常溫高效纖維素分解菌的篩選[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2010,41(1):52－55.