陳 合, 李串娜, 舒國(guó)偉

(陜西科技大學(xué) 生命科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 西安 710021)

0 引言

保加利亞乳桿菌(Lactobacillusbulgaricus,LB) 為人體乳酸菌益生菌[1]，被廣泛應(yīng)用于食品發(fā)酵、乳酸飲料行業(yè)、飼料行業(yè)和醫(yī)療保健等領(lǐng)域[2].它能夠調(diào)節(jié)人體胃腸道微生態(tài)平衡、促進(jìn)消化吸收、增強(qiáng)免疫功能、抗癌抗腫瘤等重要的生理保健功能，因而受到越來(lái)越多消費(fèi)者的喜愛和重視[3,4].

保加利亞乳桿菌是酸奶發(fā)酵常用的菌種之一[5]，在酸奶制作過(guò)程中，選擇發(fā)酵劑極為重要.它直接影響酸奶的生產(chǎn)工藝過(guò)程及質(zhì)量.因此要獲得發(fā)酵活力優(yōu)良的酸奶發(fā)酵劑，首先要培養(yǎng)高濃度乳酸菌，篩選出適合乳酸菌生長(zhǎng)的增殖培養(yǎng)基，使乳酸菌得以大量增殖.

乳酸菌的生長(zhǎng)營(yíng)養(yǎng)要求比較復(fù)雜.需要添加多種促進(jìn)因子，國(guó)內(nèi)有許多對(duì)乳酸菌增殖培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化的報(bào)道[6-8]，多數(shù)是在MRS 培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加一些優(yōu)化因子.MRS培養(yǎng)基是實(shí)驗(yàn)室常用的培養(yǎng)基，但其成本復(fù)雜、價(jià)格昂貴、制備繁瑣，不適合高效濃縮型發(fā)酵劑的工業(yè)化生產(chǎn)[9].

Plackett-Burman(PB)設(shè)計(jì)法是一種兩水平的試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法.該方法用最少的試驗(yàn)次數(shù)達(dá)到對(duì)因素的主效應(yīng)盡可能精確的估計(jì)，適用于從眾多的考察因素中快速有效地篩選出最為重要的幾個(gè)因素，以供進(jìn)一步的研究[10].PB試驗(yàn)設(shè)計(jì)目前已經(jīng)廣泛應(yīng)用于生物工藝的優(yōu)化中，如乳酸生產(chǎn)[11]、益生菌生長(zhǎng)主要影響因子的篩選[12]、杯傘菌產(chǎn)胞外多糖主要因子的篩選[13]、產(chǎn)α-葡萄糖苷酶抑制劑主要因子的篩選[14]等.另外，該方法還具有數(shù)據(jù)處理簡(jiǎn)單，適用于任意多個(gè)實(shí)驗(yàn)因子的優(yōu)點(diǎn).

本研究以保加利亞乳桿菌為出發(fā)菌株，以廉價(jià)易得的原料作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，通過(guò)PB實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化篩選出對(duì)其生長(zhǎng)影響較為顯著的幾種氮源，為工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)濃縮型發(fā)酵劑提供理論基礎(chǔ)和參考依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

保加利亞乳桿菌，實(shí)驗(yàn)室提供.

1.1.2 主要試劑與儀器

主要試劑：胰蛋白胨，酪蛋白水解物，大豆蛋白胨，新生牛血清及以下培養(yǎng)基中所用試劑均為生化試劑級(jí).

儀器：SW-CJ-1F 無(wú)菌操作臺(tái)，蘇州凈化；DH5000AB 電熱恒溫培養(yǎng)箱，天津市泰斯特儀器有限公司；手提式蒸汽壓力滅菌器，江陰濱江醫(yī)療器械廠；722 型光柵分光光度計(jì)，上海第三分析儀器廠；PHS-3C 型酸度計(jì)，上海精科儀器公司；電熱鼓風(fēng)干燥箱，天津泰斯特儀器有限公司.

1.1.3 培養(yǎng)基

(1)MRS培養(yǎng)基(g/100 mL)：葡萄糖2 g，蛋白胨1 g，牛肉膏0.8 g，酵母浸粉0.4 g，檸檬酸二銨0.2 g，磷酸氫二鉀0.2 g，乙酸鈉0.5 g，MgSO40.02 g，MnSO40.004 g，吐溫-80 0.1 mL.用于菌種的活化和計(jì)數(shù).

(2)發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基(g/100 mL)：葡萄糖5.43 g，蛋白胨1 g，磷酸氫二鉀0.6 g.用于菌種的培養(yǎng).

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 工藝流程

菌種活化→基礎(chǔ)培養(yǎng)基培養(yǎng)(不同氮源的選擇)→調(diào)節(jié)pH→液體培養(yǎng)→取樣制平板→活菌計(jì)數(shù).

1.2.2 菌種活化方法

MRS培養(yǎng)基經(jīng)118 ℃滅菌15 min備用，然后將LB以2%的接種量接種于MRS培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫培養(yǎng)18 h，取出后于4 ℃冰箱保存.

1.2.3 培養(yǎng)方法

LB經(jīng)MRS培養(yǎng)基傳代活化至活力恢復(fù)后，以3%(V/V)接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，35 ℃靜置培養(yǎng)20 h后，測(cè)定增菌液的OD、pH及活菌數(shù).

1.2.4 Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法

根據(jù)有關(guān)文獻(xiàn)記載及本課題組前期對(duì)保加利亞乳桿菌的研究，采用Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)從氮源 (蛋白胨、酵母浸粉、牛肉膏、胰蛋白胨、酪蛋白水解物、大豆蛋白胨及新生牛血清)中篩選出對(duì)LB增殖比較明顯的三種.本文中所有PB 試驗(yàn)設(shè)計(jì)、數(shù)據(jù)分析及模型建立等皆由統(tǒng)計(jì)軟件SAS9.1 輔助完成.

1.3 測(cè)定方法

1.3.1 菌體形態(tài)觀察

采用甲苯胺藍(lán)染色法：涂片固定后，滴加0.2%的甲苯胺藍(lán)染色液，染色2 min后水洗，然后用1%的乙酸脫色1～2 s 后用水沖去，并用濾紙吸干多余水分后鏡檢.

1.3.2 OD值及pH值測(cè)定

吸光度(OD值)測(cè)定：用722S型可見分光光度計(jì)，在600 nm處進(jìn)行測(cè)定.同時(shí)，以空白培養(yǎng)基作為對(duì)照.

pH測(cè)定：采用pHS-3C型pH計(jì)測(cè)定發(fā)酵液的pH值.

1.3.3 活菌數(shù)測(cè)定

通過(guò)梯度稀釋法，在超凈工作臺(tái)中將增菌液適當(dāng)稀釋，選擇合適的稀釋度，取0.1 mL接種于經(jīng)滅菌后且冷卻至45～50 ℃左右的MRS 固體平板培養(yǎng)基上，于37 ℃培養(yǎng)48 h，選30～300個(gè)之間的菌落數(shù)進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)，每個(gè)稀釋度做三個(gè)求均值，結(jié)果以108cfu/mlL報(bào)告菌體濃度.

2 結(jié)果與分析

2.1 PB試驗(yàn)結(jié)果

實(shí)驗(yàn)采用次數(shù)N=12的試驗(yàn)設(shè)計(jì)，對(duì)蛋白胨(X1)、酵母粉(X2)、牛肉膏(X3)、胰蛋白胨(X4)、酪蛋白水解物(X6)、大豆蛋白胨(X7)、新生牛血清(X8)等8個(gè)因素進(jìn)行考察，其中(X5)為虛擬因素.分別對(duì)應(yīng)于表中的8列，效應(yīng)值為活菌數(shù)(Y).每個(gè)因素取2個(gè)水平，對(duì)每個(gè)因子取高低2水平進(jìn)行分析，低水平為原始培養(yǎng)條件，高水平約取低水平的2倍，培養(yǎng) 48 h 后進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，試驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果見表1和表2.從表2可以看出，當(dāng)OD值較高，達(dá)1.195時(shí)，活菌數(shù)也比較高，達(dá)到44.4×108cfu/mL.

表1 實(shí)驗(yàn)因素的編碼水平表

表2 Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

2.2 PB試驗(yàn)結(jié)果分析

在試驗(yàn)設(shè)計(jì)時(shí)，8個(gè)因素中包含有1個(gè)空白項(xiàng)，其作用是減少試驗(yàn)誤差.利用統(tǒng)計(jì)軟件SAS9.1分析試驗(yàn)結(jié)果，各氮源對(duì)LB的促進(jìn)程度由p值確定，選擇p值較小的因素為重要因素.試驗(yàn)結(jié)果分析，得各因素的p值見表3.

表3 Plackett-Burman設(shè)計(jì)試驗(yàn)結(jié)果方差分析

圖1 各因子95%的置信區(qū)間圖

方差分析的p值檢驗(yàn)回歸系數(shù)的顯著性，p值越小越顯著.由表3的分析結(jié)果可以看出， LB生長(zhǎng)影響順序：新生牛血清(X8)>酵母粉(X2)>酪蛋白水解物(X6)>蛋白胨(X1)>胰蛋白胨(X5)>大豆蛋白胨(X7)>牛肉膏(X3).由此可知，新生牛血清(X8)是影響LB生長(zhǎng)的顯著因子，酵母粉(X2)和酪蛋白水解物(X6)是影響LB的重要因子.其余因子影響不顯著，虛擬因素對(duì)結(jié)果影響也不大，表明該結(jié)果可信.

圖1也說(shuō)明X8、X2、X6 對(duì)LB生長(zhǎng)影響較大.并且，X8和X2對(duì)響應(yīng)值Y(活菌數(shù))呈負(fù)效應(yīng)關(guān)系，X6對(duì)響應(yīng)值Y呈正效應(yīng)關(guān)系.即響應(yīng)值Y隨X8和X2濃度的增大而減小，隨X6濃度的增大而增大.

3 結(jié)論

采用Plackett-Burman(PB)設(shè)計(jì)從眾多考察因素中快速有效地篩選出最為重要的幾個(gè)因素.本研究應(yīng)用該方法快速篩選了對(duì)影響保加利亞乳桿菌增殖培養(yǎng)的氮源，既省時(shí)也可同時(shí)比較分析各因素之間的交互作用，保證了實(shí)驗(yàn)的精確性.

由PB實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果可知，在7種氮源中，新生牛血清、酵母粉、酪蛋白水解物等3個(gè)因素對(duì)保加利亞乳桿菌的增殖比較明顯，因此可選擇這三種物質(zhì)作為保加利亞乳桿菌的增殖因子.

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